使用重组微生物制备(S)-3-羟丁酸和(S)-3-羟丁酸酯的方法

摘要

本发明提供了一种使用突变的微生物合成光学活性(S)-3-羟丁酸和(S)-3-羟丁酸酯的方法。更具体地说，本发明提供了用于制备(S)-3-羟丁酸的突变的微生物，用编码β-酮硫解酶的基因、编码(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因和编码酰基辅酶A水解酶的基因转化该微生物；使用突变的微生物制备(S)-3-羟丁酸的方法；用于制备(S)-3-羟丁酸酯的突变的微生物，用编码β-酮硫解酶的基因、编码(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因、编码酰基辅酶A水解酶的基因和编码脂肪酶的基因转化该微生物；以及使用突变的微生物制备(S)-3-羟丁酸酯的方法。因此，可以通过简单的过程由在微生物的糖酵解中产生的乙酰辅酶A制备具有高光学纯度的(S)-3-羟丁酸，该过程包括通过引入到微生物中的重组基因操纵代谢途径而不用使用昂贵的金属催化剂或底物。此外，(S)-3-羟丁酸酯和(S)-3-羟丁酸酯的内酯可以由通过上述方法制备的(S)-3-羟丁酸使用脂肪酶简单的制成。

说明书

技术领域

本发明涉及一种使用重组微生物制备光学活性(S)-3-羟丁酸和(S)-3-羟丁酸酯的方法。更具体地说，本发明涉及：一种用于制备(S)-3-羟丁酸的重组微生物，用编码β-酮硫解酶的基因、编码(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因和编码酰基辅酶A水解酶的基因转化该微生物；一种使用所述重组微生物制备(S)-3-羟丁酸的方法；一种用于制备(S)-3-羟丁酸酯的重组微生物，用编码β-酮硫解酶的基因、编码(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因、编码酰基辅酶A水解酶的基因和编码脂肪酶的基因转化该微生物；以及一种使用所述重组微生物制备(S)-3-羟丁酸酯的方法。

背景技术

(S)-3-羟丁酸和(S)-3-羟丁酸酯是十分有效的手性中间体，并具有广泛的应用，如在塑料、芳烃、医药和农药领域中(Speciality Chemicals Magazine，April：39，2004)。例如，它们可以用来合成(S)-1，3-丁二醇、用于通过还原乙基-(S)-3-羟丁酸酯制备多种抗生素和信息素的中间体(T.Ferreira等，Tetrahedron，46：6311，1990)，并且还可用作除草剂(S)-食菌甲诱醇((S)-sulcatol)的前体(K.Mori等，Tetrahedron，37：1341，1981)、b-内酰胺类抗生素碳青霉烯(Carbapeneme)的前体(T.Chiba等，Chemistry letters，16：2187，1987)，以及维生素样营养物L-肉毒碱的前体(B.N.Zhou等，Journalof American Chemical Society，105：5925，1983)。

有制备酯的传统方法，如用催化剂二膦化钌对前手性前体3-酮酸酯的非对称还原氢化作用(R.Noyori等，Journal of the American Chemical Society，109：5856，1987)，但这种方法需要非常昂贵的金属催化剂、纯底物和非常高的压力反应器。此外，使用酵母作为全细胞催化剂通过生物催化还原b-酮酸酯生产的(S)-3-羟丁酸乙酯(产率58％且光学纯度为94％ee)由于在微生物中存在的各种氧化还原酶而表现出低光学活性(Tetrahedron Letters，34：3949，1993)。

据报道，光学活性(R)-3-羟基烷酸酯是通过操纵微生物的代谢途径由葡萄糖生物合成的(Lee等，Biotechnol Bioeng，65：363，1999；Lee和Lee.，ApplEnvron Microbiol，69：1295，2003；Gao等，FEMS Microbiol Lett，213：59，2002)。有两条路线生产(R)-3-羟基烷酸酯：一是可生物降解的聚合物(多羟基烷酸酯)的自溶(Lee等，Biotechnol Bioeng，65：363，1999；Lee和Lee.，ApplEnviron Microbial，69：1295，2003)；另一种是从由葡萄糖合成的(R)-3-羟基烷酰辅酶A中移除辅酶A，而不是可生物降解聚合物的自溶，以制备(R)-3-羟基烷酸酯(Gao等，FEMS Microbiol Lett，213：59，2002)。在第二路线中，(R)-3-羟丁酰辅酶A是使用β-酮硫解酶(PhaA)和(R)-3-羟丁酰辅酶A还原酶(PhaB)由葡萄糖制备，然后使用磷酸转丁酰酶(ptb)和丁酸激酶(BuK)从(R)-3-羟丁酰辅酶A中移除辅酶A(Gao等，FEMS Microbiol Lett，213：59，2002)。

虽然已报道了用于制备光学活性(S)-3-羟丁酸酯的化学和生物催化路线，但是通过操纵微生物的代谢途径由葡萄糖生物合成制备光学活性(S)-3-羟丁酸和(S)-3-羟丁酸酯的路线还未见报道。

因此，本发明者试图生物合成光学活性(S)-3-羟丁酸和(S)-3-羟丁酸酯，并最终发现，通过简单的过程由在微生物的糖酵解中产生的乙酰辅酶A生物合成具有高光学纯度的(S)-3-羟丁酸和(S)-3-羟丁酸酯，该过程包括通过引入到微生物中的重组基因操纵代谢途径而不用使用昂贵的金属催化剂或底物。他们的这一发现导致本发明。

发明内容

【技术问题】

本发明旨在提供用于制备(S)-3-羟丁酸的重组微生物和包括培养所述重组微生物的制备(S)-3-羟丁酸的方法。

本发明进一步旨在提供用于制备(S)-3-羟丁酸酯的重组微生物和包括培养所述重组微生物的制备(S)-3-羟丁酸酯的方法。

【技术方案】

一方面，本发明提供了用于制备(S)-3-羟丁酸的重组微生物，用编码β-酮硫解酶的基因、编码(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因和编码酰基辅酶A水解酶的基因转化该微生物。

另一方面，本发明提供了用于制备(S)-3-羟丁酸的重组微生物，用编码β-酮硫解酶的基因、编码(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因、编码磷酸转丁酰酶(ptb)的基因和编码丁酸激酶(Buk)的基因转化该微生物。

还一方面，本发明提供了制备(S)-3-羟丁酸的方法，其特征在于培养所述重组微生物。

又一方面，本发明提供了制备(S)-3-羟丁酸的方法，其特征在于使所述重组微生物的培养物或细胞提取物与选自乙酰辅酶A、乙酰乙酰辅酶A和(S)-3-羟丁酰辅酶A中的底物反应。

再一方面，本发明提供了用于制备(S)-3-羟丁酸酯的重组微生物，用编码β-酮硫解酶的基因、编码(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因、编码酰基辅酶A水解酶的基因和编码脂肪酶的基因转化该微生物。

还一方面，本发明提供了制备(S)-3-羟丁酸酯的方法，其特征在于培养所述重组微生物。

【有益效果】

本发明提供了通过简单的过程由在微生物的糖酵解中产生的乙酰辅酶A生物合成具有高光学纯度的(S)-3-羟丁酸和(S)-3-羟丁酸酯的方法，该过程包括通过引入到微生物中的重组基因操纵代谢途径而不用使用昂贵的金属催化剂或底物。

附图说明

图1显示了(S)-3-HB的生物合成途径。

图2显示了(S)-3-HB的生物合成途径。

图3显示了(S)-3-HB酯的合成途径。

图4显示了pTacReA-HBD系列载体的酶切图谱。

图5显示了pET21aBCH系列载体的酶切图谱。

图6显示了pK28BCH、pET28bBCH系列载体的酶切图谱。

图7显示了pET21aHBD和pK21HBD系列载体的酶切图谱。

图8显示了通过根据本发明制备的(S)-3-HB的甲基化作用得到的GC-MSD分析结果。

图9显示了通过根据本发明制备的(S)-3-HB的甲基化作用的手性分析结果。

图10显示了当(S)-3-HB通过根据本发明的补料分批培养制备时的时间图表。

具体实施方式

如式1所示，由本发明的方法制备的(S)-3-羟丁酸是与(R)-3-羟丁酸具有不同手性的光学活性化合物。

[式1]

(R)-3-羟丁酸    (S)-3-羟丁酸

为制备(S)-3-羟丁酸，提供了用编码β-酮硫解酶的基因、编码(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因和编码酰基辅酶A水解酶的基因转化的重组微生物。

根据本发明，用编码β-酮硫解酶的基因、编码(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因和编码酰基辅酶A水解酶的基因转化的重组微生物通过图1所示的生物合成途径制备(S)-3-羟丁酸。

首先，乙酰辅酶A是通过糖酵解由葡萄糖生产的，并通过β-酮硫解酶转化成乙酰乙酰辅酶A，然后乙酰乙酰辅酶A通过(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶转化成(S)-3-羟丁酰辅酶A，且最后(S)-3-羟丁酰辅酶A通过酰基辅酶A水解酶转化成(S)-3-羟丁酸。

本发明也提供了用于制备(S)-3-羟丁酸的用编码β-酮硫解酶的基因、编码(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因、编码磷酸转丁酰酶(ptb)的基因和编码丁酸激酶(Buk)的基因转化的重组微生物。

根据本发明，用于制备(S)-3-羟丁酸的用编码β-酮硫解酶的基因、编码(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因、编码磷酸转丁酰酶(ptb)的基因和编码丁酸激酶(Buk)的基因转化的重组微生物通过图2所示的途径制备(S)-3-羟丁酸。

当乙酰辅酶A通过糖酵解由葡萄糖产生时，乙酰辅酶A通过β-酮硫解酶转化成乙酰乙酰辅酶A，然后乙酰乙酰辅酶A通过(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶转化成(S)-3-羟丁酰辅酶A，(S)-3-羟丁酰辅酶A通过磷酸转丁酰酶(Ptb)或磷酸转乙酰酶(Pta)转化成(S)-3-羟丁酰磷酸酯((S)-3-hydroxybutyrylphosphate)，且最终(S)-3-羟丁酰磷酸酯通过丁酸激酶(Buk)或丙酸激酶(Puk)转化成(S)-3-羟丁酸(见图2)。

在本发明的一个实施方式中，用于制备(S)-3-羟丁酸的重组微生物可用含有至少一种选自编码β-酮硫解酶的基因、编码(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因和编码酰基辅酶A水解酶的基因中的至少一种重组载体转化。

例如，用于制备(S)-3-羟丁酸的重组微生物可用含有编码β-酮硫解酶的基因的重组载体、含有编码(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因的重组载体和含有编码酰基辅酶A水解酶的基因的重组载体转化。或者，用于制备(S)-3-羟丁酸的重组微生物可用含有编码β-酮硫解酶和(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因的重组载体和含有编码酰基辅酶A水解酶的基因的重组载体转化。

在本发明的一个实施方式中，编码β-酮硫解酶的基因、编码(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因和编码酰基辅酶A水解酶的基因可被插入到用于制备(S)-3-羟丁酸的重组微生物的染色体中。

本发明还提供了用于制备(S)-3-羟丁酸酯的重组微生物，用编码β-酮硫解酶的基因、编码(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因、编码酰基辅酶A水解酶的基因和编码脂肪酶的基因转化该微生物。

如图3所示，根据本发明的用编码β-酮硫解酶的基因、编码(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因、编码酰基辅酶A水解酶的基因和编码脂肪酶的基因转化的重组微生物用脂肪酶通过(S)-3-羟丁酸的酯化作用制备(S)-3-羟丁酸酯，该(S)-3-羟丁酸是通过图1所示的(S)-3-羟丁酸的生物合成途径制备的。

在本发明中，可以无限制使用编码上述酶(包括β-酮硫解酶、(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶、酰基辅酶A水解酶和脂肪酶)的任何一个基因。虽然在下面的实施例中使用具体的基因，本领域的技术人员将清楚地理解到，本发明的范围并不限于在此公开的具体基因。

在本发明的一个实施方式中，编码β-酮硫解酶的基因可由SEQ ID No：1表示。

在本发明的一个实施方式中，编码(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因可由SEQ ID No：2或3表示。

在本发明的一个实施方式中，酰基辅酶A水解酶可以是(S)-3-羟丁酰辅酶A水解酶。在本发明的一个实施方式中，(S)-3-羟丁酰辅酶A水解酶可由SEQ ID No：4的碱基序列编码。

在本发明中，载体指的是含有DNA序列的DNA结构，该DNA序列可操作地连接至适合在合适的宿主中表达DNA的表达控制序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒或只是潜在的基因组插入片段。当用载体转化合适的宿主时，载体可不顾宿主基因组而自我复制或运行，或在某些情况下可整合到宿主基因组中。质粒是载体最常见的类型，因此，术语“质粒”和“载体”在以下交替使用。然而，本发明还包括不同形式的载体，其在本领域中已知或者被认为实现与传统的载体相同的机能。

“表达”控制序列是指在特定宿主细胞中表达可操作连接到其他DNA序列的编码序列所必需的DNA序列。此控制序列包括用于起始转录的启动子、用于控制转录的任意操纵基因序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列和用于控制转录和翻译的终止的序列。例如，针对原核生物的控制序列包括启动子、任意操纵基因序列和核糖体结合位点。对于真核生物，控制序列包括启动子、多腺苷酸化信号和增强子。在质粒中，启动子是对基因表达量影响最大的因素。对于高表达，可以使用SRα启动子或源于巨细胞病毒的启动子。

为了表达本发明的DNA序列，各种表达控制序列的任何之一可以应用于载体中。例如，有用的表达控制序列包括SV40或腺病毒的早期和后期启动子、lac系统、trp系统、TAC或TRC系统、T3和T7启动子、λ噬菌体的主要操纵基因和启动子区域、fd编码蛋白质的控制区域、用于3-磷酸甘油酸酯激酶或其他糖酵解酶启动子、用于磷酸酶(如Pho5)的启动子、用于酵母α-交配系统的启动子、其他已知控制原核生物、真核生物或它们的病毒的基因表达的结构序列及它们的组合。

当将核酸置入与另一核酸序列的功能关系中时，其被“可操作地连接”。核酸可以是被连接以在基因与控制序列(例如转录激活蛋白)结合时能够表达基因的基因和控制序列。例如，当前肽序列或分泌前导的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白时，其可操作地连接至编码多肽的DNA；当启动子或增强子影响序列的转录时，其可操作地连接至编码序列；以及当核糖体结合位点影响序列的转录时，其可操作地连接至编码序列，或者当设置核糖体结合位点促进翻译时，其可操作地连接至编码序列。一般来说，术语“可操作地连接”是指被连接的DNA序列是毗邻的，而且在分泌前导的情况下，是毗邻的且在阅读框中存在。然而，增强子不必为毗邻的。这些序列之间的连接是通过在方便的限制性内切酶酶切位点的连接作用实现的。然而，当该酶切位点不存在时，按照传统方法使用合成的寡核苷酸接头或者连接体。

在此使用的术语“表达载体”通常是指作为重组载体的双链DNA片段，其中插入了异源DNA片段。在此，异源DNA指不是在宿主细胞中天然产生的异型DNA。表达载体一旦在宿主细胞中，可不顾宿主染色体DNA而自我复制，并可产生几个拷贝的载体和插入它们中的(异源)DNA。

在现有技术中众所周知的，为增加宿主细胞中转染基因的表达水平，相应的基因应可操作地连接至在选择的表达宿主中起作用的转录和翻译表达控制序列。优选地，表达调控序列和相应的基因连同细菌筛选标记和复制起点一起包括在一个表达载体中。当表达宿主是真核细胞时，表达载体还应包括在真核表达宿主中有用的表达标记。

在本发明中，各种载体可用作重组载体，包括质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体和酵母人工染色体(YAC)载体。例如，质粒载体可包括：(a)复制起点，用于有效复制以在一个宿主细胞中有几百个拷贝，(b)抗生素抗性基因，用于筛选用质粒载体转化了的宿主细胞，和(c)限制性内切酶酶切位点，使外源DNA片段能够插入其中。即使没有合适的限制性内切酶酶切位点，根据常规方法使用合成的寡核苷酸接头或者连接体可以容易地连接载体与外源DNA。

根据本发明的重组载体可以通过传统方法引入到适当的宿主细胞中。可以使用细菌、酵母或真菌细胞作为宿主细胞，但本发明并不限于此。本发明中的宿主细胞优选包括原核细胞，如大肠杆菌。优选的大肠杆菌菌株包括大肠杆菌菌株BL21、大肠杆菌菌株DH5a、大肠杆菌菌株JM101、大肠杆菌K12菌株294、大肠杆菌菌株W3110、大肠杆菌菌株X1776、大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene)和大肠杆菌B。此外，可以使用其他大肠杆菌菌株(诸如FMB101、NM522、NM538和NM539)以及其他原核细胞种属。除了大肠杆菌菌株之外，可以使用农杆菌属菌株(如农杆菌A4)、杆菌属菌株(如枯草杆菌)、其他肠杆菌(如鼠伤寒沙门氏杆菌和粘质沙雷氏杆菌)以及各种假单胞菌属菌株作为宿主细胞，但本发明不限于此。

此外，原核细胞的转化可能通过描述在Sambrook等人的章节1.82中的氯化钾法很容易地完成(同上)。或者，也可使用电穿孔转化这些细胞(Neumann等，EMBO J.，1：841(1982))。

本发明还提供了制备(S)-3-羟丁酸的方法，包括：构建重组微生物，用编码β-酮硫解酶的基因、编码(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因和编码酰基辅酶A水解酶的基因转化该微生物；和培养该重组微生物。所述微生物可以在含有合适的碳源的培养基中培养。

本发明还提供了制备(S)-3-羟丁酸的方法，其特征在于使所述重组微生物的培养物或细胞提取物与选自乙酰辅酶A、乙酰乙酰辅酶A和(S)-3-羟丁酰辅酶A中的底物反应。

本发明还提供了制备(S)-3-羟丁酸酯的方法，包括：构建用于制备(S)-3-羟丁酸酯的重组微生物，用编码β-酮硫解酶的基因、编码(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因、编码酰基辅酶A水解酶的基因和编码脂肪酶的基因转化该微生物；和培养该重组微生物。

以下将通过实施例更加详细描述本发明。然而，这些提供的实施例仅用于解释本发明，而不是限制其范围。

实施例

实施例1：含有编码β-酮硫解酶和(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因的重组载体(pTacReA-HBD)的构建

首先，富养罗尔斯通氏菌H16(Ralstonia eutropha H16)菌株(ATCC17699)在3ml的LB液体培养基中培养18小时，并将培养基离心以收获细胞。将这些细胞用10ml Tris缓冲液清洗。然后，使用Wizard基因组DNA纯化试剂盒(Promega，美国)分离菌株的染色体。

使用ReAf-EcoRI引物(SEQ ID No：5)和ReAb 1259引物(SEQ ID No：6)，将该分离的染色体用作模板扩增源自富养罗尔斯通氏菌菌株的β-酮硫解酶基因(SEQ ID No：1)。将250μM的dNTP、20pmol的每种引物、1.5mM的MgCl₂、10μl的10x缓冲液、100ng的DNA模板和5个单位的pfu聚合酶加入到100μl的PCR混合物中，并在95℃初始变性5分钟，在95℃变性1分钟，在50℃退火1分钟和在72℃聚合1分钟，进行25个循环。

ReAf-EcoRI：5’-ggaattc ATGACTGACGTTGTCATCGTATCC-3’(SEQ ID No：5)

ReAb1259：5’-GTC CAC TCC TTG ATT GGC TTC G-3’(SEQ ID No：6)

在同样的条件下，使用Cahbdf引物(SEQ ID No：7)和Cahbdb-XbaI引物(SEQ ID No：8)扩增源自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)菌株(ATCC 824)的(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶基因(SEQ ID No：2)。

Cahbdf：5’-GAA GCC AAT CAA GGA GTG GACATGAAAAAGGTATGTGTTATAGG-3’(SEQ ID No：7)

Cahbdb-XbaI：5’-GC TCTAGA TTA TTT TGA ATA ATC GTA GAAACC-3’(SEQ ID No：8)

在1％琼脂糖凝胶上纯化扩增的基因，然后将二者用PCR融合在一起。首先，除了聚合进行2.5分钟以外，将各自浓度为1pmol的两个基因混在一起以用作用于PCR的模板并在如上所述的相同条件下扩增。在1％琼脂糖凝胶上纯化扩增的基因，然后与EcoRI和XbaI限制性内切酶酶切以获得DNA片段。将片段插入到pTac99A载体(Park和Lee，J.Bacteriol.185，5391-5397，2003)中，该载体也用相同的限制性内切酶酶切，通过连接作用构建pTacReA-HBD(见图4)。

实施例2：含有编码(S)-3-羟丁酰辅酶A水解酶的基因的重组载体(pET21aBCH、pET28bBCH和pK28BCH)的构建

首先，蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)(ATCC 14579)菌株在LB液体培养基中培养18小时，然后用实施例1中所述的相同的方法分离其染色体。使用ACH_NdeI引物(SEQ ID No：9)和ACH_BamHI引物(SEQ ID No：10)，将该分离的染色体用作模板通过PCR在与实施例1所述的相同条件下扩增3-羟异丁酰辅酶A水解酶(BCH)基因(SEQ ID No：4)。

ACH_NdeI：5’-CGC CAT ATG ACT GAA CAA GTT TTA TTT-3’(SEQ ID No：9)

ACH_BamHI：5’-ATA GGA TCC TTA TGC ATT AAG TAA GTTAAA G-3’(SEQ ID No：10)

在与实施例1所述的相同条件下纯化扩增的基因并用限制性内切酶NdeI和BamHI酶切。将基因片段分别插入到pET21a(Novagen，美国)、pET28B(Novagen，美国)和pK28中，，所述载体也用相同的限制性内切酶酶切，通过连接作用构建pET21aBCH、pET28bBCH和pK28BCH(见图5)。

该pK21载体通过用限制性内切酶BglII和XbaI酶切pET21a载体、通过PCR使用KAN2-P-bglII引物(SEQ ID No：11)和KAN2-P-XbaI引物(SEQID No：12)扩增EZ::TN<KAN2>转座子(Epicenter，美国；Cat#：MOD 1503)的疑似启动子位点、用相同的限制性内切酶酶切PCR产物并将它们连接在一起而在体外构建。扩增的DNA序列如SEQ ID No：13所示。

KAN2-P-bglII：TATA AGA TCT CAA CCA TCA TCG ATG AAT TGT(SEQ ID No：11)

KAN2-P-XbaI：TAT TCT AGA AAC ACC CCT TGT ATT ACT GTT(SEQ ID No：12)

EZ::TN<KAN2>转座子：5’-TACACATCTCAACCATCATCGATGAATTGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACA GTAATACAAG GGGTGTT-3’(SEQ ID No：13)

实施例3：含有编码(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的基因的重组载体(pET21aHBD和pK21HBD)的构建

首先，将在实施例1中分离的丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)用作模板，使用hbd_NdeI引物(SEQ ID No：14)和hbd_BamHI引物(SEQ ID No：15)在与实施例1所述的相同条件下扩增(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶基因(SEQ IDNo：2)。

hbd_NdeI：5’-ATA CAT ATG AAA AAG GTA TGT GTT ATA GGTGCA GGT-3’(SEQ ID No：14)

hbd_BamHI：5’-ATA GGA TTC TTA TTT TGA ATA ATC GTA GAAACC TTT-3’(SEQ ID No：15)

用NdeI和BamHI限制性内切酶酶切扩增的基因，并与pET21a载体和pK21载体连接，所述载体也用相同的限制性内切酶酶切以构建pET21aHBD和pK21HBD(见图6)。

实施例4：(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶(HBD)基因活性的检测

将在实施例3中构建的pET21aHBD引入大肠杆菌BL21(DE3)中以通过电穿孔转化，然后将转化的大肠杆菌BL21(DE3)细胞平铺在LB氨比西林平板上并在37℃生长过夜。将培养的菌落接种到含有100μg/ml氨比西林的3ml LB液体培养基中，然后在37℃、200rpm摇床(Jeiotech，Korea)中生长至OD₆₀₀水平为0.5。然后，将IPTG以终浓度为1mM加入到培养物中以诱导蛋白质表达并使培养物生长过夜。此后，将培养物离心以收获细胞，这些细胞被超声处理破坏，然后离心获取无细胞提取物。所获得的无细胞提取物被用作检测酶活性的样品。

样品中(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的活性通过HPLC(岛津，日本)由在使1mM乙酰乙酰辅酶A、3mM NADH和20μl的5mg/ml无细胞提取物的混合物在37℃反应5分钟以后制备的(S)-3-羟丁酰辅酶A中检测。

对于HPLC，作为流动相的水和乙腈97∶3的混合物流5分钟，且乙腈的比率提高到15％持续25分钟。在此，溶剂流量为1ml/min，使用C18CapcelPAK(Shisheido，日本)作为柱，且(S)-3-羟丁酰辅酶A在210nm被检测。

因此，可以证实，用在实施例3中构建的含有(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶基因的重组载体转化的大肠杆菌BL21(DE3)产生了活性(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶，如表1所示。

【表1】

(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的酶活性

  HBD  对照  转化率  75％  0％

实施例5：(S)-3-羟丁酰辅酶A氢化酶(BCH)基因的活性的检测

通过如实施例4所述的相同方法，孵育用在实施例2中构建的pET21aBCH转化的大肠杆菌BL21，以获得无细胞提取物，该提取物用来检测3-羟异丁酰辅酶A水解酶的活性。

在使1mM的(S)-3-羟丁酰辅酶A和20μl的5mg/ml无细胞提取物的混合物在37℃反应30分钟以后，3-羟异丁酰辅酶A水解酶的活性通过HPLC(岛津，日本)由3-羟丁酸中检测。HPLC在如实施例4所述的相同条件下进行。

因此，可以证实，用在实施例2中构建的含有(S)-3-羟丁酰辅酶A水解酶基因的重组载体转化的大肠杆菌BL21(DE3)产生了活性3-羟异丁酰辅酶A水解酶，如表2所示。

【表2】

3-羟异丁酰辅酶A水解酶(BCH)的活性

  BCH  对照  转化率  73.5％  28％

实施例6：使用用含有β-酮硫解酶、HBD和BCH基因的载体转化了的微生物的细胞提取物制备(S)-3-羟丁酸

通过电穿孔同时用在实施例1～3中构建的pTacReA-HBD、pET21aBCH和pK28BCH转化大肠杆菌BL21(DE3)，然后通过如实施例4所述的相同方式收获无细胞提取物以用来检测酶活性。

(S)-3-羟丁酸的产生通过HPLC(岛津，日本)由1mM乙酰辅酶A、3mM的NADH和20μl的5mg/ml无细胞提取物的混合物在37℃下反应30分钟以后检测。

使用由水解产生的辅酶A通过如实施例5所述的相同方法进行分析。

因此，可以证实，用pTacReA-HBD、pET21aBCH和pK28BCH转化的大肠杆菌BL21(DE3)产生了活性β-酮硫解酶、3-羟异丁酸基辅酶A水解酶和(S)-3-羟丁酰辅酶A脱氢酶，如表3所示。

【表3】

使用重组大肠杆菌的细胞提取物制备(S)-3-羟丁酸

  重组大肠杆菌  对照  转化率  7.84％  0.01％

实施例7：含有β-酮硫解酶、HBD、BCH基因的载体的体内构建、用重组载体转化的微生物和使用该微生物的(S)-3-羟丁酸

大肠杆菌BL21(DE3)用在实施例1和2中构建的pTacReA-HBD和pET28bBCH通过电穿孔共同转化，然后将其平铺到含有100μg/ml氨比西林和50μg/ml卡那霉素的LB平板上。将细胞在37℃下生长过夜。将两个菌落接种到含有LB液体培养基的15ml管(Falcon，美国)中，该LB液体培养基包含100g/ml氨比西林，然后在摇床中在37℃、200rpm生长过夜。将培养的细胞再次接种在含有50ml的2％葡萄糖和100μg/ml氨比西林的LB液体培养基中，并在37℃、200rpm摇床中生长。当OD₆₀₀达到0.5时，将IPTG以终浓度为1mM加入到培养物中以诱导蛋白质表达，然后使细胞培养物生长过夜。

随后，将培养物离心以获取上层清液，并通过HPLC进行3-羟丁酸的定量分析。对于HPLC，使用含有0.01N硫酸的水作为流动相，且水流量为0.6ml/min。此处使用的柱是Aminex87H(Bio-rad，美国)，且3-羟丁酸的制备是通过折射率检测器(RI)检测的。其结果呈现于表4中。

【表4】

(S)-3-羟丁酸的定量数据

为了更精确的定性和定量分析，将含有3-羟丁酸的培养物冷冻干燥，然后将该产物甲基化以进行(S)-3-羟丁酸甲酯的GC-MSD(质谱)和手性分析。通过气相色谱(Agilent，美国)进行分析，且分析条件如表5所示。通过质谱分析，该产物可以被确定为3-羟丁酸，其结果显示在图8和图9中。根据手性分析，制备的(S)-3-羟丁酸的光密度至少为99.9％ee，且对映体过量(ee)水平是由下面的公式(1)确定的：

ee^S＝(C_S-C_R)/(C_S+C_R)x100(1)

【表5】

GC MSD和GC手性分析的条件

实施例8：pET21aBCH-ReA-HBD和pET21aBCH-ReA-ReHBD载体的构建

通过如实施例1所述的相同方法，使用ReHBD-RBS-UP引物和ReHBD-DN-XhoI引物，扩增源自富养罗尔斯通氏菌(R.eutropha)的HBD(ReHBD)基因(SEQ ID No：3)。

ReHBD-RBD-UP：

5’-GAAGCCAATCAAGGAGTGGACATGAGCATCAGGACAGTGGG-3’(SEQ ID No：16)

ReHBD-DN-XhoI：

5’-ATACTCGAGTTACTTGCTATAGACGTACACGCCGCGGCC-3’(SEQ ID No：17)

在与实施例1所述的相同条件下，使用ReAf-EcoRI引物(SEQ ID No：5)和ReHBD-DN-XhoI引物(SEQ ID No：17)将ReA基因与ReHBD基因融合以制备ReAReHBD基因。此外，将在实施例1中构建的pTacReA-HBD载体用作模板，以使用ReAf-EcoRI引物和ReHBD-DN-XhoI引物扩增ReA-HBD基因。融合并扩增的基因用EcoRI和XhoI限制性内切酶酶切，在实施例2中构建的pET21aBCH也用同样的限制性内切酶酶切，然后将它们纯化。将基因片段通过连接作用插入到载体中，从而最终构建出pET21aBCH-ReA-HBD和pET21aBCH-ReA-ReHBD。

HBD-DN-XhoI：

5’-ATACTCGAGTTATTTTGAATAATCGTAGAAACCTTTTCCTG-3’(SEQ ID No：18)

实施例9：使用经pET21aBCH-ReA-HBD和pET21aBCH-ReA-ReHBD载体转化了的大肠杆菌制备(S)-3-羟丁酸

大肠杆菌Codon Plus(DE3)用在实施例8中构建的pET21aBCH-ReA-HBD或pET21a-BCH-ReA-ReHBD通过电穿孔转化，然后将其平铺到LB/氨比西林平板上并在37℃生长过夜。将两个菌落接种到含有3ml的LB/氨比西林培养基的15ml一次性管(Falcon，美国)中，并在37℃、200rpm摇床中生长过夜。将培养的细胞再次接种到含有100ml的2％葡萄糖的MR液体培养基中，并在37℃、200rpm摇床中生长10小时。然后，将细胞培养物接种于1.5L发酵罐中以培育。培育后，当OD₆₀₀达到120时，以终浓度为1mM加入IPTG，以诱导蛋白质的表达，且制备的(S)-3-羟丁酸通过实施例7所述的相同方法每2小时进行分析。结果是，制备了约10g/L的(S)-3-HB(见图10和表6)。

【表6】

使用经pET21aBCH-ReA-HBD和pET21aBCH-ReA-ReHBD载体转化了的大肠杆菌制备(S)-3-羟丁酸

虽然本发明的特定部分进行了详细的描述，但本领域技术人员将清楚地了解到，上述说明书和实施例不是为了限制本发明的范围，本发明的范围是由所附的权利要求书及其等同物所确定。

本领域技术人员将理解到，在不脱离由所附的权利要求所定义的本发明的实质和范围的情况下，可以作出各种形式和细节的变化。

序列表.txt

<110>LG化学株式会社

<120>使用重组微生物制备(S)-3-羟丁酸和(S)-3-羟丁酸酯的方法

 

<130>IP10-0087-XC63

 

<160>18

 

<170>KopatentIn 1.71

 

<210>1

<211>1182

<212>DNA

<213>富养罗尔斯通氏菌

<400>1

atgactgacg ttgtcatcgt atccgccgcc cgcaccgcgg tcggcaagtt tggcggctcg     60

ctggccaaga tcccggcacc ggaactgggt gccgtggtca tcaaggccgc gctggagcgc    120

gccggcgtca agccggagca ggtgagcgaa gtcatcatgg gccaggtgct gaccgccggt    180

tcgggccaga accccgcacg ccaggccgcg atcaaggccg gcctgccggc gatggtgccg    240

gccatgacca tcaacaaggt gtgcggctcg ggcctgaagg ccgtgatgct ggccgccaac    300

gcgatcatgg cgggcgacgc cgagatcgtg gtggccggcg gccaggaaaa catgagcgcc    360

gccccgcacg tgctgccggg ctcgcgcgat ggtttccgca tgggcgatgc caagctggtc    420

gacaccatga tcgtcgacgg cctgtgggac gtgtacaacc agtaccacat gggcatcacc    480

gccgagaacg tggccaagga atacggcatc acacgcgagg cgcaggatga gttcgccgtc    540

ggctcgcaga acaaggccga agccgcgcag aaggccggca agtttgacga agagatcgtc    600

ccggtgctga tcccgcagcg caagggcgac ccggtggcct tcaagaccga cgagttcgtg    660

cgccagggcg ccacgctgga cagcatgtcc ggcctcaagc ccgccttcga caaggccggc    720

acggtgaccg cggccaacgc ctcgggcctg aacgacggcg ccgccgcggt ggtggtgatg    780

tcggcggcca aggccaagga actgggcctg accccgctgg ccacgatcaa gagctatgcc    840

aacgccggtg tcgatcccaa ggtgatgggc atgggcccgg tgccggcctc caagcgcgcc    900

ctgtcgcgcg ccgagtggac cccgcaagac ctggacctga tggagatcaa cgaggccttt    960

gccgcgcagg cgctggcggt gcaccagcag atgggctggg acacctccaa ggtcaatgtg   1020

aacggcggcg ccatcgccat cggccacccg atcggcgcgt cgggctgccg tatcctggtg   1080

acgctgctgc acgagatgaa gcgccgtgac gcgaagaagg gcctggcctc gctgtgcatc   1140

ggcggcggca tgggcgtggc gctggcagtc gagcgcaaat aa                      1182

  

<210>2

<211>849

<212>DNA

<213>丙酮丁醇梭菌

 

<400>2

atgaaaaagg tatgtgttat aggtgcaggt actatgggtt caggaattgc tcaggcattt     60

gcagctaaag gatttgaagt agtattaaga gatattaaag atgaatttgt tgatagagga    120

ttagatttta tcaataaaaa tctttctaaa ttagttaaaa aaggaaagat agaagaagct    180

actaaagttg aaatcttaac tagaatttcc ggaacagttg accttaatat ggcagctgat    240

tgcgatttag ttatagaagc agctgttgaa agaatggata ttaaaaagca gatttttgct    300

gacttagaca atatatgcaa gccagaaaca attcttgcat caaatacatc atcactttca    360

序列表.txt

ataacagaag tggcatcagc aactaaaact aatgataagg ttataggtat gcatttcttt    420

aatccagctc ctgttatgaa gcttgtagag gtaataagag gaatagctac atcacaagaa    480

acttttgatg cagttaaaga gacatctata gcaataggaa aagatcctgt agaagtagca    540

gaagcaccag gatttgttgt aaatagaata ttaataccaa tgattaatga agcagttggt    600

atattagcag aaggaatagc ttcagtagaa gacatagata aagctatgaa acttggagct    660

aatcacccaa tgggaccatt agaattaggt gattttatag gtcttgatat atgtcttgct    720

ataatggatg ttttatactc agaaactgga gattctaagt atagaccaca tacattactt    780

aagaagtatg taagagcagg atggcttgga agaaaatcag gaaaaggttt ctacgattat    840

tcaaaataa                                                            849

 

<210>3

<211>1095

<212>DNA

<213>富养罗尔斯通氏菌

 

<400>3

atgagcatca ggacagtggg catcgtcggt gccggcacca tgggcaatgg catcgcccag     60

gcctgcgcag tggtaggtct caacgtggtg atggtcgaca tcagcgatgc cgccgtgcag    120

aagggtgtcg ccaccgtggc aagcagcctg gaccgtctga tcaagaagga aaagctgacc    180

gaggccgaca aggccagcgc gctggcgcgc atcaagggca gcacctcgta tgacgatctc    240

aaggccaccg atatcgtgat cgaggccgcc accgagaact acgacctgaa ggtcaagatc    300

ctcaagcaga tcgacggcat cgtcggcgag aacgtgatca tcgcgtccaa cacctcgtcg    360

atctcgatca ccaagctggc tgccgtgacc tcgcgcgccg gcagccgctc ttgcactagt    420

agcgcaggtt gtggagcagc tagagctagt ggttcgaccg acggcactgg agcgcgcggc    480

accgctttat cggcatgcac ttcttcaacc cggtgccggt gatggcgctg gtggaactga    540

tccgcggcct gcagaccagc gacaccaccc acgccgccgt cgaggccctg tcgaagcagc    600

tcggcaaata cccgatcacg gtcaagaaca gcccgggctt ctgtggtggg tgcggcggca    660

gctccgggac agcttcgtcg agccgtttat gggctagtgc cagttcttgt cgggcccgaa    720

cgtcgtcaac cgcatcctgt gcccgatgat caacgaggcc ttctgcgtgc tgggcgaagg    780

cctggcctcg ccggaagaga gcagcagttg gcgtaggaca cgggctacta gttgctccgg    840

aagacgcacg acccgcttcc ggaccggagc ggccttctct tcgacgaagg catgaagctg    900

ggctgcaacc acccgatcgg gccgctggcg ctggctgaca tgatcggcct ggacaccatg    960

ctggccgtga tggaagtgct gtacacggag tttgccgatc cgaagtaccg cccggcgatg   1020

ctgatgcgcg agatggtcgc tgccggctac ctgggccgca agactggccg cggcgtgtac   1080

gtctatagca agtaa                                                    1095

 

<210>4

<211>1056

<212>DNA

<213>蜡样芽胞杆菌

 

<400>4

atgactgaac aagttttatt ttctgttagt gaaaatggcg ttgcgacaat tactttaaac     60

cgtccaaaag cacttaattc tttatcttat gacatgttac aacctatcgg acaaaaactt    120

序列表.txt

aaagagtggg aacacgatga gcgtattgca cttatcgtgt taaaaggagc tggcacaaaa    180

ggtttttgtg caggtggcga cattaaaact ctttatgaag cgcgttccaa tgaagtggca    240

ttgcaacatg cagaacgttt ttttgaagaa gagtatgaaa ttgatacata tatttatcaa    300

tatacaaaac cgattattgc ttgtttagat ggaattgtaa tgggcggtgg tgtcggtctt    360

acaaatggtg cgaagtatcg cattgtaact gagcgtacga aatgggcaat gccagagatg    420

aatatcggct tcttcccaga cgtcggagct gcatatttct taaataaagc gcctggatat    480

acaggacgat tcgttgcttt aacagcatct attttaaaag cttctgacgt attatttatt    540

aatgctgcag attactttat gacatctgat tcattaccag agtttcttac tgaacttgaa    600

agtgtaaatt ggcataaaga agatgatgta catactaatt taaaagaagt tattcgtaca    660

tttgcaactg ctccaaactt agaaagcgag ctcgctcctt cattagaagt aatcaattca    720

cattttgctt tcgatacaat tgaagaaatc atccattcat tggagaaaga tgaaagttcc    780

tttgctctaa aaacgaaaga aatactgtta tcaaaatccc ctatttcact aaaagtaaca    840

ttaaaacagt ttattgatgg acaagataaa tccgttgaag aatgtttcgc tacggacctt    900

atacttgcta aaaacttcat gagacatgaa gatttcttcg aaggagtacg ctccgttgtc    960

gttgataaag atcaaaatcc gaattataaa tataaacagt taagtgacgt ttcagaagaa   1020

gatgtgaatc gtttctttaa cttacttaat gcataa                             1056

 

<210>5

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

<400>5

ggaattcatg actgacgttg tcatcgtatc c                    31

 

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>6

gtccactcct tgattggctt cg                              22

 

<210>7

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>7

gaagccaatc aaggagtgga catgaaaaag gtatgtgtta tagg      44

 

<210>8

<211>32

<212>DNA

序列表.txt

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>8

gctctagatt attttgaata atcgtagaaa cc    32

 

<210>9

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>9

cgccatatga ctgaacaagt tttattt          27

 

<210>10

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>10

ataggatcct tatgcattaa gtaagttaaa g     31

 

<210>11

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>11

tataagatct caaccatcat cgatgaattg t     31

 

<210>12

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>12

tattctagaa acaccccttg tattactgtt       30

 

<210>13

<211>127

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>EZ::TN<KAN2>

 

<400>13

tacacatctc aaccatcatc gatgaattgt gtctcaaaat ctctgatgtt acattgcaca     60

agataaaaat atatcatcat gaacaataaa actgtctgct tacataaaca gtaatacaag    120

序列表.txt

gggtgtt                                                          127

 

<210>14

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>14

atacatatga aaaaggtatg tgttataggt gcaggt                           36

 

<210>15

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>15

ataggattct tattttgaat aatcgtagaa accttt                           36

 

<210>16

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>16

gaagccaatc aaggagtgga catgagcatc aggacagtgg g                     41

 

<210>17

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>17

atactcgagt tacttgctat agacgtacac gccgcggcc                        39

 

<210>18

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>18

atactcgagt tattttgaat aatcgtagaa accttttcct g                     41