重组、单链、三价三特异性或双特异性抗体衍生物

摘要

本发明涉及编码多肽的核酸分子，其中所述多肽包括：(a)第一免疫球蛋白结构域，其包括与VH结构域连接的VL结构域，其中所述免疫球蛋白结构域特异性结合肿瘤细胞上表达的抗原；(b)第二免疫球蛋白结构域，其包括与VH结构域连接的VL结构域，其中所述免疫球蛋白结构域特异性结合肿瘤细胞上表达的抗原；以及(c)第三免疫球蛋白结构域，其包括与VH结构域连接的VL结构域，其中所述免疫球蛋白结构域特异性结合效应细胞抗原，其中所述效应细胞选自NK细胞、T细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞；其中肿瘤细胞上表达的并被(a)或(b)的所述免疫球蛋白结构域结合的至少一种所述抗原是在肿瘤干细胞上和/或肿瘤前体或祖细胞上表达的抗原；以及其中结合肿瘤细胞上表达的抗原的免疫球蛋白结构域与结合效应细胞抗原的免疫球蛋白结构域的比例是至少2∶1。此外，本发明涉及包括本发明核酸分子的载体，用本发明载体转化的非人宿主，产生多肽的方法，该方法包括在合适的条件下培养本发明的宿主并分离产生的多肽，以及由本发明的核酸分子编码的或由本发明的方法产生的多肽。另外，本发明涉及用于治疗肿瘤的诊断和药学组合物以及方法。

说明书

本发明涉及编码多肽的核酸分子，其中所述多肽包括：(a)第一免疫球蛋白结构域，其包括与VH结构域连接的VL结构域，其中所述免疫球蛋白结构域特异性结合肿瘤细胞上表达的抗原；(b)第二免疫球蛋白结构域，其包括与VH结构域连接的VL结构域，其中所述免疫球蛋白结构域特异性结合肿瘤细胞上表达的抗原；以及(c)第三免疫球蛋白结构域，其包括与VH结构域连接的VL结构域，其中所述免疫球蛋白结构域特异性结合效应细胞抗原，其中所述效应细胞选自NK细胞、T细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞；其中肿瘤细胞上表达的并被(a)或(b)所述的免疫球蛋白结构域结合的至少一种所述抗原是肿瘤干细胞上和/或肿瘤前体或祖细胞上表达的抗原；以及其中结合肿瘤细胞上表达的抗原的免疫球蛋白结构域与结合效应细胞抗原的免疫球蛋白结构域的比例是至少2∶1。此外，本发明涉及包括本发明核酸分子的载体，用本发明载体转化的非人宿主，产生多肽的方法，其包括在合适的条件下培养本发明的宿主并分离产生的多肽，以及由本发明的核酸分子编码的或由本发明的方法产生的多肽。另外，本发明涉及用于治疗肿瘤的诊断和药学组合物以及方法。

在本说明书中引用大量文献。这些文献的公开内容包括制造商手册在此通过引用全部并入。

白血病是血癌或骨髓癌，其特征在于血细胞通常是白细胞的异常增殖。白血病在临床和病理上分为急性和慢性形式。急性白血病的特征在于未成熟血细胞的快速增殖。这种大量的未成熟细胞使骨髓不能产生健康的血细胞。白血病急性形式可在儿童和青少年中发生。急性白血病需要即刻治疗，原因在于恶性细胞的快速发展和积聚，然后溢出至血流并扩散至机体的其他器官。慢性白血病的区别在于相对成熟但仍是异常的血细胞的过度建立。通常经历几个月至几年的时间来发展，细胞以大大高于正常细胞的速率产生，导致血液中许多异常的白血细胞。慢性白血病主要发生在老年人中，但理论上可发生在任何年龄组。但是急性白血病必须即刻治疗，有时，慢性形式在治疗前监测一段时间以确保治疗的最大效力。进一步，根据血液中最常见的异常细胞类型(淋巴细胞对骨髓细胞)将疾病分为四种主要类型的白血病：急性淋巴细胞白血病(也称为急性淋巴母细胞白血病，或ALL)、慢性淋巴白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(也称为急性骨髓白血病，或AML)和慢性骨髓性白血病(CML)。

对于源于造血系统的癌症疾病，通常应用的治疗包括放射和/或化疗。另外，在某些情况下，骨髓移植的另外可能性被认为是合适的。但是，这些疗法对患者具有或多或少的毒性，在大多数情况下，它们不引起疾病完全治愈。最近，基于单克隆抗体的免疫疗法已进入临床阶段并已证实有效。显著的实例是用于某些非霍奇金B细胞淋巴瘤(NHL)治疗的利妥昔单抗(抗CD20)以及某些慢性淋巴白血病治疗中的Campath 1H(抗CD52)(Reff等，1994；Onrust等，1999；Riechmann等，1988；Hale等，1988)。该方法也已证实在疾病中获得成功，例如不同种类的骨髓组织增殖(haemoblastos)以及实体肿瘤。其他抗体处于晚期临床状态，例如用于NHLs的Epratuzumab(抗CD22)(Carnahan等，2003；Leonard等，2003)。

对那些抗体的替代是连接到放射性同位素的抗体。这些抗体的实例是BEXXAR(抗CD20-I131)和ZEVALIN(抗CD20-Y90)(Kaminski等，1993；Davis等，2007；Cheung等；2006)。替代放射性同位素，可使用其他物质，例如毒素，例如用于免疫毒素Mylotarg(与毒素加里刹毒素偶联的抗CD33；Hamann等，2002；Sievers等，1999)。

在癌症疾病的治疗中，抗体的一般优势是它们对癌性细胞具有比对健康细胞更高的特异性。具体地，在血液疾病的情况下，肿瘤细胞易于获得，原因在于它们存在于血液、骨髓或不太致密的组织中。

上述使用的抗体的主要缺点是它们的大小，这限制它们向某些组织的进入性或它们穿透肿瘤的能力。另外，抗体与非细胞毒性细胞(例如B细胞或血小板)的Fc受体或与抑制性受体例如FcγRIIIb之间的相互作用损害它们的治疗效果(Peipp和Valerius，2002；Clynes等，2000)。另外，双等位基因多态性可降低对抗体疗法的敏感性，例如利妥昔单抗所显示的(Cartron等，2002；Weng和Levy，2003)。

尽管补体依赖的细胞毒性的临床相关性仍不清楚(Weng和Levy 2001)，但是通过结合Fc受体(FcR)，免疫效应细胞的募集和ADCC的诱导在体外和体内发挥重要作用，如利妥昔单抗所证明的(Cartron等2002，Weng和Levy 2003)。因此，提高ADCC活性可成为一种有前景的方法以改进基于Ab的治疗方法。因此，已使用几种不同方法来增强不同单克隆抗体(mAb)的效应细胞介导的功能，例如，通过糖工程或通过氨基酸置换的引入对Fc部分与FcR结合的改进(Barbin等2006，Lazar等2006)。

通过双特异性抗体(bsAb)的产生——其在一些情况下产生比亲本mAb甚至更强的体外细胞毒性——获得效应子功能的另外显著的改进(Weiner，等1993)，并能够克服常规抗体的一些限制(Peipp和Valerius，2002)。两个结合位点——一个为肿瘤细胞上表达的抗原结合位点以及另一个为免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞或粒细胞)表面上触发分子结合位点——引起这些效应细胞对肿瘤细胞的有效募集以及经由抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或吞噬作用对肿瘤细胞的特异性杀伤。通常地，通过抗体结合至细胞毒性触发分子，例如CD2、CD28或CD3(在T细胞上表达)、CD16(FcγRIIIa，在NK细胞上表达)、CD64(FcγRI；在激活的嗜中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞上表达)或CD89(FcαRI，在嗜中性粒细胞上表达；Peipp和Valerius，2002)，诱导肿瘤细胞裂解。已知干细胞移植后，NK细胞是最先再生的细胞之一，这使得它们特别合适于消除微小残留疾病(MRD)的细胞(Eyrich等，2001；Lang等，2003)。

与以前所使用的技术相比，重组抗体的可利用性大大促进双特异性抗体的产生和纯化。通常已知的抗体形式是双抗体、微型抗体(minibody)、单链双抗体或串联双特异性单链可变片段(bsscFv)(Peipp和Valerius，2002)，后面两种仅由一个分子组成。

治疗抗体衍生物选择结合的抗原(一种或更多种)对治疗至关重要。以前已描述在B淋巴瘤形成的治疗中的结合B细胞上表达的CD19的抗体(Grossbard等，1992)。在它们发展的所有时期，CD19在B细胞上表达，除了成熟血浆细胞。迄今，该抗原未在B淋巴区室以外的造血干细胞或其他细胞上发现。迄今使用的形式包括全抗体、免疫偶联物、免疫脂质体、免疫毒素和双特异性形式。用鼠CD19IgG2A抗体治疗六名患者在一名患者中引起部分缓解(Hekmann等，1991)。乙二醇工程化的嵌合CD19抗体能够经由NK细胞介导ADCC(Barbin等，2006)，进一步的嵌合CD19抗体在SCID-小鼠模型中减缓CD19阳性肿瘤的生长(Pietersz等，1995)。开发了抗CD19抗体衍生物——其偶联至酪氨酸激酶抑制剂染料木黄酮以及偶联至放射性核素、细胞毒素或外毒素，均显示癌症状况的改善(Messinger等，1998；Vervoordeldonk等，1994；Vallera等，2004；Schwemmlein等，2007)。已知的双特异性抗体是例如那些针对CD19和CD64的，其使用干扰素刺激的巨噬细胞作为效应细胞(Ely等，1996)。针对CD19和CD3(Haagen等，1992；Weiner和de Gast，1995；Kiprianov等，1998；Loffler等，2000)以及CD19和CD16(Kiprianov等，2002)的抗体衍生物分别活化细胞毒性T细胞或NK细胞。虽然细胞培养数据表明对[CD19xCD3]双特异性抗体衍生物的显著裂解活性，但是由抗体介导的CD3的交联产生非特异的T细胞活化，导致对与抗体结合的细胞的毒性(Segal等，1999)。[CD19xCD16]抗体衍生物已经作为单链Fv分子、双链双抗体和作为四价双抗体产生，并已证实在人淋巴瘤的小鼠模型中有效(EP 1314741；AffimedTherapeutics AG)。CD16是IgG的低亲和性受体(FcγRIII)，其在NK细胞和巨噬细胞的表面上作为跨膜同种型组成型地表达(CD16a)，以及在嗜中性粒细胞的表面上作为糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚定分子表达(CD16b)(Ravetch和Kinet，1991；van deWinkel和Anderson，1991)。对于细胞内信号传导，CD16a需要与含有免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)的FcRγ链结合，所述基序触发下游信号传导。对经由CD16重新定向NK细胞的的常规偶联的双特异性抗体研究表明在培养的恶性细胞和动物模型中有效的细胞裂解(Garcia de Palazzo等，1992；Hombach等，1993；Kipriyanov等，2002)。因此，启动对CD16定向的双特异性抗体的临床研究(Weiner等，1995；Hartmann等，1997)。但是，杂交-杂交瘤抗体的免疫原性以及由Fc结构域的存在导致的不期望的副作用以及产生足够量的临床级材料的困难限制了这些临床研究。另一个双特异性抗[CD19xCD16]抗体利用在一个多肽链中组合的两个单链Fv(Bruenke等，2005)。

抗体的效力取决于它们在人血清中的稳定性，它们在生物中的定位以及它们的亲和性。已发展了几种方法来影响这些性质。例如，scFv抗体两个可变结构域之间的二硫桥可大大改进血清稳定性，但常常导致重组蛋白质的不可溶表达或导致亲和性的降低。可用于药物动力学性质改进的进一步测量是将抗体衍生物偶联至聚乙二醇(PEG)——结合人血清白蛋白(HSA)的成分，偶联至HAS自身或偶联至向抗体衍生物提供N-糖基化位点的肽(Kubetzko等，2006；Huhalov & Chester，2004；Muller等，2007；Schoonjans等，2000；Stork等，2008)。

最后，通过发展多价抗体衍生物，可提高与靶向肿瘤细胞的亲和性。公开的形式包括微型抗体、三链抗体(tribodies)、四价二链抗体或三价三链抗体，其具备一个或更多特异性。它们减少的尺寸使得侵入肿瘤并在生物体中保留较长时间，这是由于它们分子量仍处于肾的排阻屏障之上。包括两个以上抗原结合位点的分子的一个剩余缺点是它们仍由至少两个多肽链组成，原因在于迄今没有描述可获得具有两个以上特异性的单链分子，其可作为治疗剂应用。如果抗体衍生物由一个以上多肽链组成，产生和纯化该衍生物以获得同质混合物将更加困难。

最后，具有肿瘤细胞和效应细胞的相同数目特异结合位点的抗体衍生物相似亲和性通常引起效应细胞的活化，而不在之前被募集至肿瘤或其他细胞，其引起效应细胞降低的细胞毒性潜能。

本发明提供新的和有利的抗体衍生物，其合适用作为对肿瘤细胞比对效应细胞具有更高亲和性的血液疾病的治疗剂，从而改变对肿瘤细胞的亲和力、更稳定并显示体内延长的血浆保留时间。

因此，本发明涉及编码多肽的核酸分子，其中所述多肽包括：(a)第一免疫球蛋白结构域，其包括与VH结构域连接的VL结构域，其中所述免疫球蛋白结构域特异性结合肿瘤细胞上表达的抗原；(b)第二免疫球蛋白结构域，其包括与VH结构域连接的VL结构域，其中所述免疫球蛋白结构域特异性结合肿瘤细胞上表达的抗原；以及(c)第三免疫球蛋白结构域，其包括与VH结构域连接的VL结构域，其中所述免疫球蛋白结构域特异性结合效应细胞抗原，其中所述效应细胞选自NK细胞、T细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞；其中肿瘤细胞上表达的并被(a)或(b)所述的免疫球蛋白结构域结合的至少一种所述抗原是肿瘤干细胞上和/或肿瘤前体或祖细胞上表达的抗原；以及其中结合肿瘤细胞上表达的抗原的免疫球蛋白结构域与结合效应细胞抗原的免疫球蛋白结构域的比例是至少2∶1。

根据本发明，术语“核酸分子”定义为由大于30个核苷酸组成的线性分子链。此处命名为“核酸分子”的分子群还包括完整基因。

根据本发明，“核酸分子”包括DNA，例如cDNA或基因组DNA，以及RNA。进一步包括的是本领域已知的核酸模拟分子，例如DNA或RNA的合成或半合成衍生物和混合聚合物。根据本发明，这些核酸模拟分子或核酸衍生物包括硫代磷酸核酸、氨基磷酸酯核酸、2’-O-甲氧基乙基核糖核酸、吗啉代核酸、己糖醇核酸(hexitol nucleic acid，HNA)和锁核酸(locked nucleic acid，LNA)(参见Braasch和Corey，Chem Biol 2001，8∶1)。LNA是RNA衍生物，其中核糖环被2’-氧和4’-碳之间的亚甲基键束缚。它们可含有另外的非自然的或衍生的核苷酸碱基，如本领域普通技术人员应容易理解的。

此外，本发明预期与上述定义的核酸分子互补的核酸分子以及在严格条件下与其杂交的核酸分子。

本领域公知的是如何用核酸分子进行杂交实验。相关地，本领域普通技术人员知道她/他必须使用什么样的杂交条件以获得成功的杂交。合适的杂交条件的建立参考于标准教科书，例如Sambrook，Russell“Molecular Cloning，A LaboratoryManual”，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(2001)；Ausubel，“Current Protocolsin Molecular Biology”，Green Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.(1989)或Higgins和Hames(Eds.)“Nucleic acid hybridization，a practical approach”IRL Press Oxford，Washington DC，(1985)。

“严格条件”是指杂交条件，在该条件下，能够与本发明的多核苷酸或其部分杂交的多核苷酸与这些靶序列杂交至经检测高于其他序列的程度(例如，高于背景至少2倍)。严格条件是序列依赖的并应在不同情况下而不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，与探针具有至少90％序列同一性、更优选地95％、例如98％和更优选的100％序列同一性的靶序列可被鉴定(较高严格杂交条件)。可选地，可调整严格条件以使得序列中较高程度的错配(杂交的较低严格条件)。这些用于杂交的较高严格和较低严格条件是本领域普通技术人员公知的。

例如“严格条件”是指杂交条件，其包括，例如在4×SSC(600mM NaCl，60mM柠檬酸钠)中在65℃过夜温育，然后在0.1×SSC中在65℃洗涤一小时。可选地，杂交条件可包括：在包括50％甲酰胺、5×SSC(750mM NaCl，75mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5×Denhardt′s溶液、10％硫酸右旋糖酐(dextran sulfate)和20μg/ml变性、剪切的鲑精DNA的溶液中在42℃过夜温育，然后在例如0.1-0.5×SSC中以约55-65℃洗涤约5至20分钟。所述杂交条件也是作为“杂交的较高严格条件”而为本领域普通技术人员已知的。

还可预期的是这样的核酸分子，其在较低严格杂交条件下与本发明的多核苷酸杂交(“杂交的较低严格条件”)。杂交严格性中的变化主要通过操作甲酰胺浓度(甲酰胺的较低百分比产生较低严格性)、盐条件或温度实现。例如，较低严格条件包括在4×SSC中在50℃过夜温育或在包括6×SSPE(20×SSPE＝3M NaCl；0.2MNaH₂PO₄；0.02M EDTA，pH 7.4)、0.5％SDS、30％甲酰胺、100mg/ml鲑精封闭DNA的溶液中在37℃过夜温育；然后用1×SSPE、0.1％SDS在50℃洗涤。另外，为获得甚至更低的严格性，在严格杂交后进行的洗涤可以在较高盐浓度(例如5×SSC)下进行。应注意的是在上述条件中的变化可通过可替代封闭剂的包含和/或置换来完成。通常的封闭剂包括Denhardt′s试剂、BLOTTO、肝素、变性鲑精DNA和可购得的专用配方。由于兼容性问题，具体封闭剂的包含可要求修改如上所述的杂交条件。这些修改可通常由本领域普通技术人员进行而无需进一步创造性劳动。上文引用的实施方式优选地是指较高严格条件并可选地是指较低严格条件。杂交复合体可在溶液中形成(例如，Cot或Rot分析)或在溶液中存在的一个核酸序列与固体支持物(例如，膜、滤膜、芯片、针或载玻片，例如，细胞已固定其上)上固定的另一个核酸序列之间形成。

如本文所用，术语“多肽”描述氨基酸的线性分子链，其包括单链蛋白质或它们的片段，其含有大于30个氨基酸。因此，用于本发明，术语“肽”描述氨基酸线性链，其含有高达30个氨基酸。另外，氨基酸(一个或更多个)和/或肽键(一个或更多个)已被功能类似物取代的这些蛋白质/多肽的模拟肽也被本发明包括。这些功能类似物包括除了20个基因编码的氨基酸外的所有已知的氨基酸，例如硒代半胱氨酸。术语“多肽”和“蛋白质”——其可互换使用——还指自然修饰的多肽/蛋白质，其中修饰可通过例如糖基化、乙酰化、磷酸化和本领域公知的类似修饰进行。

术语“免疫球蛋白结构域，其包括与VH结构域连接的VL结构域”是指免疫球蛋白的单链片段可变结构域(scFv)，其已显示对结合它们的抗原是必要且充分的。每个V_H或V_L结构域包括三个互补性决定区(CDR)，主要负责抗原结合的高度可变区。当应用时，V_L或V_H结构域在每个结构域上可由至少一个CDR组成，优选地至少两个，优选地所有三个，只要产生的免疫球蛋白结构域发挥所期望的功能，即特异性结合它的靶抗原。

本发明的核酸分子可编码源自单个物种的免疫球蛋白结构域，也可以是嵌合或人源化分子。

关于免疫球蛋白结构域中V_L和V_H结构域的排列，V_L结构域可定位在V_H结构域的N-或C-末端。因此，在本发明的核酸中，编码V_L结构域的核酸可定位在编码V_H结构域的核酸的5’或3’。本领域普通技术人员能够确定哪种VH和VL结构域的排列更合适于具体的scFv。

如本发明所用，术语“特异性结合”或“特异性结合的”(与“特异性地相互作用”具有相同意思)意思是免疫球蛋白结构域不或基本上不与具有与靶抗原类似结构的表位进行交叉反应。所研究的免疫球蛋白结构域系列的交叉反应性可进行检测，例如通过评估所述免疫球蛋白结构域系列在常规条件下与感兴趣的表位以及与大量或多或少(结构地和/或功能地)密切相关的表位的结合。只有在它的相关背景中与感兴趣的表位结合(例如在蛋白质结构中的具体基序)但不或基本上不与任何其他表位结合的那些免疫球蛋白结构域，被认为对感兴趣的表位是特异性的，并从而被认为是根据本发明的免疫球蛋白结构域。相应的方法例如在Harlow和Lane，1988和1999，loc cit中所述。

术语“在肿瘤细胞上表达的抗原”是指在肿瘤细胞的表面上表达的抗原。根据本发明，“肿瘤细胞”是转化的细胞，其特征在于或引起肿瘤。根据本发明，术语“肿瘤”不但指实体肿瘤，而且指非实体肿瘤性病症，举例来说，例如白血病。

“效应细胞抗原”是在效应细胞的表面上表达的抗原。用于本发明全文，术语“效应细胞”是指终端分化的白细胞，其发挥免疫系统中一个或更多特定功能。根据本发明，“效应细胞”是NK细胞、T细胞、粒细胞、巨噬细胞或单核细胞。优选的是效应细胞是NK细胞。

根据本发明术语“干细胞”是指在所有多细胞生物中发现的原始细胞，其保持通过细胞有丝分裂进行自我更新的能力并可分化为不同范围的特化的细胞类型。造血干细胞(HSC)是骨髓细胞的一种小亚型，代表大约1∶10⁵-1∶10⁶细胞，具有产生造血系统所有其他成熟细胞类型的独特能力。它们具有确定的特征性能力，其以对称和非对称方式分裂以及产生谱系限制的(lineage committed)子代细胞。HSC很少分裂，但具有较高的自我更新能力。谱系限制的子细胞是“先祖”和“前体细胞”，其更活跃地增殖(Spangrude等，1988；Bryder等，2006)。术语“前体或祖细胞”是指未成熟或未分化的细胞，通常在出生后的动物中发现。根据本发明，术语“肿瘤前体或祖细胞”是指具有可改变的性质的细胞，例如关于它们增殖行为或基因表达模式，产生肿瘤细胞。这些肿瘤前体或祖细胞的实例是例如白血病前体或祖细胞。祖细胞具有与干细胞相同的许多共同特征。与干细胞一样，祖细胞具有自我更新和分化的能力，虽然与干细胞的那些性质相比，这些性质可能是有限的。先祖或前体细胞可被看作仍能够增殖的干细胞中间子代。

结合肿瘤细胞上表达的抗原的免疫球蛋白结构域与结合效应细胞抗原的免疫球蛋白结构域的比例是本发明的重要特征。如上所述，以前所知的抗体衍生物包括多链免疫球蛋白的双特异性或三特异性衍生物或单链Fvs的双特异性衍生物。在申请人的最大知识范围内，肿瘤抗原的结合位点和效应细胞抗原的结合位点的比例最优化以及它对肿瘤细胞的免疫反应质量的影响至今没有公开。本发明首次公开了结合肿瘤细胞抗原与结合效应细胞抗原的免疫球蛋白结构域的比例为至少2∶1。结合肿瘤细胞上表达的抗原的免疫球蛋白结构域的分数越高，其具有肿瘤细胞亲和性的作用越高。因此，定向于在肿瘤细胞上表达的抗原的抗原结合部分的较高数量增加在本发明的多肽结合效应细胞之前结合肿瘤细胞的可能性。在效应细胞之前肿瘤细胞的募集是有利的，基于下列原因：直至现在，在治疗情况下，在具有一个或两个特异性的免疫球蛋白或天然触发分子与在介导免疫反应的效应细胞表面上表达的各自抗原结合时，免疫反应被诱导。因此，效应细胞不能区分抗体分子是否结合至肿瘤细胞或如果抗体衍生物不结合肿瘤细胞则不导致非特异的免疫反应。相反，对肿瘤抗原特异性的抗原结合位点与对效应细胞特异性的那些位点的2∶1比例增强在本发明抗体衍生物结合效应细胞的抗原之前其结合肿瘤细胞的可能性。作为与肿瘤细胞的亲和力增加的结果，在肿瘤细胞上的细胞表面保留时间延长，导致改进的如上所述的靶向潜能。这大大降低非特异免疫反应的数量并因此降低以前所知分子的不利的副作用。

期望的是比例为大于2∶1，例如3∶1或4∶1，其也是本发明所预期的，该比例发挥相同或更有利的性质。

与如上所述作用不同，本发明首次证明以scFvs的形式包括三个抗原结合特异性的单链多肽可重组地并可溶地表达，并发挥所期望的作用。如上所述，双特异性单链Fv抗体是现有技术已知的。但是，通常不认为可获得被假设为结构性复合体的三特异性单链分子，其正确折叠、稳定并还具有所期望的功能，即它结合它的靶抗原，从而对肿瘤细胞抗原的亲和力高于对效应细胞的亲和力。通常，已融合至其他蛋白质结构域——例如其他抗体衍生的片段——的scFv与单独scFvs相比具有较低的亲和性(Lu等，2002；Mc Call等，2001；Schwenkert等，2008)。因此可预期的是中央scFv，其以scFv三链抗体的形式在它的N-和C-末端与另一个蛋白质连接，应具有显著降低的亲和性或功能性。

本发明多肽形式的进一步优势是在一个多肽中三个scFv的组合降低分子的表面。在抗体源自其他生物而不是肿瘤被治愈的那种生物的情况下，该优势与缺乏恒定抗体结构域可降低潜在的免疫原性。

另外，以它们最简单形式的双特异性抗体衍生物由两个scFv组成，其由大约10-20个氨基酸的柔性接头连接，具有仅为约50-60kDa的相对分子量(Mr)，以及具有Mr 65kDa的蛋白质快速地由肾从血流中清除(Kipriyanov等，1999；Huhalov& Chester，2004)。从血中的快速清除引起在肿瘤位点的很少保留(Hu等，1996)。因此，通过各种修饰——包括PEG化(Kubetzko等，2006)、N-糖基化或进一步蛋白质结构域的添加——增加双特异性蛋白质的大小(Huhalov & Chester，2004；Muller等，2007；Schoonjans等，2000；Stork等，2008)。这些修饰引起改进的血浆保留时间和体内机体保留时间(Kontermann，2005)，但是不能改进分子与肿瘤细胞的结合性质，如本发明的分子可获得的。

在优选的实施方式中，(a)项和(b)项所述免疫球蛋白结构域结合肿瘤细胞上表达的相同抗原。例如，两种免疫球蛋白结构域可结合CD7、CD19、CD33、CD13、CD44var、CD123、C-型凝集素样分子-1(CLL-1)、CD96，后者存在于AML的白血病干细胞(LSC)中，或黑素瘤相关的软骨素硫酸蛋白聚糖(MCSP)。

在另一个优选的实施方式中，(a)项和(b)项的免疫球蛋白结构域结合肿瘤细胞上表达的不同抗原。

在进一步优选的实施方式中，在肿瘤干细胞或肿瘤前体或祖细胞上表达的至少一个抗原是CD19、CD33、CD13、CD44var、CD123、CLL-1或CD96。

在本发明另外优选的实施方式中，在肿瘤细胞上表达、优选地在肿瘤干细胞或肿瘤前体或祖细胞上表达、并被(a)和(b)的免疫球蛋白结构域结合的抗原是CD19和CD33、CD19和CD13、CD19和CD123、CD19和CD44var、CD19和MCSP、CD33和CD13、CD33和CD123、CD33和CD44var、CD33和CLL-1、CD33和CD96、CD13和CD123、CD13和CD44var、CD13和CLL-1、CD13和CD96、CD123和CD44var、CD123和CLL-1、CD123和CD96、CD44var和CLL-1、CD44var和CD96、或CLL-1和CD96。

通常，在健康的细胞上，每次仅表达上述抗原的一种类型。但是，在某些肿瘤中，特别是在某些白血病中，可同时表达一个以上的上述或其他特异抗原。现有技术中所述的显著实例是CD13和CD19、CD33和CD19、以及CD19和MCSP(黑素瘤相关的软骨素硫酸蛋白聚糖)，其在双表型或混合谱系白血病中共表达(Greil等，1994；Hrusak和Porwit-MacDonald，2002；Casasnovas等，2003；Haagen等，1992)。由本发明核酸分子编码的并对通常不在健康的细胞上同时表达的两个不同抗原具有特异性的多肽对异常细胞具有增加的亲和性，异常细胞即同时表达两个上述抗原的肿瘤细胞。这增强分子对肿瘤细胞的选择性。

在另一个优选的实施方式中，被(c)的免疫球蛋白结构域结合的效应细胞抗原是CD16(FcγRIIIa)或CD64(FcγRI)。合适于本发明内容的进一步抗原是CD89、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD3、CD28或CD2。

在进一步优选的实施方式中，至少一个免疫球蛋白结构域包括至少一个能够形成分子内二硫键的半胱氨酸残基。

已知分子内半胱氨酸桥稳定抗体-片段和正面影响它的血清稳定性和/或在一些情况下影响它对靶表位的结合亲和性等等。二硫桥通常在自然发生抗体中发现，其中它们存在于可变和恒定区中。发现许多scFv抗体对抗原具有比Fab负体更低的亲和性，其归因于scFv的肽接头干扰结合的事实(Batra等，1992；Pantoliano等，1991；Stemmer等，1993)。为了改进具有不同数量结合位点的scFv抗体的性质，试图在分子中二硫桥不能自然发生的位置引入能够形成二硫桥的半胱氨酸。当设计具有人工半胱氨酸桥的修饰的抗体时，必须满足下列先决条件。首先，二硫桥应在Fv的结构保守区中即在V_H和V_L区中连接氨基酸。另外，V_H和V_L结构域之间的距离应足够小以使二硫桥形成而不在Fv分子中产生反向张力。最后，二硫桥应距CDR足够远以便不干扰抗原结合。因而，引入形成二硫桥的半胱氨酸在Fv的框架区，其在大部分抗体中在结构保守的位置，连接V_H和V_L区的CDR。Glockshuber等(1990)、Brinkmann等(1993)和Reiter等(1994)阐述了这些标准并成功地建立了第一个二硫键稳定的Fv抗体。

但是，以这种方式用于稳定仅包括可变区的抗体，如在scFv中的大部分试验面临各种困难，即与重组全抗体的表达相比在修饰的抗体表达过程中面临的类似问题。例如，当重组表达时，产生的分子变为不可溶的，其可能的原因在于未受控制的二硫桥形成及其产生的聚集。除此之外，与它们未用二硫键稳定的负体相比，二硫稳定的scFv还通常显示对抗原的降低的亲和性。

本发明可克服该问题。虽然本领域各种专业人员如上所述预测产生类似困难，本发明抗体衍生物的免疫球蛋白结构域可通过结构域内的半胱氨酸桥而稳定，而不同时将全部分子变为不可溶。本发明多核苷酸的氨基酸序列中的突变可例如根据Reiter等(1994)以碱基三联体在V_L结构域的位置100或在V_H结构域的位置44引入，以使它们编码半胱氨酸残基。所有位置是根据Kabat编号(Kabat等，1991)。

在本发明的内容中，通过将两个适合的氨基酸如上所述突变为半胱氨酸，以使结合某些抗原的免疫球蛋白结构域稳定。将二硫桥引入至对CD19和CD16具有特异性的scFv的免疫球蛋白结构域显示大大增强分子的稳定性，而不影响它们的特异性或降低它们亲和性和功能性，如本发明人在对MCSP或CD7具有特异性的其他scFv中观察到的。

将突变引入核酸分子的方法是本领域普通技术人员已知的并可从例如Sambrook，2001和Ausubel，2001中得到。

在一个不同的优选实施方式中，本发明的核酸分子编码至少一个接头，其将至少一个VH与VL结构域分离或将至少一个VL与VH结构域分离。

根据本发明，所用的术语“接头”涉及一段氨基酸序列，其连接一个免疫球蛋白结构域或两个免疫球蛋白结构域的V_H和V_L结构域。因此，接头可将形成一个免疫球蛋白结构域的至少一个V_H和V_L区分离和/或接头可将邻近的免疫球蛋白结构域的至少一个V_L和V_H区分离。

本发明所用接头是长度为1至40个氨基酸的(多)肽接头。优选地，所述接头长度为5至25个氨基酸。甚至更优选地，所述接头长度为10至20个氨基酸。分离一个免疫球蛋白结构域的V_H和V_L结构域的接头以及分离不同免疫球蛋白结构域的接头可具有相同或不同的长度并可包括相同或不同的氨基酸序列。优选地，接头具有相同长度和相同氨基酸序列。

在另一个优选的实施方式中，分离免疫球蛋白结构域的接头在长度和/或氨基酸序列上不同于在免疫球蛋白结构域中分离V_H和V_L区的接头。例如，前者可以较长并设计以促进互相面对的免疫球蛋白结构域的柔性或促进分子的正确折叠和/或增强一个免疫球蛋白结构域对它的靶抗原的亲和性。另外，接头的性质，即接头的长度和/或氨基酸序列可修饰或增强分子的稳定性和/或溶解性。

接头的长度和序列取决于形成免疫球蛋白结构域的V_H和V_L结构域的组成。例如，从本发明多肽的N-末端或从本发明核酸分子的5’-端起始，如果V_L结构域后是V_H结构域，分离一个免疫球蛋白结构域的V区的20个氨基酸的接头可能是最佳的。相反，如果V_H结构域后是V_L结构域，各个接头可具有15个氨基酸的最佳长度。不期望被任何科学理论限制，应认为的是这些差异的原因可能在于空间原因，其导致不同长度的接头促进具有不同的V结构域排列的免疫球蛋白结构域的正确折叠。

本领域普通技术人员公知在免疫球蛋白结构域内或免疫球蛋白结构域之间测试不同接头适合性的方法。例如，分子的性质可通过比较免疫球蛋白结构域的结合亲和性容易测定。在本发明的三特异性分子的情况下，可对每个免疫球蛋白结构域进行分别测量。可测量产生的分子的稳定性——使用基于流式细胞术的方法以测定在人血清中在37℃温育几个时间段后分子的残余结合能力。其他合适的测试可在例如Bruenke等(2005)中发现。在优选的实施方式中，通过柔性接头使用例如氨基酸丙氨酸和丝氨酸或甘氨酸和丝氨酸，将至少两个可变结构域融合。优选地，接头序列是(Gly₄Ser)₄或(Gly₄Ser)₃。在另一个优选实施方式中，在免疫球蛋白结构域内或之间在至少一个V_H和V_L结构域或V_L和V_H结构域之间不存在接头。

在另一个优选的实施方式中，本发明的核酸分子编码两个特异性结合CD19的免疫球蛋白结构域以及一个特异性结合CD16(FcγRIIIa)的免疫球蛋白结构域。

在另一个优选的实施方式中，本发明的核酸分子编码两个特异性结合CD33的免疫球蛋白结构域以及一个特异性结合CD16(FcγRIIIa)的免疫球蛋白结构域。

与双特异性scFv抗体衍生物相比，由本发明的核酸分子编码的抗体——其包括两个肿瘤抗原结合位点和一个效应子抗原结合位点——具有优异性质。与双特异性scFv衍生物相比，本发明新的抗体衍生物在抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)分析中显示更高效力。另外，单链Fv三联体(三链抗体)具有更有利的药物动力学性质。在小鼠中，体内血清保留半衰期高于串联双特异性scFv抗体显示的半衰期。另外，与双特异性scFv抗体的非二硫键-稳定的变体相比，在所有免疫球蛋白结构域中具有二硫桥的二硫键-稳定的抗体在之前显示更加稳定(Bruenke等，2005)。

如实施例显示，与用作CD33单价对照蛋白的bsscFv[33×ds16]相比，重组抗体片段[CD33×CD16×CD33]对骨髓肿瘤抗原CD33具有更高的亲和力。重要地是，对CD33更高的亲和力翻译为增加的ADCC潜能：单链Fv三链抗体(sctb)[33×ds16×33]需要比bsscFv[33×ds16]低8倍的浓度来诱导半最大的裂解。

还在另一个优选实施方式中，多肽进一步包括与免疫球蛋白结构域不相关的至少一个(多)肽，其可以是例如适于改进本发明多肽性质的标记或功能(多)肽。标签可以是例如Strep-标记、His-标记、Myc标记或Flag标记。功能多肽是例如κ分泌前导区、人血清白蛋白(hsa)或其片段，能够结合hsa或其他血清蛋白的肽；能够结合新生儿Fc受体(FcRn)、人肌肉醛缩酶(hma)的肽或其片段；铰链区、免疫球蛋白恒定区、白细胞介素-2、白细胞介素-15和白细胞介素-18、粒细胞-巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)，粒细胞刺激因子(G-CSF)或具有至少一个N-糖基化位点的肽。

如本文所用，术语“(多)肽”描述一组分子，其包括由直至30个氨基酸组成的一组肽，以及如上所定义由大于30个氨基酸组成的一组多肽。

与本发明相关的术语“其片段”是指蛋白质的片段，其仍具有全长(多)肽的一种或更多种生物学功能。具体地，本发明拟用的(多)肽片段能够增加本发明抗体衍生物的稳定性和/或血清半衰期。

本领域公知的是功能多肽可被切割以产生具有不改变或基本上不改变功能的片段。这些切割可包括去除给定数量的N-和/或C-末端氨基酸。另外地或可选地，许多内部(非末端)氨基酸可以去除，条件是所获得的多肽具有全长(多)肽的功能。从末端和/或内部区域去除的所述氨基酸数量可以是一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、15、20、25、30、40、50或大于50。在一至50之间的任何其他数量也是根据本发明可想象的。

测定多肽的这些功能性结构域的方式和方法是本领域公知的，并包括实验和生物信息学方法。实验方法包括缺失突变体的系统产生以及对它们进行上述本领域已知的期望功能的评估分析。生物信息学方法包括数据库检索。合适的数据库包括蛋白质序列数据库。在这种情况下，显著命中的多序列比对显示结构域界限，其中一个或多个结构域包括那些与序列的剩余部分相比显示提高的序列保守水平的子序列。进一步合适的数据库包括保守蛋白质结构域的统计模型数据库，例如由Sanger Institute，UK维护的Pfam(www.sanger.ac.uk/Software/Pfam)。

进一步由本发明核酸分子编码的一些(多)肽可促进重组表达多肽的纯化，例如各种标记。将标记和/或其他多肽添加至由本发明核酸分子编码的多肽的方法是本领域普通技术人员公知的，例如Sambrook，2001中所述。

在优选的实施方式中，本发明的肿瘤细胞优选地是白血病或淋巴瘤细胞。取决于白血病产生的淋巴或骨髓细胞的来源和阶段，在它们的表面上表达不同模式的抗原。在源自B细胞谱系的细胞表面上表达的抗原是例如CD19、CD20或CD22，但是源自骨髓细胞的细胞的通常抗原是例如CD13、CD33或CD123。这些抗原不只是在白血病细胞上表达，也在健康的细胞上表达(Taussig等，2005)。

已报道在来自B-ALL某些类型的白血病干细胞和/或祖细胞上表达CD19(Castor等，2005)。CD44v6在淋巴和骨髓前体细胞的亚型上表达并且在AML细胞和AML白血病干细胞(LSCs)上强过量表达(Jin等，2006；Legras等，1998)。CD13、CD33、CD96、CD 123和CLL-1在骨髓来源的AML细胞和LSC上表达(Taussig等，2005；van Rhenen等，2007；Hosen等，2007)。

在另一个优选的实施方式中，肿瘤干细胞是白血病干细胞。根据本发明，“白血病干细胞”(LSC)是恶性转化的细胞群，其以HSC驱动正常造血细胞产生的类似方式驱动白血病的发生。它们代表所有白血病细胞的少数(大约1∶50,000-1∶10⁶)。它们确定的性质是无限自我更新能力和以对称和非对称方式分裂的能力。因此，在一名患者中所有白血病细胞的总和不是细胞的均质群体，而是由白血病干细胞、中间祖细胞和大多数更加分化的白血病母细胞组成的异质混合物。LSC具有不同于大量白血病细胞的细胞表面标记组成，其对化疗药物具有高度抗性。它们通常在消除大多数肿瘤细胞并产生退化的化学治疗中存活。剩余的少数几种LSC是微小残留疾病(MRD)细胞，其引发白血病的再生(“复发”)(Tan等，2006；Bonnet和Dick，1997；Lapidot等，1994；Passegue等，2003)。

在另一个优选实施方式中，肿瘤前体或祖细胞是白血病前体或祖细胞。

在进一步优选的实施方式中，肿瘤是白血病或淋巴瘤。如上所述，白血病是血液癌症或骨髓癌症，其特征在于血细胞异常增殖，通常为白细胞异常增殖。白血病可在发育过程中的不同阶段发生，包括干细胞阶段(Castor等，2005)。

在一个不同的方面，本发明涉及包括本发明核酸分子的载体。

优选地，载体是质粒、黏粒、病毒、噬菌体或例如常规用于基因工程中的其它载体。

本发明核酸分子可插入至几种可购得的载体中。非限制性实例包括原核质粒载体，例如pUC-系列、pBluescript(Stratagene)、表达载体的pET系列(Novagen)或pCRTOPO(Invitrogen)以及适于在哺乳动物细胞中表达的载体，例如pREP(Invitrogen)、pcDNA3(Invitrogen)、pCEP4(Invitrogen)、pMC1neo(Stratagene)、pXT1(Stratagene)、pSG5(Stratagene)、EBO-pSV2neo、pBPV-1、pdBPVMMTneo、pRSVgpt、pRSVneo、pSV2-dhfr、pIZD35、pLXIN、pSIR(Clontech)、pIRES-EGFP(Clontech)、pEAK-10(Edge Biosystems)、pTriEx-Hygro(Novagen)和pCINeo(Promega)。适于巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的质粒载体实例包括例如质粒pAO815、pPIC9K和pPIC3.5K(均为Intvitrogen)。

如上所指的本发明的核酸分子也可插入至载体以便产生与另一个核酸分子的翻译融合。其他核酸分子可编码蛋白质，其可例如提高本发明的核酸分子编码的蛋白质的溶解性和/或促进纯化。非限制性实例包括pET32、pET41、pET43(Novagen)。载体也可含有可另外表达的多核苷酸，其编码一个或更多分子伴侣以促进正确的蛋白质折叠。合适的细菌表达宿主包括例如源自BL21的菌株(例如BL21(DE3)、BL21(DE3)PlysS、BL21(DE3)RIL、BL21(DE3)PRARE)或

对于载体修饰技术，参见Sambrook和Russel，2001。通常地，载体可含有一个或更多复制起点(ori)和用于克隆或表达的遗传系统，用于在宿主中选择的一个或更多标记，例如抗生素抗性，以及一个或更多表达盒。合适的复制起点(ori)包括，例如，Col E1、SV40病毒和M 13复制起点。

典型的哺乳动物表达载体含有启动子元件，其介导mRNA转录的起始、蛋白质编码序列和转录终止所需信号和转录体的多聚腺苷化。另外，元件，例如复制起点、药物抗性基因、调节子(作为可诱导启动子的部分)也可包括。lac启动子是典型的可诱导启动子，用于原核细胞，其可以使用乳糖类似物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(“IPTG”)诱导。对于重组表达，抗体片段可连接在例如周质中引导重组蛋白质的PelB前导信号与称为pHEN4噬菌粒中的基因III之间(描述于Ghahroudi等，1997中)。附加元件可包括增强子、Kozak序列和供体和受体位点位于其两侧的间插序列用于RNA剪接。使用SV40的早期和晚期启动子、逆转录病毒——例如RSV、HTLVI、HIVI——的长末端重复序列(LTRs)以及巨细胞病毒(CMV)的早期启动子，可以获得高效转录。但是，也可使用细胞元件(例如人肌动蛋白启动子)。用于实践本发明的合适的表达载体包括例如载体，例如pSVL和pMSG(Pharmacia，Uppsala，Sweden)、pRSVcat(ATCC 37152)、pSV2dhfr(ATCC37146)和pBC12MI(ATCC 67109)。与可选择标记，例如用于真核细胞的dhfr、gpt、新霉素、潮霉素基因或用于大肠杆菌和其他细菌培养的四环素、卡纳霉素或氨苄青霉素抗性基因共转染可进行转染的细胞的鉴定和分离。转染的核酸也可扩增，以表达大量编码的(多)肽。DHFR(二氢叶酸还原酶)标记可用于产生携带感兴趣基因的几百个或甚至几千个拷贝的细胞系。另一个可用的选择标记是酶——谷氨酸合成酶(GS)(Murphy等1991；Bebbington等1992)。使用这些标记，将哺乳动物细胞在选择培养基中生长并选择具有最高抗性的细胞。

允许在原核宿主细胞中进行表达的可能的调节元件包括例如大肠杆菌中的lac、trp或tac启动子，lacUV5或trp启动子，允许在真核宿主细胞中进行表达的调节元件的实例(更优选的实施方式)是酵母中的AOX1或GAL1启动子或在哺乳动物和其他动物细胞中的CMV-(巨细胞病毒)、SV40-、RSV-启动子(劳氏肉瘤病毒)、gai10启动子、人延伸因子1α-启动子、CMV增强子、CaM-激酶启动子、苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)多核型多角体病毒(AcMNPV)多角体启动子或球蛋白内含子。优选的启动子是天然免疫球蛋白启动子。除了负责转录起始的元件以外，这些调节元件也可包括转录终止信号，例如SV40-poly-A位点或tk-poly-A位点或SV40、lacZ和AcMNPV多角体多聚腺苷化信号，其位于多核苷酸的下游。

插入载体中的编码序列可例如由标准方法合成，或从自然来源中分离或半合成产生，即通过组合化学合成和重组技术。可使用已建立的方法将编码序列连接至转录调节元件和/或其他氨基酸编码序列。确保在原核或真核细胞中表达的转录调节元件(表达盒的部分)是本领域普通技术人员熟知的。这些元件包括确保转录起始的调节序列(例如，翻译起始密码子、启动子、增强子和/或隔离子)，内部核糖体进入位点(IRES)(Owens等，2001)和任选地确保转录终止和转录体稳定的poly-A信号。附加调节元件可包括转录和翻译的增强子和/或自然相关或异源启动子区。优选地，本发明的核酸分子可操作地连接至这些表达控制序列，使得在原核或真核细胞中表达。载体可进一步包括编码分泌信号的核苷酸序列，其作为另外的调节元件。这些序列是本领域普通技术人员公知的。另外，取决于使用的表达系统，能够将表达的多肽引导至细胞区室的前导序列可添加至本发明多核苷酸的编码序列。这些前导序列是本领域公知的。

具体设计的载体可在不同宿主之间进行DNA穿梭，例如细菌-真菌细胞或细菌-动物细胞。

根据本发明的表达载体能够引导复制以及本发明多核苷酸和编码的酶的表达。包括所述调节元件的合适的表达载体是本领域已知的，例如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(In-Vitrogene，如所附实例所用，等等)、pSPORT1(GIBCO BRL)或pGEMHE(Promega)或原核表达载体，例如λgt11、pJOE、pBBR1-MCS-系列、pJB861、pBSMuL、pBC2、pUCPKS、pTACT1或优选地，pET载体(Novagen)。

如本文以上所述，本发明的核酸分子可设计为直接引入或经由脂质体、噬菌体载体或病毒载体(例如腺病毒、逆转录病毒)引入至细胞。另外，杆状病毒系统或基于牛痘病毒或塞姆利基森林病毒(Semliki Forest Virus)的系统可用作本发明的核酸分子的真核表达系统。源自病毒，例如逆转录病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或牛乳头瘤病毒的表达载体可用于将多核苷酸或载体递送至目标细胞群体。本领域普通技术人员熟知的方法可用于构建重组病毒载体；参见例如Sambrook，2001和Ausubel，2001所述技术。

还在另一方面，本发明涉及用本发明载体转化的非人宿主。

合适的原核宿主包括例如埃希氏菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属的种和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的细菌。合适的真核宿主细胞是例如真菌细胞等等，酵母，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)或昆虫细胞，例如果蝇(Drosophila)S2和夜蛾(Spodoptera)Sf9细胞和植物细胞。上述宿主细胞适合的培养基和条件是本领域已知的。

可使用的哺乳动物宿主细胞包括：人Hela、HEK293、H9和Jurkat细胞、小鼠NIH3T3和C127细胞、COS 1、COS 7和CV1、quail QC1-3细胞、小鼠L细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和鲍斯(Bowes)黑色素瘤细胞。原代哺乳动物细胞例如小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)也在本发明范围内。可选地，本发明的重组蛋白质可在含有整合至染色体的基因构建体的稳定细胞系中表达。

在更优选的实施方式中，所述细胞是原代细胞或原代细胞系。原代细胞是直接从生物中获得的细胞。合适的原代细胞是例如小鼠胚胎成纤维细胞、小鼠原代肝细胞、心肌细胞和神经元细胞以及小鼠肌肉干细胞(卫星细胞)及其衍生的稳定的永生化细胞系。

用本发明的核酸分子转染的和/或表达本发明核酸分子的作为宿主的转基因非人动物也在本发明的范围中。在优选的实施方式中，转基因动物是哺乳动物，例如仓鼠、牛、猫、猪、狗或马。

另外，本发明涉及产生多肽的方法，其包括在合适的条件下本发明的宿主细胞的培养和产生的重组多肽的分离。

用于培养原核或真核宿主的合适的条件是本领域普通技术人员公知的。例如，用于培养细菌的合适的条件是在Luria Bertani(LB)培养基中在通风下培养它们。为了提高表达产物的产量和溶解性，可以将培养基缓冲或添加已知提高或促进产量和溶解性的合适添加剂。可以在4至约37℃培养大肠杆菌，精确的温度或温度的顺序取决于将被过表达的分子。通常，本领域普通技术人员还应知道这些条件必须适于宿主需要和表达的多肽的要求。在可诱导的启动子控制宿主细胞中存在的载体中的本发明核酸的情况下，多肽的表达可以通过添加合适的诱导剂来诱导。合适的表达方法和策略是本领域普通技术人员已知的。

取决于细胞类型和它的具体要求，哺乳动物细胞培养可在例如RPMI或DMEM培养基中进行，其含有10％(v/v)FCS、2mM L-谷氨酸和100U/ml青霉素/链霉素。细胞可以保持在37℃，在5％CO₂、水饱和的环境中。

适于昆虫细胞培养的培养基是例如TNM+10％FCS或SF900培养基。昆虫细胞通常在27℃以粘附或悬浮培养进行生长。

适于真核细胞的表达方法是本领域普通技术人员公知的并可从例如Sambrook，2001中得到。

分离产生的多肽的方法是本领域公知的，其包括且不限于方法步骤，例如离子交换层析、凝胶过滤层析(大小排阻层析)、亲和层析、高压液相层析(HPLC)、逆相HPLC、圆盘凝胶电泳或免疫沉淀，参见例如Sambrook，2001。

另一方面，本发明涉及由本发明的核酸分子编码的或由本发明的方法产生的多肽。

另外，本发明涉及诊断组合物，其包括本发明的核酸分子、本发明的载体或本发明的多肽中的至少一个。

本发明多肽的提高的亲和性和/或亲和力使它能够用于诊断分析。例如，这些分子可以用作在细胞表面上表达各自抗原的恶性细胞的灵敏检测剂。因此，可产生高亲和力的单特异性变体，其具备针对一个细胞表面抗原的三个结合部分。作为另一个实例，三特异性分子可用于检测表达该分子所针对的三个抗原中至少一个的细胞，其中应用一种单独试剂。特别地，二硫键稳定的scFv片段的高稳定性——其以该形式引入——使其可长时间的储存，这是诊断剂所期望的。

另外，本发明涉及药学组合物，其包括本发明的核酸分子、本发明的载体或本发明的多肽。

根据本发明，术语“药学组合物”涉及组合物，用于施用至患者，优选地人患者。本发明的药学组合物包括上文引用的化合物(其中术语“化合物”是指提及的核酸分子、载体和多肽以及其片段或衍生物或修饰)，单独或联合。任选地，其可进一步包括能够改变本发明化合物特征的分子，从而例如稳定、调节和/或激活它们的功能。组合物可以是固体、液体或气体形式，并且可以是粉末、片剂、溶液或气溶胶形式等等。本发明的药学组合物可任选地和另外地包括药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”意思是无毒固体、半固体或液体填充物、稀释剂、任何类型的包封材料或配方辅剂。合适的药学上可接受的载体的实例是本领域公知的，其包括磷酸缓冲盐溶液、水、乳液例如油/水乳液、各种类型的润湿剂、无菌溶液、有机溶剂包括DMSO等等。包括这些载体的组合物可通过熟知的常规方法配置。如本文所用术语“肠胃外”是指施用方式，其包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射以及输注。这些药学组合物可以合适的剂量施用至对象。由主治医生和临床因素来决定剂量方案。如医学领域公知的，用于任何一名患者的剂量取决于许多因素，包括患者的大小、体表面积、年龄、施用的具体化合物、性别、施用时间和途径、总体健康和同时施用的其他药物。给定情况的治疗有效量将通过常规实验易于测定，并在普通临床医生和医师的技术和判断内。通常地，作为药学组合物常规施用的方案应在每天μg至5g单位的范围内。但是，更优选的剂量可在每天0.01mg至100mg的范围内，甚至更优选地，每天0.01mg至50mg以及最优选地每天0.01mg至10mg。

如上所述，本发明的核酸分子可以配制为药学组合物。最后，将核酸分子引入所期望的细胞。适合的配方包括这样的配方，其中每次剂量施用10⁶至10¹²个拷贝的DNA分子，其有利地包括在适合的载体中。载体可以是例如噬菌体、质粒、病毒或逆转录病毒载体。逆转录病毒载体可以是能够复制的或复制有缺陷的。在后一种情况中，病毒繁殖应通常仅发生在互补宿主/细胞中。

本发明的核酸分子、本发明的载体或本发明的多肽可用于肿瘤的治疗。因此，本发明还涉及治疗肿瘤的方法，其包括施用有效剂量的本发明的核酸、本发明的载体或本发明的多肽，以便在所需要的患者中发挥所期望的作用。

与治疗方法相关的所期望的作用是诱导针对表达靶肿瘤抗原的细胞——特别是白血病细胞——的免疫反应。

在优选的实施方式中，待被治疗的肿瘤是白血病或淋巴瘤。

本发明针对的白血病或淋巴瘤是例如如上所定义的AML、CML、ALL、CLL或非霍奇金淋巴瘤。

附图显示：

图1.重组串联单链Fv三联体(或三链抗体；sctb)的构建。两个末端的scFv对肿瘤抗原具有特异性，中央scFv针对效应细胞上的激活触发分子。CMV，巨细胞病毒即刻早期启动子；Igκ，鼠Ig κL链的分泌前导序列；V_L、V_H，编码Ig L-或H-链的V区的cDNA序列；Strep、c-myc、6×His，编码strep、c-myc或六组氨酸标记的cDNA。

图2.sctb二硫键-稳定的(ds)[19×16×19]的构建和表达。(A)sctb ds[19×16×19]的设计。两个末端scFv对肿瘤抗原CD19具有特异性，中央scFv针对NK细胞和巨噬细胞上的激活触发分子CD16。CMV，巨细胞病毒即刻早期启动子；Igκ，鼠Ig κL链的分泌前导序列；V_L、V_H，编码Ig L-或H-链的V区的cDNA序列；L，编码20个氨基酸柔性接头的cDNA，例如(Gly₄Ser)₄；Strep、c-myc、6×His、编码strep、c-myc或六组氨酸标记的cDNA；S-S，稳定的二硫键。在用Ni-NTA琼脂糖珠进行亲和层析后，评价sctb ds[19×16×19]的完整性和纯度，其通过还原SDS-PAGE和用考马斯蓝染色(B)并分别使用用于检测的抗his或抗Strep抗体进行蛋白质印迹分析(C)。

图3.sctb ds[19×16×19]的特异和同时抗原结合。(A)sctb ds[19×16×19]对CD19阳性SEM细胞(i)、CD19-阴性CEM细胞(ii)、CD16-转染的CHO细胞(iii)和未转染的CHO细胞(iv)的特异结合的FACS分析(白色峰：同种型对照的信号；黑色峰：sctb ds[19×16×19]的信号)。(B)同时结合CD19和CD16。将SEM细胞与sctb ds[19×16×19]温育并通过添加由CD16的细胞外结构域和GFP组成的融合蛋白(CD16ex-GFP)显示同时结合(i)。通过用50倍摩尔过量的CD19mAb4G7预温育SEM细胞(ii)或通过用CD16mAb 3G8预温育CD16ex-GFP融合蛋白(iii)来封闭由CD16ex-GFP产生的荧光信号。通过添加非相关IgG1同种型未发生封闭(白色峰：对照sctb的信号；黑色峰：sctb ds[19×16×19]的信号；深灰色峰：添加亲本mAb后获得的信号；浅灰色峰：添加IgG1同种型后获得的信号)。

图4.sctb ds[19×16×19]和双特异性(bs)scFv ds[19×16]结合活性的比较。(A)通过流式细胞术获得的sctb ds[19×16×19](左)和bsscFv ds[19×16](右)的平衡结合曲线。将增加浓度的sctb和bsscFv添加至CD19阳性SEM(实心黑色方形)或添加至CD16-转染的CHO细胞(空心灰色三角形)并用抗His抗体检测。通过Langmuir/Scatchard算法计算K_D值。(B)CD19 mAb 4G7结合至SEM细胞的浓度依赖的竞争性抑制。通过流式细胞术监测到随着抑制剂sctb ds[19×16×19](实心黑色方形)或bsscFv ds[19×16](空心灰色三角形)浓度的增加，mAb 4G7结合降低。对于抑制剂的每个浓度，计算产生的抑制百分比。(C)体外细胞表面保留。分别用sctb ds[19×16×19](实心黑色方形)或bsscFv ds[19×16](空心灰色三角形)修饰SEM细胞并在37℃温育。洗涤掉过量分子后，取出等分试样并通过流式细胞术在指定时间点分析在细胞表面上保留的分子。*sctb ds[19×16×19]和bsscFvds[19×16]之间的统计学显著差异。

图5.通过将新鲜分离的MNC作为效应细胞，sctb ds[19×16×19]介导CD19阳性SEM靶细胞的有效裂解。(A)ADCC诱导是CD19特异的和CD16-依赖的。以1nM的浓度，以效应子与靶(E∶T)细胞比例为40∶1，sctb ds[19×16×19]诱导特异性裂解。非相关对照sctb和亲本mAb4G7(CD19)和3G8(CD16)均不能以等摩尔浓度单独诱导显著裂解。通过添加125倍摩尔过量的亲本mAb4G7或3G8，ADCC被竞争性抑制，但不能被相应过量的IgG1同种型竞争性抑制。(B)以1nM的浓度，在宽范围的E∶T比例，sctb ds[19×16×19]诱导显著ADCC，以及随着E∶T比例的增加，特异性裂解的程度增加(黑条：sctb ds[19×16×19]；灰条：对照sctb；白条：无抗体)。以裂解平均百分比±平均值标准误差(SEM)提供数据，其从至少三个不同健康的供体中分离的MNC获得。*与不添加抗体的对照比较，ADCC具有的统计学显著差异。#与单独添加sctb ds[19×16×19]比较，ADCC具有统计学显著差异。

图6.由sctb ds[19×16×19]和bsscFv ds[19×16]对不同肿瘤细胞系的ADCC的剂量依赖诱导。CD19阳性肿瘤细胞系SEM(A)、BV-173(B)和ARH-77(C)作为靶以40∶1的恒定E∶T细胞比例来比较sctb和bsscFv的效力。sctb ds[19×16×19](实心黑色方形)和bsscFv ds[19×16](空心灰色三角形)以剂量依赖的方式触发ADCC。非相关对照sctb(实心黑色圆形)和非相关对照bsscFv(空心灰色圆形)均不能诱导显著杀伤。数据点代表裂解的平均百分比±SEM，其从至少六个不同健康的供体中分离的MNC获得。*与不添加抗体的对照比较，ADCC具有统计学显著差异。#由sctb ds[19×16×19]和bsscFv ds[19×16]诱导的杀伤之间的统计学显著差异。

图7.由sctb ds[19×16×19]和bsscFv ds[19×16]对CD19阳性原代淋巴瘤细胞和白血病母细胞的有效裂解。(A)用sctb ds[19×16×19](黑条)和bsscFv ds[19×16](白条)以1nM的浓度，使用来自健康供体的MNC，以40∶1的E∶T比例，来裂解来自外周血(PB)的恶性细胞或来自九名B-CLL患者、来自一名MCL和一名B-ALL患者的骨髓(BM)。非相关sctb(深灰条)或MNC单独(浅灰条)不能诱导裂解。数据点代表三次测定的平均值，误差棒代表SEM。(B)利用B-CLL患者1-4的细胞作为靶向，以40∶1的E∶T比例的剂量反应曲线。sctb ds[19×16×19](实心黑色方形)诱导裂解，其具有低于bsscFv ds[19×16](空心灰色三角形)10-至20倍的EC₅₀值。在非相关对照sctb(空心圆形)没有观察到显著裂解。数据点表示裂解的平均百分比±SEM，其从至少三个不同健康的供体中分离的MNC获得。*与不添加抗体的对照比较，ADCC具有统计学上的显著差异。#由sctb ds[19×16×19]和bsscFv ds[19×16]诱导的杀伤之间的统计学显著差异。

图8.体内血浆保留时间。将sctb ds[19×16×19](实心黑色方形)和bsscFvds[19×16](空心灰色三角形)分别静脉注射至NOD-SCID小鼠。在几个时间点对小鼠取血并使用CD19阳性SEM(A)和CD16-转染的CHO细胞(B)通过流式细胞术分析血清是否存在免疫反应性sctb和bsscFv。*在sctb ds[19×16×19]和bsscFv ds[19×16]的残余结合之间的统计学显著差异。

图9.37℃体外血清稳定性。在37℃在人血清中将sctb ds[19×16×19](实心黑色方形)温育几个时间段。通过流式细胞术测定CD19和CD16结合部分的残余结合能力。(A)对CD19阳性SEM细胞的残余结合。(B)对CD16-转染的CHO细胞的残余结合。

图10.sctb[33×ds16×33]的构建和表达。(A)sctb[33×ds16×33]的设计。两个末端scFv对骨髓肿瘤抗原CD33具有特异性，中央scFv针对NK细胞和巨噬细胞上的激活触发分子CD16。CMV，巨细胞病毒即刻早期启动子；Igκ，鼠Ig κL链的分泌前导序列；V_L、V_H，编码Ig L-或H-链的V区的cDNA序列；L，编码20个氨基酸柔性接头(Gly₄Ser)₄的cDNA；Strep、c-myc、6×His，编码strep、c-myc或六组氨酸标记的cDNA；S-S，稳定的二硫键。在用Ni-NTA琼脂糖珠进行亲和层析后，评价sctb[33×ds16×33]的完整性和纯度，其通过还原SDS-PAGE和用考马斯蓝染色(B)并使用用于检测的抗his抗体进行蛋白质印迹分析(C)。

图11.bsscFv[33×ds16]的构建和表达。

(A)bsscFv[33×ds16]的设计。N-末端scFv特异性针对肿瘤抗原CD33，C-末端scFv针对NK细胞和巨噬细胞上的激活触发分子CD16。CMV，巨细胞病毒即刻早期启动子；Igκ，鼠IgκL链的分泌前导序列；V_L、V_H，编码Ig L-或H-链的V区的cDNA序列；L，编码20个氨基酸柔性接头(Gly₄Ser)₄的cDNA；Strep、c-myc、6×His，编码strep、c-myc或六组氨酸标记的cDNA；S-S，稳定的二硫键。在用Ni-NTA琼脂糖珠进行亲和层析后，评价bsscFv[33×ds16]的完整性和纯度，其通过还原SDS-PAGE和用考马斯蓝染色(B)并使用用于检测的抗his抗体进行蛋白质印迹分析(C)。

图12.sctb[33×ds16×33]特异性地并同时结合各自抗原。(A)经由荧光分析检测到sctb[33×ds16×33]对CD33阳性HL-60细胞(i)、CD16-转染的CHO细胞(ii)以及CD33和CD16抗原阴性SEM细胞(iii)的特异性结合(灰色峰：对照sctb的信号；白色峰：sctb[33×ds16×33]的信号)。(B)同时结合CD16和CD33。将CD16-转染的CHO细胞与sctb[33×ds16×33]温育并通过添加由CD33的细胞外结构域和DsRed组成的融合蛋白(CD33ex-DsRed)显示同时结合(灰色峰：对照sctb的信号；白色峰：sctb[33×ds16×33]的信号)。

图13.对照蛋白bsscFv[33×ds16]]特异性地并同时结合各自靶抗原。

(A)经由荧光分析检测到bsscFv[33×ds16]对CD33阳性HL-60细胞(i)、CD16-转染的CHO细胞(ii)和CD33和CD16抗原阴性SEM细胞(iii)的特异性结合(灰色峰：对照bsscFv的信号；白色峰：sctb[33×ds16]的信号)。(B)同时结合CD16和CD33。将CD16-转染的CHO细胞与bsscFv[33×ds16]温育并通过添加由CD33的细胞外结构域和DsRed组成的融合蛋白(CD33ex-DsRed)显示同时结合(灰色峰：对照bsscFv的信号；白色峰：bsscFv[33×ds16]的信号)。

图14.sctb[33×ds16×33]和bsscFv[33×ds16]的平衡结合曲线。经由流式细胞术获得平衡结合曲线。将CD33阳性HL-60细胞(左)或CD16-转染的CHO细胞(CHO16-10)(右)与增加浓度的抗体片段温育并用抗His抗体检测。通过Langmuir/Scatchard算法计算K_D值(Benedict等，1997)。(A)sctb[33×ds16×33]，(B)bsscFv[33×ds16]。

图15.由sctb[33×ds16×33]和bsscFv[33×ds16]进行的ADCC剂量依赖的诱导。将CD33阳性肿瘤细胞系HL-60作为靶以40∶1的恒定E∶T细胞比例来比较sctb和bsscFv的效力。sctb[33×ds16×33](实心方形)和bsscFv[33×ds16](空心方形)以剂量依赖的方式触发ADCC。非相关对照sctb(实心圆形)和非相关对照bsscFv(空心圆形)均不诱导显著杀伤。数据点表示裂解的平均百分比±SEM，其从八个不同健康的供体中分离的MNC获得。*与各自同种型抗体比较，ADCC具有统计学显著差异。#由sctb ds[19×16×19]和bsscFv ds[19×16]诱导的杀伤之间的统计学显著差异。

实施例1：串联scFv三联体(三链抗体)的构建

单链Fv三联体(三链抗体；sctb)由具有串联连接的三个scFv的一条单多肽链组成(图1)。优选地末端scFv可对任何肿瘤抗原具有特异性，中央scFv对效应细胞上的任何触发分子，例如NK细胞和巨噬细胞上的CD16(FcγRIII)具有特异性。其他排列也是可能的，以使末端scFv的其中一个可针对效应细胞上的抗原，而其他两个scFv对在肿瘤细胞上表达的抗原具有特异性。

为了产生重组串联单链Fv三联体(sctb)的形式，三个scFv——其中每个包括可变轻链和可变重链，经由20aa接头连接(Krebber等，1997)——必须用柔性接头(例如20aa(G₄S)₄)融合在一起。对于串联单链Fv三联体(三链抗体)的构建，必须将多克隆位点(MCS)连接至合适的表达载体，例如使用适合的限制位点，连接至真核表达载体pSecTag2HygroC(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)。该多克隆位点和产生的载体必须提供用于三个scFv插入的限制位点、接头序列、用于纯化和检测的标记(例如6×His，Strep；c-myc)、分泌前导(例如Igκ链前导序列)以及在选择系统中用于表达所必需的元件，对于真核表达，例如巨细胞病毒(CMV)启动子和多聚腺苷化信号。抗性盒(例如潮霉素C)将有助于产生稳定转化的生产细胞系。上述载体可以是遗传改造的，因为第一scFv可插入作为SfiI盒，第二scFv作为NotI/XhoI盒以及第三scFv作为KasI/EcoRV盒。使用其他限制酶也是可能的。然后，每个scFv可被另一个scFv替换，其提供不同特异性的scFv快速重组的系统(图1)。如必要，应使用二硫键稳定的scFv变体以获得在37℃的高血清稳定性。

在该形式中，针对肿瘤抗原例如CD19的两个scFv可与针对效应子抗原例如CD16的scFv组合，产生sctb[19×16×19]。如必要，可使用聚合酶链反应(PCR)扩增各自scFv，从而使用标准克隆方法引入将它们克隆至载体所需的限制位点(Sambrook&Russel，2001)。

实施例2：串联scFv三联体(三链抗体)的表达和纯化

在使用包括氯喹的磷酸钙技术瞬时转染后，各自串联scFv三联体可在真核细胞中表达，例如293T细胞(Sambrook&Russel，2001)。优选地，生产细胞系通过用编码该串联scFv三联体的线性化的(例如酶FspI，用于载体pSecTag2HygroC的衍生物)载体稳定转染而产生。可通过例如200μg/ml潮霉素C(Carl Roth，Karlsruhe，Germany)选择阳性克隆并随后可被单一化。对于表达，可在永久选择下在小-PERM生物反应器(Greiner Bio-One，Frickenhausen，Germany)中根据制造商说明书用12.5kDa的透析膜培养单克隆稳定转染的真核细胞。含有重组蛋白质的培养基通常必须在两周的时间段中收集4次并在4℃以4000倍过量的含有50mMNaH₂PO₄、300mM NaCl、10mM咪唑、pH 8.0的缓冲液透析。通过例如用镍-氨三乙酸(Ni-NTA)琼脂糖珠(Qiagen)经亲和层析可纯化重组标记的蛋白质并最终用PBS透析。

使用标准方法(Laemmli，1970)通过还原十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)可分析洗脱的蛋白质(例如sctb[19×16×19])。用考马斯亮蓝R250(Sigma-Aldrich，Taufkirchen，Germany)染胶，显示大约M_r＝80-95kDa的蛋白质。在蛋白质印迹分析中，可使用针对各自标记的抗体来检测串联scFv三联体(三链抗体)，例如使用非结合的五-His抗体(Qiagen，Hilden，Germany)和次级辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗小鼠IgG(Dianova，Hamburg，Germany)抗体，或使用HRP结合的Strep标签抗体(IBA，Goettingen，Germany)。使用增强的化学发光剂(Amersham Pharmacia Biotech，Freiburg，Germany)进行蛋白质印迹。

该纯化的sctb可例如用于下列实验：

实施例3：抗体平衡常数(K_D-值)的测定

为了评估第二靶细胞scFv的掺入是否导致亲和性/亲和力的增加，可测定抗体平衡常数(K_D值；获得半最大结合的抗体浓度)。这些可如前所述通过流式细胞术测量(Benedict等，1997；Bruenke等，2004)。应使用CellQuest软件(BectonDickinson，Heidelberg，Germany)，在FACSCalibur设备上进行免疫荧光染色。简言之，在冰上将肿瘤抗原阳性细胞，例如CD19阳性SEM细胞(Greil等，1994)与增加浓度的重组抗体片段温育。洗涤后，可使用适合的抗体例如五-His抗体和藻红蛋白(PE)-结合的山羊抗小鼠IgG(DAKO Diagnostica GmbH，Hamburg，Germany)检测抗体片段。对每个样本收集1×10⁴个细胞并使用适合的散射门分析全部细胞以排除细胞碎片和聚集。将实验重复6次并在将最大荧光强度标准化至100％后，用GraphPad软件(Graph Pad software Inc.，San Diego，CA，USA)，使用非线性衰退曲线拟合，进行数值和绘图分析。应以平均值±平均值标准误差(SEM)报道各组数据。使用未配对Student′s t-试验分析K_D值之间的差异。P-值＜0.05被认为是显著的。同样地，可测量对效应细胞抗原，例如CD16的亲和性。在这些实验中，将串联scFv三联体与单价常规bsscFv(Bruenke等，2004)比较，其中单价常规bsscFv由用于串联scFv三联体构建的相同scFv组成，例如一个CD19-和一个CD16-定向的scFv，其源自相同杂交瘤。如果肿瘤细胞定向的结合部分均是功能性的并促进抗原结合，那么与它的单价负体相比，串联scFv三联体应具有对肿瘤细胞更高的亲和性/亲和力并应显示低纳摩尔范围内的K_D值。优选地，另外scFv的附加N-或C-末端融合应不改变对效应细胞抗原例如CD16的亲和性。对于效应细胞抗原，串联scFv三联体应显示与肿瘤细胞抗原相比4至6倍高的K_D值。因此，该分子的亲和性/亲和力将有望向白血病细胞移动，如所期望的。

实施例4：与相应的双特异性抗体bsscFv相比，串联scFv三联体(三链抗体)的效力。

关于效应细胞例如单核细胞(MNCs)的抗体依赖的细胞毒性(ADCC)诱导，可将串联scFv三联体与bsscFv平行比较。用健康供体的MNC和肿瘤衍生的抗原阳性细胞系进行ADCC分析，其进行三个重复，通过3-小时⁵¹Chr释放分析如所述进行(Elsasser等1996)。以40∶1的恒定效应子与靶(E∶T)的比例，以几个等摩尔5倍连续稀释将抗体衍生物添加至样本，在用Graph-Pad Prism软件通过非线性回归曲线拟合减去背景裂解后，计算EC₅₀值(产生最大获得的肿瘤细胞裂解50％的抗体衍生物浓度)。以至少4不同实验的平均值±SEM报道各组数据。使用配对Student′s t-试验分析各组之间的差异。P-值＜0.05被认为是显著的。

串联scFv三联体能够以剂量依赖方式，以皮摩尔范围的EC₅₀值诱导ADCC并裂解至少三种不同肿瘤衍生的细胞系，例如SEM。在相同条件下，bsscFv抗体也应介导细胞裂解，但是其效力被认为是相当低的。计算的EC₅₀值被期望显著提高并可以是高30至40倍。

如果相应的数据被实验证实，那么其明确地说明在相同实验条件下，与bsscFv相比，串联scFv三联体应显示优异的裂解活性。

实施例5：材料和方法

细胞系和杂交瘤

用人CD16A cDNA表达载体稳定转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞来自J.vande Winkel博士(University Medical Centre，Utrecht，The Netherlands)。4G7杂交瘤(CD19，mIgG1；Meeker等，1984)来自R.Levy博士(Stanford University，Palo Alto，CA，USA)。杂交瘤3G8(FcgRIII、CD16，mIgG1；Fleit等，1982)来自美国典型细胞培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA，USA)。CHO细胞、杂交瘤和B-前体ALL衍生的细胞系SEM(Greil等，1994)、EBV-转化的B-类淋巴母细胞系ARH-77(ATCC)、T-ALL衍生的细胞系CEM(ATCC)和前-B表型的细胞系BV-173(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures，DSMZ，Braunschweig，Germany)和ML-衍生的细胞系HL-60(ATCC)培养在Roswell ParkMemorial Institute(RPMI)1640Glutamax-I培养基中(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)，其含有10％胎牛血清(FCS；Invitrogen)、100单位/ml青霉素(Invitrogen)和100μg/ml链霉素(Invitrogen)。人胚胎肾293T细胞(ATCC)培养在Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium(DMEM)Glutamax-I培养基(Invitrogen)中，其添加10％FCS、分别为100单位/ml和100μg/ml的青霉素和链霉素。

重组串联scFv三联体(scFv三联体或三链抗体；sctb)和融合蛋白的构建

将埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)菌株XL-1 blue(Stratagene，Amsterdam，The Netherlands)用作宿主用于质粒的扩增和克隆。为了产生sctb ds[19×16×19]的表达载体，将编码CD19 scFv的二硫键稳定的(ds)变体的cDNA从载体pSecTag2HygroC-Strep-dsCD19 4G7xdsCD16(Bruenke等，2005)上切除并以SfiI盒克隆至载体pSecTag2HygroC(Invitrogen)的衍生物，产生载体pSecTag2HygroC-Strep-ds19。为了构建pSecTag2HygroC-Strep-ds19xds16xds19，从pSecTag2HygroC-Step-dsCD19 4G7xdsCD16通过PCR扩增编码scFv dsCD16和scFv dsCD19的序列，并分别使用NotI/XhoI和XhoI/AgeI限制位点连接至pSecTag2HygroC-Strep-ds19。使用等同限制位点，通过用编码CD7 scFv TH69的序列替代CD19 scFv的编码序列，构建表达载体pSecTag2HygroC-Strep-7xds16x7(Peipp等，2002)。用于对照bsscFv[7×ds16]的表达载体——pSecTag2HygroC-Strep7xds16，通过用作为SfiI片段的编码scFv TH69的序列替代在pSecTag2HygroC-Strep ds CD19 4G7xdsCD16中编码CD19scFv的序列而产生。

为了构建sctb[33×ds16×33]的表达载体，将CD33 scFv的编码序列从载体pet27b(+)-Strep-His-CD33-ETA-KDEL(Schwemmlein等，2006)上切除并以SfiI盒克隆至载体pSecTag2HygroCStrep-ds19xds16xds19，替代N-末端CD19scFv的编码序列，并产生pSecTag2HygroCStrep 33×ds16xds19。为了产生载体pSecTag2HygroC-Strep 33×ds16×33，从pet27b(+)-Strep-His-CD33-ETA-KDEL通过PCR扩增编码CD33scFv的序列，并使用XhoI/EcoRV限制位点，连接至pSecTag2HygroCStrep 33×ds16xds19，替代C-末端CD19scFv的编码序列。

通过用作为SfiI片段的编码CD33scFv的序列来替代在pSecTag2HygroC-Strep dsCD194G7xdsCD16中编码dsCD19scFv的序列，产生对照bsscFv[33×ds16]的表达载体，pSecTag2HygroC-Strep 33×ds16。

为了构建CD33ex-DsRed融合蛋白的表达载体，从载体pSecTag-ChCD33-Fc通过PCR扩增编码CD33细胞外结构域的cDNA(Schwemmlein等，2006)，并作为SfiI盒连接至载体pSEC标记Hygro-DsRed(Peipp等，2003)。

为了证实正确的构建，在Applied Biosystems automated DNA测序仪(ABI Prism310Genetic Analyzer；Perkin-Elmer，Ueberlingen，Germany)上对最终构建体进行测序(Sambrook和Russel，2001)。

重组抗体片段和融合蛋白的表达和纯化

为了表达重组单链Fv三联体sctb ds[19×16×19]、sctb[33×ds16×33]和sctb[7xds16x7]，使用包括氯喹的磷酸钙技术，用各自表达载体转染293T细胞(Sambrook和Russel，2001)。在使用被限制酶FspI线性化的各自载体转染后，获得每个构建体的稳定生产细胞系。在存在200μg/ml潮霉素B(Roth，Karlsruhe，Germany)的情况下，选择阳性克隆，并通过有限稀释分离单个细胞克隆。通过流式细胞术对上清液中抗体片段的存在进行分析。对于高级表达，可在永久选择下在小-PERM生物反应器(Greiner Bio-One，Frickenhausen，Germany)中根据厂商说明书，使用具有对应蛋白质≤12.5kDa的孔径的膜培养细胞克隆，并对含有重组蛋白质的培养基在两周的时间段中收集4次。通过用镍-氨三乙酸(Ni-NTA)琼脂糖珠(Qiagen)经亲和层析纯化重组His标记的蛋白质，如所述(Bruenke等，2005)，并最终用磷酸缓冲盐(PBS)透析。

在相同条件下，平行产生和纯化用作对照的相应的双特异性scFv片段：bsscFvds[19×16]、bsscFv[33×ds16]和bsscFv[7×ds16]。将与绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白质DsRed的融合蛋白在293T细胞中表达并纯化，如前所述(Bruenke等，2004)。

SDS-PAGE和蛋白质印迹分析

通过标准方法进行SDS-PAGE(Sambrook和Russel，2001)。在蛋白质印迹实验中，用对Strep标记具有特异性的辣根过氧化物酶(HRP)-结合的抗体(IBA，Goettingen，Germany)或非结合的五-His抗体(Qiagen，Hilden，Germany)以及次级HRP-偶联的山羊抗小鼠IgG抗体(Dianova，Hamburg，Germany)检测重组蛋白。使用增强的化学发光剂(Amersham Pharmacia Biotech，Freiburg，Germany)进行蛋白质印迹。

流式细胞分析

如所述，使用CellQuest软件(Becton Dickinson，Heidelberg，Germany)在FACSCalibur设备上进行免疫荧光分析(Bruenke等，2004)。简言之，对每个样本收集1×10⁴个细胞并使用适合的散射门分析全部细胞以排除细胞碎片和聚集。使用五-His抗体和藻红蛋白(PE)-结合的山羊抗小鼠IgG抗体(DAKO DiagnosticaGmbH，Hamburg，Germany)检测重组抗体片段，除非另有说明。

平衡常数(K_D)的测定

如所述，使用基于流式细胞术的方法测定K_D值(Bruenke等，2004；Benedict等，1997)。将最高平均荧光值设定为100％并将所有数据点标准化。将实验重复4至7次并报告平均值。使用非线性回归曲线拟合计算K_D值。

细胞表面保留分析

在阻止抗原内化的条件下，用公开的方法进行细胞表面保留分析(Adams，等，1998)。简言之，将4×10⁶个CD19阳性的SEM或CD16-转染的CHO细胞在冰上与10μg/ml的sctb ds[19×16×19]或bsscFv ds[19×16]温育1h。用12ml的冷FACS缓冲液(0.154M氯化钠、10mM磷酸钠、1％牛血清白蛋白、0.1％叠氮化钠、pH7.2)将细胞洗涤两次，然后通过离心收集。将细胞重悬于4ml FACS缓冲液并在37℃温育。在几个时间点，再次洗涤细胞以去除解离的分子并重悬于FACS缓冲液。取出0.5×10⁶细胞等分试样，置于冰上5分钟并再次洗涤。然后使用Alexa Fluor555结合的抗-His抗体(Qiagen)，通过FACS检测保留在细胞表面上的分子。将所有数据点标准化至时间点t₀＝100％。将实验进行3次和报告平均值。然后，通过将数据拟合至单阶指数衰减获得细胞表面保留的半衰期值。

竞争性抑制分析

在冰上将SEM细胞与以0.5μg/ml饱和浓度的单克隆抗体(mAb)4G7单独温育或在存在变化浓度的sctb ds[19×16×19]或bsscFv ds[19×16]作为抑制剂的情况下温育。洗涤后，通过流式细胞术，用PE标记的山羊抗小鼠IgG抗体(DAKODiagnostica)在细胞上检测mAb 4G7。mAb 4G7结合的相对抑制如下计算：％抑制＝[(不含抑制剂的％FI-含有抑制剂的％FI)/(不含抑制剂的％FI)]×100(FI，荧光强度)。将实验进行5次并报告平均值。使用S形剂量反应曲线拟合计算IC₅₀值(产生mAb 4G7结合的50％抑制的抑制剂浓度)。

从人供体分离MNC和恶性白血病和淋巴瘤细胞

在得到正式同意并经艾尔兰根-纽伦堡大学伦理委员会(Ethics Committee ofthe University of Erlangen-Nuremberg)批准后，从健康的志愿者和白血病或淋巴瘤患者获得柠檬酸缓冲的或肝素化的外周血(PB)和骨髓(BM)样本。通过Lymphoflot(Biotest，Dreieich，Germany)Ficoll密度离心在Leukosep管(Greiner，Frickenhausen，Germany)中根据厂商说明书富集MNC，并悬浮在RPMI 1640 Glutamax-I培养基中，其含有10％FCS和分别为100单位/ml和100μg/ml的青霉素和链霉素。通过台盼蓝排除法证实存活率，其超过95％。通过用PE-结合的CD19抗体(BDBiosciences，Heidelberg，Germany)染色，分析患者衍生样本的CD19表达。用单克隆CD33小鼠抗体(Dako Cytomation，Glostrup，Denmark)评估AML母细胞上CD33的表达，用多克隆PE-结合的山羊抗小鼠IgG抗体(Dako Cytomation，Glostrup，Denmark)和流式细胞术检测。

ADCC反应

使用来自健康供体的MNC作为效应细胞进行ADCC分析，其进行三个重复，使用3小时⁵¹Cr释放分析如所述进行(Elsasser等，1996)。对于封闭实验，以125倍摩尔过量添加亲本抗体4G7和3G8。以40∶1的恒定效应子与靶(E∶T)的比例，使用各自抗体片段的几个等摩尔5倍连续稀释，记录剂量反应曲线。将MNC单独诱导的背景裂解从每个数据点减去，并通过使用S形剂量反应曲线拟合计算EC₅₀值(产生50％的最大特异性裂解的抗体片段浓度)。将实验重复4至7次并报告平均值。

体外血清稳定性的测量

以2.5μg/ml的亚饱和浓度以总体积220μl在37℃在人血清中温育sctbds[19×16×19]。通过流式细胞术在不同时间点测定残余结合活性。将时间点t₀设定为100％并将所有数据针对该值标准化。将实验进行7次和报告平均值。从一阶指数衰减曲线拟合计算每个结合位点的半衰期值。

小鼠体内血浆半衰期的测定

根据联邦和欧洲指导进行动物饲养和所有实验并已经得到大学和政府机构批准。NOD-SCID小鼠(雄性，12周，重量在20至25g之间，4只小鼠/组)接受静脉注射200μl PBS总体积中0.7nmol sctb ds[19×16×19](60μg)或bsscFv ds[19×16](40μg)或单独PBS。在各种时间点，获取血液样本(50-100μl)。使用BD MicrotainerSST^TM管(Becton Dickinson)制备血清并储存在-20℃。使用CD19阳性SEM和CD16-转染的CHO细胞，用Alexa Fluor 555结合的抗五-His抗体(Qiagen)，通过流式细胞术检测血清中的保留的抗体片段的残余免疫反应水平。将在第一时间点(1分钟)获得的值设定为100％。使用一阶指数衰减曲线拟合计算血浆半衰期。

绘图和统计分析

使用Graph Pad Prism软件(Graph Pad Software Inc.，San Diego，CA，USA)进行绘图和统计分析。以平均值±平均值标准误差(SEM)报道各组数据。使用未配对(或如果适合)或配对Student’s t-试验分析各组之间的差异。P-值＜0.05被认为是显著的。

实施例6：串联scFv三联体(三链抗体)sctb ds[19×16×19]的构建、表达和纯化

从以前公开的二硫键-稳定的对CD19和CD16具有特异性的scFv组分构建sctb ds[19×16×19](Bruenke等，2005，图2A)。两个末端scFv对淋巴肿瘤抗原CD19具有特异性，中央scFv对NK细胞和巨噬细胞上的触发分子CD16具有特异性。在稳定转染的人293T细胞中产生sctb ds[19×16×19]和用于比较的bsscFvds[19×16]，并通过亲和层析从培养基中纯化，其中细胞培养在小-PERM生物反应器中。每种纯化蛋白质的产量在不同生产轮次中以每升培养基3-10mg范围变化。在SDS-PAGE实验中，sctb ds[19×16×19]具有相应于M_r为大约90kDa的电泳迁移率，其与由它的序列预测的88.6kDa的值紧密一致(图2B)。在非还原SDS-PAGE实验中，没有观察免疫反应降解产物(图3C)和未检测到共价蛋白质聚集(数据未显示)。

将该纯化的sctb ds[19×16×19]用于下列实验：

实施例7：sctb ds[19×16×19]的特异和同时抗原结合

将sctb ds[19×16×19]与未处理(intact)细胞上的CD19和CD16反应，如它的特异性结合细胞的能力所表明，所述细胞分别表达这些抗原中的每种(图3A)。为了排除蛋白质制备物由分子的两个亚群组成的可能性，其中每个亚群均能够仅结合这些抗原其中之一，分析同时结合两个抗原的能力(图3B)。为获得该效果，使用CD16细胞外结构域和GFP之间的重组融合蛋白，称为CD16ex-GFP，并为了比较，使用由CD64细胞外结构域和GFP组成的类似融合蛋白，称为CD64ex-GFP(Bruenke等，2005)。首先将CD19阳性白血病-衍生的SEM细胞与sctbds[19×16×19]温育，然后与CD16ex-GFP反应。结果，观察到强的细胞结合荧光信号，表明重组蛋白质能够同时结合细胞-结合的CD19和流动相CD16ex。当将CD7-阴性SEM细胞与类似产生的对照sctb[7×ds16×7]或对照蛋白CD64ex-GFP温育时，没有获得荧光信号(数据未显示)。在竞争-结合实验中已建立结合特异性。当添加过量的亲本CD19抗体mAb 4G7或亲本CD16抗体mAb 3G8时，荧光信号的强度降低至基线水平，但是在添加非相关IgG1同种型对照后，信号没有降低(图3B)。

实施例8：sctb ds[19×16×19]与bsscFv ds[19×16]结合能力的比较

为了评估在sctb中针对靶细胞抗原的第二scFv-组分的掺入是否引起对CD19亲和力的增加，进行三个独立实验。首先，测定sctb ds[19×16×19]和bsscFv ds[19×16]的平衡常数(K_D)。通过校准的流式细胞术记录两个分子的平衡结合曲线，并衍生出K_D值(图4A)。sctb ds[19×16×19]对CD19具有13.0±1.2nM的总K_D，而bsscFv ds[19×16]的亲和性比其低大约3倍：K_D＝42.4±5.7nM(P＝0.0048)。因此，完整sctb ds[19×16×19]对CD19的亲和力比包含在bsscFv ds[19×16]中的单价CD19特异scFv的亲和性高大约3倍，表明两个CD19特异scFv组分是功能性的并负责在未处理细胞上sctb ds[19×16×19]对CD19的总亲和力。相反，CD16特异的scFv的亲和性保持不变，其与该组分是否在bsscFv ds[19×16]中携带无关，其中仅其N-末端连接，或在ds[19×16×19]中，它在两个末端被CD19 scFvs连接。sctbds[19×16×19]和bsscFv ds[19×16]对CD16的K_D值分别为58.6±4.0nM和57.6±8.9nM(P＝0.772)。因此，结合CD19的3倍增加是真实的亲和力作用，并且在该形式中，两个末端定位的CD19特异的scFv必须贡献于sctb ds[19×16×19]对靶细胞表面抗原的总亲和力。

第二独立实验提供对要求(声称)的另外的支持，所提要求为对于CD19，sctbds[19×16×19]具有比bsscFv ds[19×16]更高的亲和力。在竞争结合实验中，首先将CD19阳性SEM细胞与亲本CD19抗体mAb 4G7温育，然后添加增加的量的sctbds[19×16×19]或bsscFv ds[19×16]作为竞争剂，并测定mAb 4G7与细胞的残余结合(图4B)。sctb ds[19×16×19]和bsscFv ds[19×16]以浓度依赖方式竞争性抑制mAb4G7的结合，通过添加450倍摩尔过量的sctb ds[19×16×19]，将结合抑制到＞95％。为了比较两个构建体，测定IC₅₀值，即达到半最大抑制的浓度。sctb ds[19×16×19]和bsscFv ds[19×16]的IC₅₀值分别为81.3±1.2nM和287.5±1.3nM(P＝0.013)。因此，为获得半最大抑制，需要bsscFv ds[19×16]的浓度高于sctb ds[19×16×19]浓度大约3.5倍。该值非常接近亲和力的3倍差异，因此，独立测量互相证实并支持在sctb ds[19×16×19]的总亲和力上大约3倍的提高的要求(声称)。

在第三独立实验中，在37℃，测量在未处理的CD19阳性SEM细胞上sctbds[19×16×19]和bsscFv ds[19×16]的细胞表面保留。在该实验中，在存在叠氮化钠的情况下，分别用sctb ds[19×16×19]或bsscFv ds[19×16]修饰SEM细胞，以阻止内化。通过离心去除过量的未结合分子，然后在37℃温育细胞。在不同时间点，再次使细胞沉淀以去除释放的分子并通过流式细胞术测定保留的细胞结合分子。在这些条件下，bsscFv ds[19×16]以保留t_1/2为7.7±0.5分钟从表面释放，sctbds[19×16×19]以t_1/2为51.5±2.9分钟从表面释放(P＝0.006；图4C)。在CD16阳性细胞上由CD16产生的两个构建体之一的细胞表面保留未观察到统计学上的显著差异(数据未显示)。由CD16产生的bsscFv和sctb ds[19×16×19]的保留t_1/2值分别为14.5±1.9分钟和15.5±1.2分钟(P＝0.848)。总之，这些三个独立实验对两个CD19特异scFv组分均贡献于sctb ds[19×16×19]总亲和力的结论提供强有力的支持。

实施例9：由sctb ds[19×16×19]介导的白血病-衍生的细胞系的ADCC

首先对pro-B ALL衍生的细胞系SEM测量与来自健康的人供体的效应细胞组合，sctb ds[19×16×19]介导人白血病细胞的ADCC的能力。用来自不相关健康供体的新鲜制备的未刺激的MNC进行ADCC反应。结果，sctb ds[19×16×19]介导有效肿瘤细胞裂解，但是对CD7和CD16具有特异性的对照sctb无效(图5A；SEM细胞是CD7-阴性)。而且，亲本抗体mAb 4G7(CD19)和MAb 3G8(CD16)不能诱导ADCC。为了测试裂解的抗原特异性，进行竞争实验。125倍过量的亲本mAb4G7或3G8的添加显著降低靶细胞裂解程度(分别为P＝0.011和0.004)，而非相关IgG1同种型抗体的添加没有影响(P＝0.45；图5A)。因此，肿瘤细胞裂解是抗原特异的，并且sctb ds[19×16×19]要求肿瘤细胞上的靶抗原与效应细胞上的触发分子之间特异的相互作用以介导它的裂解作用。另外，sctb ds[19×16×19]通过ADCC以宽范围的效应子-对-靶细胞(E∶T)比例，从80∶1至2.5∶1范围变化，来诱导靶细胞裂解(图5B)。裂解程度随E∶T比例以可饱和的方式增加，表明肿瘤细胞裂解对效应细胞的明确依赖性。该作用是抗原特异的，因为对CD7具有特异性的类似构建的对照sctb不产生显著裂解，即使在高E∶T比例也不产生。

实施例10：与相应的双特异性抗体bsscFv ds[19×16]相比，串联scFv三联体(三链抗体)sctb ds[19×16×19]的效力。

为研究sctb ds[19×16×19]对CD19的亲和力高于bsscFv ds[19×16]对CD19的亲和力是否与增强的细胞毒素潜能相关，对三个不同CD19阳性肿瘤衍生的细胞系平行测量两种分子介导ADCC的能力。选择细胞系SEM、BV-173和ARH-77，原因在于它们代表不同的B-淋巴恶性肿瘤和B-淋巴成熟的不同阶段。SEM细胞代表高危原B-ALL。BV-173代表具有混合谱系表型的B细胞前体白血病(CD19和CD33双阳性)，其通常具有较差的预后。ARH-77代表EBV阳性B-类淋巴母细胞系。所有三个系被sctb ds[19×16×19]和bsscFv ds[19×16]以浓度依赖方式有效消除(图6)。在所有三种情况下，sctb ds[19×16×19]比bsscFv ds[19×16]更有效，但是即使在高浓度，CD7特异的对照sctb和bsscFv仍保持无效(图6，A-C)。EC₅₀值显示于表I中；sctb ds[19×16×19]和bsscFv ds[19×16]对于SEM细胞的EC₅₀值分别为4.1pM和113.6pM。获得的sctb的EC₅₀值在低的皮摩尔范围，其表明非常高的效价。重要地是，对于相同靶细胞系，在比bsscFv ds[19×16]低27.7倍的浓度，sctb ds[19×16×19]获得相同的ADCC水平。类似地，对于细胞系BV-173和ARH-77，sctb ds[19×16×19]以比bsscFv ds[19×16]低26.3倍和44.0倍的浓度产生半最大裂解，这表明sctb相对于bsscFv的亲和力增加转化为ADCC-潜能的显著增加。

表I：采用MNC^a，sctb ds[19×16×19]和bsscFv ds[19×16]对ADCC的EC₅₀值

^aEC₅₀值从显示于图6A-C和7B中的剂量反应曲线推断(CI：置信区间)。

最后，在平行ADCC反应中还测量两种蛋白质介导来自患者的新鲜恶性细胞的消除的能力(图7)。为了该作用，从11名患者的外周血(PB)或骨髓(BM)中分离MNC。这些患者中的九名被诊断为患有B-CLL、一名被诊断为患有套细胞淋巴瘤(MCL)、一名被诊断为患有B-ALL。将来自不相关健康供体的MNC用作效应细胞，对每个患者样本提供一个供体。不进行深思熟虑的的工作来匹配肿瘤细胞和供体的组织相容性类型和杀伤细胞Ig样受体(KIR)模式。以E∶T比例为40∶1使用MNC并以浓度为1nM使用sctb ds[19×16×19]和bsscFv ds[19×16]。对于所有十一名患者，相对于对照反应，sctb ds[19×16×19]介导特异肿瘤细胞裂解程度的明显增强，其中对照反应不含有添加的抗体-衍生剂或含有非相关对照sctb(图7A)。对于所有十一个样本，sctb ds[19×16×19]均产生高于bssFv ds[19×16]的特异靶细胞裂解。对于四名B-CLL患者(患者1-4)，在至少三个单独实验中记录剂量反应曲线，对于每个患者样本以40∶1的E∶T比例使用来自至少三个不同健康供体的MNC。对于所有四名患者，在等摩尔浓度，sctb ds[19×16×19]均介导显著高于bsscFv ds[19×16]的ADCC(图7B)。所有四名患者的sctb ds[19×16×19]和bsscFv ds[19×16]的EC₅₀值总结于表I中。在所有情况下，sctb ds[19×16×19]在比bsscFv ds[19×16]低大约11至21倍的浓度产生半最大裂解，其类似于白血病-衍生的靶系观察到的作用(图6)。sctb ds[19×16×19]的EC₅₀值仍在低的皮摩尔范围。在所有情况下，sctb ds[19×16×19]和bsscFv ds[19×16]之间裂解能力的差异是统计学显著的，其P-值＜0.05。这些结果明确地表明，sctb的该形式与各自bsscFv相比具有诱导肿瘤细胞裂解的优异潜能。

实施例11：小鼠中sctb ds[19×16×19]延长的体内血浆保留。

另一个影响抗体-衍生的蛋白质的治疗值的重要参数是它们体内血浆保留时间或血浆半衰期。为测量该参数，将等摩尔剂量的sctb ds[19×16×19]和bsscFvds[19×16]分别静脉注射至NOD-SCID小鼠。在注射后的不同时间点获得血浆样本，并通过流式细胞术测量对CD19阳性SEM细胞上的CD19的残余结合能力(图8A)和对在CD16阳性CHO-转染子上的CD16的残余结合能力(图8B)。sctbds[19×16×19]和bsscFv ds[19×16]的血浆保留时间(t_1/2)分别为4h和2h，表明第二CD19特异scFv掺入至sctb导致体内血浆保留时间的加倍。

实施例12：在37℃测量体外血清稳定性

影响抗体-衍生的蛋白质治疗效力的一个重要因素是它们在人血清中的稳定性。为测量该性质，在37℃将纯化的sctb ds[19×16×19]在人血清中体外温育，并通过FACS-分析分别测量在未处理细胞上与CD19(图9A)和CD16(图9B)的残余结合。测定t_1/2值。在这些条件下，sctb ds[19×16×19]高度稳定，其对结合CD19和CD16分别具有94.0±3.1h和153.1±4.6h的t_1/2。因此，sctb ds[19×16×19]具有比非稳定的bsscFv[19×16]更高的稳定性，非稳定的bsscFv[19×16]对结合CD19和CD16的t_1/2分别为18h和40h，如Bruenke等，2005中报道。

实施例13：sctb ds[33×ds16×33]和bsscFv[33×ds16]的构建和表达

从以前公开的对CD33具有特异性的scFv组分(Schwemmlein等，2005)构建sctb[33×ds16×33](图10)和bsscFv[33×ds16](图11)。在稳定转染的人293T细胞中产生sctb ds[33×ds16×33]和用于比较的bsscFv[33×ds16]，其中细胞培养在小-PERM生物反应器中。通过亲和层析从培养基中纯化重组蛋白质。每种纯化蛋白质的产量在每升培养基2-6mg范围内变化。在SDS-PAGE实验中，sctb[33×ds16×33]和bsscFv[33×ds16]具有相应于M_r分别为约90kDa和60kDa的电泳迁移率，其与从它们的序列计算的sctb[33×ds16×33]为86,5kDa(图10)以及bsscFv[33×ds16](图11)为59,8kDa的值紧密一致。

实施例14：sctb[33×ds16×33]和bsscFv[33×ds16]的特异和同时抗原结合

将sctb[33×ds16×33](图12A)和bsscFv[33×ds16](图13A)与未处理细胞上的骨髓肿瘤抗原CD33和触发分子CD16反应，如它能够特异性结合分别表达这些抗原中的每种的细胞。为了证实蛋白质能够同时结合两种抗原，首先将CD16阳性细胞与sctb[33×ds16×33](图12B)或bsscFv[33×ds16](图13B)温育，然后与由CD33细胞外结构域和DsRed组成的融合蛋白CD33ex-DsRed反应。结果，观察到强的红色细胞结合荧光信号，表明重组蛋白质能够同时与细胞结合的CD16和流动相CD33ex反应。

实施例15：平衡常数测定

为了评估在sctb中针对靶细胞抗原的第二scFv-组分的掺入是否引起对CD33亲和力的增加，测定sctb[33×ds16×33]和bsscFv[33×ds16]的平衡常数(K_D)。通过校准的流式细胞术对两种抗原记录平衡结合曲线，由该平衡结合曲线得到两种蛋白质的K_D值(图14)。K_D值总结于表II中。Sctb[33×ds16×33]和bsscFv[33×ds16]与CD33反应，其K_D值分别为28.9±1.9nM和7.9±1.1nM。因此，sctb[33×ds16×33]对CD33的亲和力比bsscFv[33×ds16]中含有的CD33特异的scFv的亲和性高大约3-4倍。这表明两个CD33特异scFv部分是功能性的并负责结合在未处理细胞上的CD33。相反，CD16特异的scFv的亲和性在相同范围。sctb[33×ds16×33]和bsscFv[33×ds16]对CD16的K_D值分别为45.1±4.3nM和34.2±2.3nM。因此，在该形式中，两个末端定位的CD33特异的scFvs贡献于sctb[33×ds16×33]对肿瘤细胞上细胞表面抗原的总亲和力。

表II：bsscFv[33×ds16]和sctb[33×ds16×33]的平衡常数

 抗原(细胞系)bsscFv[33×ds16]的K_D[nM](SEM)sctb[33×ds16×33]的K_D[nM](SEM) CD33(HL-60)  28,9(±1,9)  7,9(±1,1) CD16(CHO 16-10)  35,3(±2,2)  45,1(±4,3)

实施例16：与相应的双特异性抗体bsscFv[33×ds16]相比，串联scFv三联体(三链抗体)sctb ds[33×ds16×33]的效力。

为了分析sctb[33×ds16×33]对CD33的亲和力高于bsscFv[33×ds16]对CD33的亲和力是否引起增加的细胞裂解潜能，平行测量两种抗体片段诱导ADCC的效力。将CD33阳性早幼粒细胞白血病-衍生的肿瘤细胞系HL-60用作靶以比较sctb和bsscFv。以40∶1的恒定E∶T细胞比例，将来自健康供体的MNC用作效应细胞。Sctb[33×ds16×33]和bsscFv[33×ds16]以剂量依赖方式触发ADCC，但是即使在高浓度，CD7特异的对照sctb和bsscFv仍保持无效。但是，sctb[33×ds16×33]比bsscFv[33×ds16]更有效(图15)。sctb[33×ds16×33]和bsscFv[33×ds16]对HL-60细胞的EC₅₀值分别为21pM和174pM(p＝0,018)。重要的是，对于相同靶细胞系，sctb[33×ds16×33]以低于bsscFv[33×ds16]8倍的浓度产生半最大杀伤，这表明sctb相对于bsscFv的亲和力增加转化为细胞毒素潜能的显著增加。

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