鸦胆子油和含鸦胆子油的药物组合物及制备方法

摘要

本发明涉及一种含鸦胆子油及其药物组合物，以及相应的制备方法，其中本发明的鸦胆子油是从鸦胆子脂肪油中除去高级酯，或进一步除去植物甾醇、除去毒性成分和杂质来制备的，物质基础明确可控、临床用药安全有效。本发明还涉及以上述鸦胆子油为主要成分、安全有效的脂肪油乳注射剂及其制备方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种鸦胆子油、含该鸦胆子油的药物组合物，以及制备方法，所述的鸦胆子油中高级酯的含量控制在1.5％以下。

背景技术

鸦胆子为苦木科鸦胆子属植物鸦胆子Brucea javanica(L.)Merr的干燥成熟果实。秋季果实成熟时采收，除去杂质，晒干。鸦胆子始载于清代赵学敏所著的《本草纲目拾遗》。中华人民共和国药典中收载的功效为清热解毒，截疟，止痢，腐蚀赘疣。用于痢疾，疟疾；外治赘疣，鸡眼。

鸦胆子含水溶性成份及植物油两部分，其毒性成分存在于水溶性苦味成分中；而油溶性成分，即鸦胆子油无毒性且治疗效果较好，目前被广泛的应用于临床中，其中主要含有三油酸甘油酯、油酸、亚油酸等成分，此外亚麻酸、硬脂酸、棕榈酸、豆蔻酸、廿碳烯酸、山萮酸、花生烯酸也是鸦胆子油中常见的成分。一般而言提取鸦胆子有效成分的方法是本领域比较常规的提取中草药有效成分的操作方法，目前比较普遍的鸦胆子油(或称鸦胆子总脂肪油)为石油醚提取物，也可以经过简单的精制(例如脱色处理、水洗处理、白土除杂质处理)，提取物用于制备药物制剂，比较普遍使用的制剂是鸦胆子油乳注射液。

发明内容

虽然鸦胆子油的药物已被广泛应用，但是鸦胆子油乳注射液稳定性略差，放置过程中出现颜色变深、破乳分层等现象，临床上会引起的不良反应为刺激血管、恶心呕吐、心律增快、发热、呼吸困难、下肢疼痛、过敏等问题。因此，改善制剂的稳定性和安全性，提供一种稳定性好、使用安全的鸦胆子油及其制剂是十分有意义的。

本发明的目的正是提供一种改善现有技术下的鸦胆子油稳定性和安全性的方法，相对于已有的鸦胆子油或制剂，提供一种减少毒性成分或不良成分，临床用药安全有效的含鸦胆子油的药物组合物。

通过大量研究，令人惊奇的发现，虽然鸦胆子油中成分很复杂，但当除去或降低鸦胆子中的个别成分后，鸦胆子油的整体品质大大提高，稳定性有了显著改善，明显提高了药物在使用和保存过程中的品质，提高了药物的使用安全性。

在研究中发现，从鸦胆子中提取的有效成分鸦胆子油中普遍含有一定量的高级酯，通常含量在3％左右，随着药材的不同来源其含量可能还会更高。经研究发现鸦胆子油中的高级酯就是造成产品不稳定的关键性因素。其中被分离出的高级酯的碳原子数总数基本高于20，例如20个碳原子以上的醇或酸形成的酯或总数高于20个碳原子的酯，主要成分是碳原子数高于35，特别是40～46个碳原子的酯。这些成分的析出温度基本在-10℃～10℃之间，主要在0℃～4℃之间。这些高级酯主要是高级一元脂肪酸的高级一元酯，此外还混有微量的游离高级一元脂肪酸、游离高级一元醇和少量高碳烃类。

本发明的核心在于通过实验研究，确定了鸦胆子油中高级酯对鸦胆子油的不利影响，为了改善药物的性能，本领域技术人员可以根据实际需要降低鸦胆子油中的高级酯含量。如果低于一定的含量时，即使仍含有微量的高级酯对鸦胆子油的稳定性和安全性也没有明显影响，当然如果完全除去这些高级酯是理想的，但这对后续的处理工艺有很高的要求，因此本领域技术人员可以根据实际工艺的需要控制高级酯的含量。

针对上述发现，本发明的第一个目的是提供一种鸦胆子油，所述鸦胆子油的高级酯含量低于1.5％。发现高级酯对鸦胆子油或含鸦胆子油的药物的不利影响是本发明的一个核心问题。

本发明的第二个目的是提供一种制备上述含鸦胆子油的方法。如何在保证鸦胆子提取物有效性的前提下，去除其中的高级酯、毒性成分和杂质，是本发明要解决的关键性问题。

本发明的第三个目的是提供一种无毒性、临床使用安全有效的鸦胆子油组合物，特别是油乳注射液，以及组合物的制备方法。

本发明是以如下技术方案实现的：

本发明提供了一种鸦胆子油，其中高级酯的含量在1.5％以下，优选含量在1％以下，更优选在0.5％以下。其中所述高级酯是碳原子数高于20，优选高于35的酯，特别优选是40～46个碳原子的酯；或是析出温度在-10℃～10℃之间的酯，优选0℃～4℃之间的酯。

本发明的另一个核心是发现了植物甾醇对鸦胆子油的不利影响，通过进一步研究发现，鸦胆子油中含有微量的植物甾醇，主要包括谷甾醇、豆甾醇、麦角甾醇、菜籽甾醇和菜油甾醇等。经测定发现，如去除鸦胆子油中的植物甾醇时，会降低药物在使用时的刺激性，提高产品的稳定性和安全性。因此，本发明的鸦胆子油进一步控制其中的植物甾醇含量在1％以下，优选在0.5％以下。

本发明的主要产品为鸦胆子油(或也可称为鸦胆子总脂肪油)，是指鸦胆子药材经提取得到提取物，提取物经精制、纯化等步骤制成的以鸦胆子的脂肪油为主要成分的中药有效部位提取物。鸦胆子油提取物中脂肪油类成分占总成分的50％以上，通常在90％以上，比较纯的产品达到96％以上。通常鸦胆子油主要包括：三油酸甘油酯、油酸、亚油酸；一般也会含有亚麻酸、硬脂酸、棕榈酸、豆蔻酸、廿碳烯酸、山萮酸、花生烯酸。当然根据药材的不同还会含有其他一些成分。区别于以往的鸦胆子油的关键特征在于：既不是石油醚提取后的粗油，也不是仅进行脱色、水洗等处理的鸦胆子油，而是在这些鸦胆子油基础上进一步除去高级酯的脂肪油类成分为主体的有效部位。

为了得到上述产品，本发明还提供了制备方法，所述制备方法包括以下除高级酯步骤：鸦胆子油原料在低温放置，去除析出的高级酯，得到目的产物，优选低温冷却温度为-10℃～10℃，更优选0℃～4℃。

对于鸦胆子油来说，最好在除高级酯前，优选经过脱色、水洗、除杂质之后进行除甾醇的步骤。为了进一步降低药物的刺激性，本领域技术人员可以根据实际需要除去甾醇，一般除甾醇可通过水蒸汽蒸馏、加氢法和/或化学法中任意一种或两种以上的组合。通过不同方法的比较发现，鸦胆子油采用水蒸气蒸馏法是最佳选择。

制备本发明的产品可以直接购买鸦胆子油原料后，将原料进行上述步骤进行精制；本领域技术人员也可直接使用鸦胆子药材根据常规提取方法进行提取后，按本发明所提供的方法进行处理，去除高级酯，或同时去除高级酯和甾醇。

如从药材的提取开始制备本发明的鸦胆子油，可按以下步骤进行：

将鸦胆子药材破碎，用石油醚提取，提取液回收石油醚得鸦胆子粗油；

任选所述粗油经活性炭脱色、水洗或除杂质的步骤；

之后，除高级酯得到本发明的鸦胆子油。

优选按以下步骤进行：

1)破碎：将鸦胆子药材用粉碎机粉碎，备用；

2)石油醚提取：将已破碎的药材用石油醚在提取罐中浸泡、浸泡液放入蒸馏罐，蒸馏石油醚，石油醚冷凝，回到提取罐，浸泡药材，反复提取；

3)回收：将蒸馏罐中的石油醚提取液先加热回收，再减压蒸馏回收，至无馏出液时，石油醚回收完毕，蒸馏罐中余下的油状液体，即为鸦胆子粗油；

4)任选进行脱色处理：将鸦胆子粗油加热后，加入活性炭，吸附脱色，过滤即得；

5)任选进行水洗处理：取步骤3)或步骤4)的鸦胆子油预热50℃～100℃，缓慢加入热水，边加水边搅拌，加水完毕后，继续搅拌30～120分钟，静置4～20小时，弃去水层，油层减压蒸馏将水完全除尽，过滤；

6)任选进行除杂质处理：取步骤3)、步骤4)或步骤5)得到的鸦胆子油用活性白土加热吸附油中的叶绿素、溶解性纤维素杂质性物质，将事先在100℃活化3～24小时的白土加入油中，在80℃～150℃的温度下搅拌加热30～120分钟，趁热过滤，其中白土的用量为油量的3％～6％(重量百分比)；

7)任选进行除甾醇处理：取步骤3)、步骤4)、步骤5)或步骤6)的鸦胆子油置于水蒸气蒸馏装置中，在180℃～260℃下水蒸汽蒸馏2～6小时，分离出馏出物植物甾醇；

8)除高级酯：取步骤3)、步骤4)、步骤5)、步骤6)或步骤7))所得的鸦胆子油在低温放置，去除析出的高级酯。

本发明还提供了含有上述鸦胆子油的药物组合物，优选油乳注射液。

所述油乳注射液包括鸦胆子油、乳化剂、等张调节剂，以及任选的稳定剂和pH调节剂。优选在100ml鸦胆子油乳注射液中各组分按下列重量以任意比组成：鸦胆子油5～50ml、乳化剂0.1～50g、等张调节剂0.01～20g、稳定剂0～50g、pH调节剂0～10g。其中乳化剂可选自大豆磷脂、大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、泊洛沙姆、乙酸单甘油酯、聚山梨酯、聚氧乙烯蓖麻油，或两种以上物质的任意组合；等张调节剂可选自甘油、丙二醇、乙二醇、聚乙二醇、山梨醇、甘露醇、木糖醇，或两种以上物质的任意组合；稳定剂可选自维生素E、抗坏血酸、油酸、油酸钠、胆酸、脱氧胆酸、脱氧胆酸钠，或两种以上物质的任意组合；pH调节剂可选自指盐酸、氢氧化钠、磷酸及其盐类、碳酸及其盐类、乳酸及其聚合物、柠檬酸、醋酸，或两种以上物质的任意组合。

上述油乳注射液的制备方法是：将乳化剂加热分散后，再加入预热的本发明的鸦胆子油乳化；另取等张剂与注射用水混合，加热，加入至鸦胆子油与乳化剂的混合物中，继续乳化成初乳，用匀质机乳化，过滤。任选在制备过程加入稳定剂和/或pH调节剂。

具体步骤如下：

(1)将乳化剂放入高剪切乳化罐中，加入约5～20倍量的注射用水(40℃～90℃)剪切分散10～120分钟。

(2)将鸦胆子油加热至50℃～100℃。

(3)将等张剂与注射用水按1∶0.5～5的比例混合，搅拌均匀，加热至50℃～100℃。

(4)将预热80℃后的鸦胆子油缓慢加入到乳化剂溶液中剪切乳化10～120分钟。然后加入步骤(3)的溶液继续乳化10～120分钟制成初乳。

(5)向初乳中加入稳定剂、pH调节剂，调整pH值至4.0～6.0。逐渐加入70℃以上注射用水至全量，剪切乳化10～120分钟。

(6)将全量药液用匀质机乳化2～6次，压力控制在20.0～90.0MPa，得到均匀乳化液，经5μm孔径滤芯过滤。

(7)中间体检测合格，灌封、灭菌即得。

所述步骤(1)中加入注射用水的量为5～20倍，优选6～15倍；注射用水的温度为40～90℃，优选50℃；剪切乳化时间为10～120分钟，优选20分钟。

所述步骤(2)中鸦胆子油加热至50-100℃，优选80℃。

所述步骤(3)中等张剂与注射用水按1∶0.5～5的比例混合，优选1∶1的比例混合；加热至50～100℃，优选80℃。

所述步骤(4)中剪切乳化的时间为10～120分钟，优选20分钟；加入步骤(3)的溶液继续乳化时间为10～120分钟，优选30分钟。

所述步骤(5)中剪切乳化时间为10～120分钟，优选30分钟。

所述步骤(6)中用匀质机乳化2～6次，优选3次；压力控制在20.0～90.0MPa，优选40.0MPa。

本发明的有益效果是：

1、本发明中的鸦胆子油含有的水溶性成分、高级酯等油溶性杂质成份较低。特别通过本发明的低温分离法除去了高级酯，有益效果是避免了这类物质的存在带来的药物安全隐患，并且产品所包含单体成分均可以定性鉴别和定量测定，物质基础非常明确，符合中药现代化的国际要求，保证了临床用药的安全有效性。

2、采用本发明鸦胆子油制备的鸦胆子油乳注射液的安全性试验结果表明：鸦胆子油乳注射液对豚鼠无全身致敏作用、对家兔血液无溶血作用、家兔耳静脉给药结果证明对局部血管无刺激作用。

3、本发明制备的鸦胆子油乳注射液稳定性良好，三批样品长期室温留样的检测结果显示：均未出现破乳、分层现象，pH值、颗粒细度、总酸量、无菌、热原等检查均符合质量标准的规定，证明本发明制备的鸦胆子油乳注射液在有效期内质量稳定，可以保证临床的用药安全。

4、经研究发现鸦胆子油中的高级酯的存在会导致鸦胆子制剂稳定性下降、产品质量下降、容易变质，更严重的是给患者带来安全性隐患，去除了高级酯(或进一步去除甾醇后)，减少了有害的有机物，避免了乳滴静注人体后，带来的患者机体的变态反应，和减少了导致患者死亡的因素。

具体实施方式：

对比实施例1：制备未去除高级酯和甾醇的鸦胆子油(样品1)

按如下步骤制备：

(1)拣选：将检查合格的鸦胆子药材152kg，拣选鸦胆子中的杂物后，经粉碎机破碎，再次称重为150.1kg。

(2)石油醚提取：将破碎后的鸦胆子，装入袋内，扎紧袋口，放入提取罐中，关上罐盖，用真空抽入260kg石油醚，对鸦胆子进行浸泡48小时。将浸泡液放入蒸馏罐中，加热至65℃，蒸馏出的石油醚经冷凝进入提取罐中，若提取罐中的鸦胆子已暴露于石油醚溶剂之上，则补加一定量的石油醚，再浸泡30分钟。如此循环提取七次，补加石油醚的量为60kg，收集提取液量为293kg，将提取液放入蒸馏罐中。

(3)回收：将蒸馏罐中的石油醚提取液先常压加热回收，温度65℃。当馏出液量明显减少时，再减压蒸馏。减压蒸馏初、中阶段温度不能超过60℃，当无馏出液时，再逐渐升温到90℃减压蒸馏，至无馏出液时，石油醚回收完毕。蒸馏罐中余下的油状液体，为鸦胆子粗油，用不锈钢容器收集鸦胆子粗油，称重为31.7kg。

(4)脱色：取鸦胆子粗油加入0.45kg活性炭，加热至110℃，脱色吸附30分钟。将其降温至80℃，保温过滤，得鸦胆子油30.8kg。

(5)水洗：将脱色后的鸦胆子油预热80℃，缓慢加入80℃热水0.93kg，边加水边以60转/分的速度搅拌，加水完毕后，搅拌速度降至20转/分，搅拌30分钟。80℃保温静置4小时后继续静置4小时。弃去水层，油层减压蒸馏将水完全除尽，过滤，得鸦胆子油22.9kg。

(6)除杂质：取水洗后的鸦胆子油，加入事先在100℃活化5小时的白土0.68kg，在120℃的温度下搅拌加热30分钟，将其降温至80℃，保温过滤，得鸦胆子油22.1kg。

实施例1：制备去除高级酯的鸦胆子油(样品2)

a1.取对比实施例1所制备的鸦胆子油10kg，加热至90℃～110℃，保温3～5分钟，冷却至室温，边冷却边搅拌，静置2～6小时，备用。

b1.取少量鸦胆子油置于冷冻设备中，从室温以0.5℃/分钟的速度逐步降温，测定其出现明显混浊的温度为4℃。

c1.将步骤a1的鸦胆子油置于冷冻设备中，将其逐步冷却至2℃后，静置36小时，保温过滤，得鸦胆子油9.56kg。

测定步骤c1中过滤得到的酯类，主要是40～46个碳原子的酯，还有一定量的碳原子数在40～35之间的酯，少量碳原子数介于20～35的酯。

实施例2：制备去除高级酯和甾醇的鸦胆子油(样品3)

按如下步骤制备：

a2.取对比实施例1步骤(6)中的鸦胆子油5kg置于水蒸气蒸馏装置中，加热至100℃后开始向其中通入水蒸汽，继续加热至180℃～260℃，在此温度下水蒸汽蒸馏2～6小时。

b2.采用冷凝管冷凝的方法收集馏份，得到植物甾醇馏出物；鸦胆子油降温至50℃～80℃，过滤，得续滤液4.73kg，备用。

c2.取续滤液按照实施例1的操作步骤a1～c1制备，得鸦胆子油4.51kg。

实施例3：含量测定

1.按照梯度溶解度法测定高级酯的含量

a、量取鸦胆子油50g左右溶于200ml的丙酮溶液中。将该样品溶液存放在冰箱中，温度控制在0℃～5℃，放置过夜。

b、在过滤坩埚中铺一层石棉545纤维，然后用丙酮溶剂洗涤坩埚和石棉纤维，用氮气将过滤坩埚和石棉纤维的表面吹干，放到105℃烘箱中干燥至恒重。最后把过滤坩埚和纤维一同取出，放置于干燥器中，备用。

c、用已恒重的过滤坩埚过滤冷样品溶液，然后用0℃～5℃的冷丙酮溶剂洗涤。每次用量15ml，洗涤高级酯次数三次以上。再把有高级一元酸的高级一元酯的过滤坩埚存放在40℃～60℃恒温环境下，过夜，干燥。最后取出放在干燥器中冷却，称重，按下列公式计算：

高级酯(％)＝高级酯重量×100/油样重量

分别取对比实施例1的样品1、实施例1的样品2和实施例2的样品3，测定高级酯的含量，结果见表1：

表1不同样品的高级酯含量

  批号  样品1  样品2  样品3  高级酯含量  2.85％  0.03％  0.03％

2.按照分光光度法测定植物甾醇的含量：

准确称取甾醇制品，以乙酸酐为溶剂在60℃～70℃溶解，配制成系列浓度的标准溶液，浓度为0.01、0.03、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25mg/ml。分别向各溶液中加入0.05ml浓硫酸，颜色由无色逐步变为绿色，放置15分钟。照分光光度法(中国药典2005年版一部附录V B)试验，在650nm波长处测定吸收度，吸收度为纵坐标，以浓度为横坐标，绘制标准曲线。取鸦胆子油，依法测定吸收度，从标准曲线上读出植物甾醇的重量，计算，即得。

分别取对比实施例1的样品1、实施例1的样品2和实施例2的样品3，测定植物甾醇的含量，结果见表2：

表2不同样品的甾醇含量

  批号  样品1  样品2  样品3  植物甾醇含量  2.12％  2.10％  0.32％

实施例4：制备去除高级酯的鸦胆子油

另取一批鸦胆子进行提取，按对比实施例1的步骤(1)至(6)的工艺方法进行以下步骤(1)至(6)，在此基础上再进行除高级酯的步骤(7)至(9)，具体操作方式如下：

(1)拣选：将检查合格的鸦胆子药材100kg，拣选后破碎，称重为98.9kg。

(2)石油醚提取：用170kg石油醚浸泡药材48小时，进行提取，补加石油醚的量为40kg，收集提取液量为204kg。

(3)回收：通过蒸馏回收，收集鸦胆子粗油20.9kg。

(4)脱色：取鸦胆子粗油加入0.3kg活性炭，脱色吸附，得鸦胆子油20.4kg。

(5)水洗：将脱色后的鸦胆子油预热80℃，加入80℃热水0.6kg并搅拌，加水完毕后，搅拌速度降至20转/分，搅拌30分钟。80℃保温静置4小时后，继续静置4小时。弃去水层，油层减压蒸馏将水完全除尽，过滤，得鸦胆子油16.1kg。

(6)除杂质：取水洗后的鸦胆子油，加入白土0.45kg，在120℃的温度下搅拌加热30分钟，将其降温至80℃，保温过滤，得鸦胆子油15.1kg。

(7)取除杂质的鸦胆子油，加热至90℃～110℃，保温3～5分钟，冷却至室温，边冷却边搅拌，静置2～6小时，备用。

(8)测定开始混浊的温度为3.5℃。

(9)将步骤(7)的鸦胆子油置于冷冻设备中，将其逐步冷却至1℃后，静置，过滤，得鸦胆子油14.58kg。经测定，其中高级酯的含量为1.41％。

实施例5：冷冻试验

分别取对比实施例1的样品1、实施例1的样品2和实施例2的样品3，在0℃储藏，观察现象，结果见表3。

表3储藏稳定性比较

  时间(小时)  样品1  样品2  样品3  0  澄清透明  澄清透明  澄清透明  4  出现少量白色絮状物  澄清透明  澄清透明  6  白色絮状物增加  澄清透明  澄清透明  8  白色絮状物增加  澄清透明  澄清透明  12  白色絮状物增加  澄清透明  澄清透明  24  出现大量白色絮状物  澄清透明  澄清透明

实施例6-8：鸦胆子油乳注射液的制备

取样品2制备油乳注射液样品，按如下步骤制备：

(1)将精制豆磷脂0.5kg放入高剪切乳化罐中，加入一定量的注射用水(50℃)剪切乳化20分钟。

(2)将鸦胆子油加入至油相罐中，开启搅拌，加热至80℃，备用。

(3)将甘油1.05kg加入至水相罐中，按1∶1的比例加入注射用水，搅拌均匀，加热至80℃，备用。

(4)将预热80℃后的鸦胆子油缓慢加入乳化罐中，剪切乳化20分钟。然后加入步骤(3)的溶液继续乳化30分钟制成初乳。

(5)可以向初乳中加入稳定剂、pH调节剂，调整pH值至4.0～6.0。逐渐加入70℃以上注射用水至全量，剪切乳化30分钟。

(6)用高压匀质机乳化数次，严格控制压力，得到均匀乳化液，经5μm孔径滤芯过滤。

(7)中间体检测合格，灌封、灭菌，即得。

试验数据如表4所示：

表4油乳注射液配方

  试验条件  实施例6  实施例7  实施例8  鸦胆子油用量  3kg  3kg  3kg  乳化剂加水量  30kg  60kg  21kg  稳定剂  -  -  15g维生素E  pH调节剂  -  -  10％氢氧化钠溶液适量  乳化次数  3  2  6  乳化压力  40MPa  80MPa  20MPa

实施例9：鸦胆子油乳注射液的安全性试验。

1.全身主动过敏试验

分组：受试组I：采用样品1制备的鸦胆子油乳注射液(注：采用样品1按照实施例5的配比和制备方式制备鸦胆子油乳注射液)

受试组II：实施例5的鸦胆子油乳注射液

阳性对照液：2％新鲜鸡蛋清

阴性对照液：0.9％氯化钠注射液

实验动物：豚鼠，体重300～400g，雌雄兼用，数量24只，由大连医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(辽)2008-0002，实验动物使用许可证号：SYXK(辽)2008-0008，发证机关：辽宁省科学技术厅试验方法与结果：

取上述健康豚鼠，对其外观、体重等进行检疫，检疫期为3天，检疫合格后，按体重随机分为4组，每组6只，各组腹腔注射对应药物，给药体积为0.5ml/只，隔日致敏1次，连续5次，致敏期间及观察期间每日按表1观察并记录各组动物的反应症状。末次致敏后第14天各组分别静脉注射对应药物，1ml/只，按表1观察记录给药后30分钟内动物有无竖毛、抽搐、呼吸困难、休克和死亡等过敏反应症状、症状出现的时间及消失时间，结果见表3。观察结束后根据表2全身性致敏性评价标准判断过敏反应的发生程度，计算过敏反应发生率。根据过敏反应率和发生程度对药物进行综合判断。

表5过敏反应症状

  0  正常  7   呼吸急促  14  步态不稳  1  躁动  8   排尿  15  跳跃  2  竖毛  9   排粪  16  哮喘  3  颤抖  10  流泪  17  痉挛  4  骚鼻  11  呼吸困难  18  旋转  5  喷嚏  12  哮鸣音  19  潮式呼吸  6  咳嗽  13  紫癜  20  死亡

表6全身致敏性评价标准

  0 -  过敏反应阴性  1-4 +  过敏反应弱阳性  1-10  ++  过敏反应阳性  1-19  +++  过敏反应强阳性  20  ++++  过敏反应极强阳性

表7过敏试验结果

结论：采用样品1制备的鸦胆子油乳注射液和实施例5的鸦胆子油乳注射液原液豚鼠全身主动过敏反应试验均为过敏反应阴性。

2.溶血与凝聚试验

受试药：

受试组I：采用样品1制备的鸦胆子油乳注射液3支加0.9％氯化钠注射液250ml。

受试组II：实施例5的鸦胆子油乳注射液3支加0.9％氯化钠注射液250ml。

实验动物：家兔，日本大耳白，体重2.4g，由沈阳药科大学实验动物中心提供。实验动物生产许可证号：SCXK(辽)2009-0002；实验动物使用许可证号：SYXK(辽)2008-0008；发证机关：辽宁省科学技术厅。

试验方法与结果：

取检疫合格的健康家兔1只，心脏取血25ml，玻璃珠震摇出去纤维蛋白原，使成脱纤血。用0.9％氯化钠注射液洗涤、离心(1000rpm，15min)3次至上清液不显红色，沉淀的红细胞按体积比用0.9％氯化钠注射液配成2.0％红细胞混悬液。

取洁净试管12支，按表8所示，各管分别加入不同体积的药液和相同体积的红细胞混悬液，第11号管为阴性对照管，12号管为阳性对照管。各管轻轻摇匀后，立即置于37±0.5℃的水浴中进行温孵4小时，观察0.25小时至3.0小时内各管是否有溶血及红细胞凝聚现象，按表9标准判断，结果见表10。

表8体外溶血试验加样表

表9体外溶血实验结果判断标准

  程度  现象  标识  完全溶血  溶液呈澄明红色，管底无细胞残留  +  部分溶血  溶液呈澄明红色或棕色，管底有少量红细胞残留  ±  无溶血  红细胞全部下沉，上层液体无色澄明  -  凝聚  虽不溶血，但出现红细胞凝聚，震摇后不能分散

表10体外溶血试验结果

结果表明，采用样品1制备的鸦胆子油乳注射液0.1～0.3ml浓度均无溶血现象；0.4～0.5ml浓度出现溶血的时间均为2h；实施例5的鸦胆子油乳注射液0.1～0.5ml浓度均无溶血现象；阴性对照管上层溶液呈无色透明，红色细胞全部下沉，未见溶血现象；阳性对照管溶液呈澄明红色，管底无细胞残留，完全溶血。

结论：采用样品1制备的鸦胆子油乳注射液在3小时内有明显的溶血现象，无明显凝聚现象。由于出现溶血的时间和供试品在血液中的浓度相关，因此，在临床应用时应尽快滴注完成，长期使用应检测血液学指标。实施例5的鸦胆子油乳注射液按临床滴注给药浓度进行体外溶血试验，在3小时内无溶血和凝聚现象。

3.血管刺激性试验

受试药：

受试组I：采用样品1制备的鸦胆子油乳注射液3支加0.9％氯化钠注射液250ml。

受试组II：实施例5的鸦胆子油乳注射液3支加0.9％氯化钠注射液250ml。

受试组III：采用样品3制备的鸦胆子油乳注射液(注：采用样品3按照实施例5的配比和制备方式制备鸦胆子油乳注射液)3支加0.9％氯化钠注射液250ml。

实验动物：家兔，日本大耳白，体重2.1～2.3g，由沈阳药科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(辽)2009-0002，实验动物使用许可证号：SYXK(辽)2008-0008，发证机关：辽宁省科学技术厅。

试验方法与结果：

取健康家兔，雌雄并用，对动物的外观、体重等进行检疫，检疫期为3天。取检疫合格后动物4只，采用家兔同体左右侧自身对照法，左侧耳缘静脉滴注受试药，右侧滴注等体积的0.9％氯化钠注射液，给药容积为15ml/kg，控制给药速度为5ml/min，每日1次，连续3天。给药前、给药期间、末次给药后48h、72h、96h肉眼观察并记录血管及周围组织有无异常改变，末次给药96h后处死动物，取两侧耳缘静脉血管及周围组织，以10％的甲醛固定，切片，HE染色，光镜下(10×10)观察血管内皮有无受损、破裂及周围组织有无水肿、出血及炎性细胞浸润等病理变化并按评分标准(表11、表12)判断血管刺激性反应程度。结果见表13-14。

表11血管刺激性肉眼观察评分标准

结果判断标准：≤0.5无刺激性，≤2.5轻微刺激性，≤4.5中度刺激性，≤6.0重度刺激性

表12血管刺激性光镜观察评分标准

结果判断标准：≤0.5无刺激性，≤2.5轻微刺激性，≤4.5中度刺激性，≤6.0重度刺激性

表13血管刺激性肉眼观察评分

  组别  动物数(只)  48h  72h  96h  0.9％氯化钠注射液  4  0  0  0  受试组I  4  0  0  0  0.9％氯化钠注射液  4  0  0  0  受试组II  4  0  0  0  0.9％氯化钠注射液  4  0  0  0  受试组II  4  0  0  0

表14血管刺激性光镜观察评分

  组别  动物数(只)  光镜(评分)  0.9％氯化钠注射液  4  0  受试组I  4  0.75±0.5  0.9％氯化钠注射液  4  0  受试组II  4  0.25±0.5  0.9％氯化钠注射液  4  0

  组别  动物数(只)  光镜(评分)  受试组III  4  0

结论：采用样品1制备的鸦胆子油乳注射液临床给药浓度，按15ml/kg静脉滴注给药，每日1次，连续3天，对家兔耳静脉血管有轻微刺激性；实施例5的鸦胆子油乳注射液、采用样品3制备的鸦胆子油乳注射液对家兔耳静脉血管均未见明显刺激性，其中样品3的效果最佳。

实施例10：鸦胆子油乳注射液的稳定性试验

分别将采用样品1制备的鸦胆子油乳注射液和实施例5的鸦胆子油乳注射液进行稳定性试验比较，包括加速试验和长期室温留样试验。检验方法按鸦胆子油乳注射液部颁标准WS₃-B-2793-97。加速试验是将样品在温度40℃±2℃，湿度75％±5％的条件下放置6个月，分别于第1、2、3、6个月末取样检测，与0月的检测结果做比较；室温留样试验是将样品在温度25℃±2℃、湿度60％±10％的条件下放置，分别于第3、6、9、12个月取样检测，与0月的检测结果做比较，结果见表15-16。

表15加速试验结果

表16长期室温留样试验结果