基于机器码识别技术的血液病原菌快速检测方法

摘要

本发明公开了一种基于机器码识别技术的血液病原菌快速检测方法，针对血液感染的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌和肺炎链球菌的16SrDNA和23SrDNA的保守区域设计相应通用引物并荧光标记，然后采用PCR反应分别对七种病原菌标准菌株DNA及待检测血液样本细菌基因组DNA进行PCR扩增以及CE-SSCP检测，检测结果进行机器码识别(二进制和十进制的编码)并进行比对，本检测方法重复性好，灵敏度高，能够检测痕量的病原菌基因组DNA，检测结果一目了然，非常适合在临床上广泛应用。

说明书

技术领域

本发明涉及血液感染病原菌的检测方法，特别涉及一种基于机器码识别技术的血液病原菌快速检测方法。

背景技术

血液感染常发生在免疫功能低下或进行侵入性操作的高危住院患者中，感染后患者中毒症状严重，病死率高，在临床工作中十分棘手。传统对于血液感染病原菌的检测方法主要依靠直接培养后的生化鉴定。此方法需要对每种病原菌进行单独培养和鉴定，所需时间一般为3-5天，耗时较长，而且检测结果受采血剂量、送检时间和用药时机等因素影响较大。利用分子生物学技术对病原菌的检测则克服了上述缺点。

毛细管电泳(CE)的分析分离技术因具有分离操作时间短、分离效率高、样品用量少、环境污染小、操作自动化程度高以及可用计算机控制实现软件分析等诸多优点而被广泛应用于药物及临床分析。如今，CE-SSCP(毛细管电泳-单链构象多态性)技术在基因突变筛选、微生物分类、新种类鉴定及分子流行病学等领域广有应用，用于常见病原菌检测已见报道。CE-SSCP技术的重复性和可信度很大程度上依赖于操作过程中各项指标的选择与设定，比如引物的设计、电泳电压强度等，并且，传统CE-SSCP分析结果以波峰表示，其结果差异需仔细辨认和区别，无法做到一目了然。

因此提供一种能够应用于临床的针对血液感染病原菌的检测方法，能够快速诊断出血液感染的病原菌并且重复性好，可信度高，同时结果判读简便，就成为了亟待解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种基于机器码识别技术的血液病原菌快速检测方法，利用CE-SSCP技术进行血液感染病原菌检测，并将检测结果以编码形式输出，不仅能够快速诊断出血液感染的病原菌而且重复性好、可信度高，同时结果判定快捷准确。

本发明所述的基于机器码识别技术的血液病原菌快速检测方法，包括如下步骤：

a.针对待测病原菌16SrDNA和23SrDNA的保守区域设计通用引物并荧光标记；

所述病原菌包括：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌和肺炎链球菌；

所述通用引物序列为：

上游引物：5’-TTGTAAATACCGCCCGTCA-3’，

下游引物：5’-GGTTGCTTAGATGGTTCAGTTC-3’；

b.对内参照体系进行CE-SSCP分析，得内参照的CE-SSCP电泳图，所得内参照的CE-SSCP电泳图中，每两相邻峰之间的区域分别记为一个区间；

c.提取待测血液样本的细菌基因组DNA，并以该基因组DNA为模板采用步骤a所得通用引物进行PCR扩增，所得扩增产物转移至步骤b所述的内参照体系中进行CE-SSCP分析，得待测血液样本的CE-SSCP电泳图；

d.将步骤c所得待测血液样本的CE-SSCP电泳图与内参照的CE-SSCP电泳图进行比对，并对待测血液样本的CE-SSCP电泳图进行编码，出现待测病原菌峰的区间记为1，未出现待测病原菌峰的区间记为0，然后将二进制编码转化为十进制编码；

e.将步骤d所得十进制编码与七种病原菌标准菌株CE-SSCP电泳图的十进制编码结果进行比对，根据比对结果检测血液样本感染的病原菌。

进一步，步骤e所述七种病原菌标准菌株CE-SSCP电泳图的十进制编码结果由如下方法获得：

1)分别提取所述七种病原菌标准菌株的基因组DNA并按照步骤c的条件依次进行PCR扩增和CE-SSCP分析，得七种病原菌标准菌株的CE-SSCP电泳图；

2)按照步骤d的方法分别将七种病原菌标准菌株的CE-SSCP电泳图与内参照的CE-SSCP电泳图进行比对并进行二进制编码；

3)分别将步骤2)所得七种病原菌标准菌株CE-SSCP电泳图的二进制编码转化为十进制编码，得七种病原菌标准菌株CE-SSCP电泳图的十进制编码；

进一步，所述PCR扩增的循环参数为：

94℃预变性5min；

94℃变性40s，54℃退火45s，72℃延伸40s，共30个循环；

72℃终延伸5min，结束PCR扩增；

进一步，CE-SSCP分析所用筛分介质为POP-7或CAP胶，CE-SSCP分析过程中的电泳参数为：进样电压15.0KV，电泳电压13.0KV，电泳温度35℃。

需要说明的是：本发明中，所述待测血液样本的CE-SSCP电泳图皆表示待测血液样本细菌基因组DNA的PCR扩增产物的CE-SSCP电泳图，所述七种病原菌标准菌株的CE-SSCP电泳图皆表示七种病原菌标准菌株各自基因组DNA的PCR扩增产物的CE-SSCP电泳图。

本发明的有益效果是：

本发明的基于机器码识别技术的血液病原菌快速检测方法针对血液感染中常见的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌和肺炎链球菌的16SrDNA和23SrDNA的保守区域设计相应的通用引物并荧光标记，再用所得通用引物对待测血液样本细菌基因组DNA进行PCR扩增，所得扩增产物进行CE-SSCP分析，CE-SSCP分析结果进行二进制编码，所得二进制编码再转化为十进制码，最后将待测血液样本CE-SSCP电泳图的十进制编码结果与七种病原菌标准菌株CE-SSCP电泳图的十进制编码结果进行比对，从而鉴定血液感染病原菌；本检测方法所设计的通用引物长度与扩增跨度适宜，与待测血液样本中细菌基因组DNA的互补程度高，扩增产物的特异性好，对于不同菌株的同一类细菌皆有良好适用性，本方法检测速度快、重复性好，灵敏度高，能够检测痕量的细菌DNA，并且令检测结果一目了然，非常适合在临床上针对所述七种病原菌对血液进行快速检测。

本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。

附图说明

图1为未加样品的含有内参照的体系的CE-SSCP电泳图：横坐标为出峰时间，纵坐标为荧光强度，图中橙色峰为内参照物，分为I-VIII个区间；

图2为七种病原菌标准菌株基因组DNA的PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中M为分子量标准(1200，900，750，600，450，300，150bp)，1：金黄色葡萄球菌；2：大肠杆菌；3：铜绿假单胞菌；4：表皮葡萄球菌；5：肺炎克雷伯菌；6：粪肠球菌；7：肺炎链球菌；8：空白对照；

图3为七种病原菌标准菌株的CE-SSCP电泳图及二进制编码结果，图中横坐标代表出峰时间，纵坐标代表荧光信号强度，图中：S.aureus为金黄色葡萄球菌，E.coli为大肠杆菌，P.aeruginosa为铜绿假单胞菌，S.epdermidis为表皮葡萄球菌，K.pneumoniae为肺炎克雷伯菌，E.faecalis为粪肠球菌，S.pneumoniae为肺炎链球菌；

图4七份待检测血液样本的CE-SSCP电泳图及二进制编码结果，图中横坐标代表出峰时间，纵坐标代表荧光信号强度。

具体实施方式

以下将对本发明的优选实施例进行详细的描述。应当理解，优选实施例仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。

本实施例的基于机器码识别技术的血液病原菌快速检测方法，包括如下步骤：

(一)设计金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌和肺炎链球菌的通用引物，操作如下：分别查询所述七种病原菌16S rDNA和23S rDNA的序列，利用ClustalX 1.81软件进行多重序列比对，查找所述7种病原菌的保守区域，然后利用Primer Premier 5.0设计通用引物并进行荧光标记，通用引物序列为：上游引物：5’-FAM-TTGTAAATACCGCCCGTCA-3’，下游引物：5’-GGTTGCTTAGATGGTTCAGTTC-3’；

(二)对不加样的含有内参照的体系进行CE-SSCP分析，所述内参照体系由9μl去离子甲酰胺、0.5μl NaOH(浓度为3M)和0.5μlROX 500混合而得，操作如下：将内参照体系95℃变性5min，迅速置于冰水混合物中10min。CE-SSCP分析在ABIPrism 3130 genetic anayzer上按操作说明书进行；毛细管规格为47cm×50μm，筛分介质为POP-7^TM(ABI分离胶)，此处所用的筛分介质也可以是CAP胶，电泳条件如下：进样电压15.0KV，电泳电压13.0KV，电泳温度35℃；FAM的最大吸收波长为495nm，最大激发波长为520nm，信号采集分析由DNA分析软件Gene Mapper自动完成；最后得到内参照基因组的CE-SSCP电泳图，电泳图中，每两相邻峰之间分别记为一个区间，包括I-VIII区间，如图1；

(三)制作七种病原菌标准菌株的CE-SSCP电泳图并编码，操作如下：

①挑取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌和肺炎链球菌的标准菌株，分别用生理盐水稀释至浓度为0.5麦氏单位，然后采用试剂盒(天根生化科技公司产品)并按试剂盒说明提取各标准菌株的基因组DNA，用紫外分光光度计测定所得七种病原菌基因组DNA的A₂₆₀/A₂₈₀吸光度比值，结果均大于1.8，显示纯度好；

②以所提取的七种病原菌标准菌株的基因组DNA为模板采用步骤(一)所得通用引物分别进行PCR扩增，得到七种病原菌基因组DNA的PCR扩增产物，其中，PCR扩增的反应体系为25μl体系并包括10×buffer 2.5μl，dNTP(2.5mM)2.5μl，Mg²⁺(25mM)1.5μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.25μl，通用引物的上、下游引物(4μM)各1μl，模板1μl，用灭菌去离子水补足至25μl；PCR扩增的循环参数为：94℃预变性5min，然后94℃变性40s，54℃退火45s，72℃延伸40s，共30个循环，72℃终延伸5min后，结束扩增；

③取七种病原菌标准菌株基因组DNA的PCR扩增产物5μl并分别与1μl上样缓冲液(上样缓冲液中所含组分及相应组分在溶液中的质量分数分别为0.25％溴酚蓝、0.25％二甲苯氰和40％蔗糖)混匀后，在含有溴化乙锭的浓度为1％(W/V)的琼脂糖凝胶上电泳(电压100V，40min)，得到凝胶电泳图-如图2，根据凝胶电泳图可见七种病原菌DNA扩增产物纯度好，未见非特异扩增条带及引物二聚体，所述琼脂糖凝胶中溴化乙锭的浓度为0.5μg/ml；

④对步骤②所得七种病原菌标准菌株基因组DNA的PCR扩增产物进行CE-SSCP分析，操作如下：分别将七种病原菌标准菌株基因组DNA的PCR扩增产物用无菌去离子水稀释20倍，然后每种稀释液分别取1μl并在步骤(二)所述的内参照体系中进行CE-SSCP分析，得七种病原菌标准菌株的CE-SSCP电泳图，本步骤的CE-SSCP分析条件与步骤(二)相同；

⑤分别将七种病原菌标准菌株的CE-SSCP电泳图与内参照的CE-SSCP电泳图进行比对并按照二进制编码方法进行编码，出现待检测病原菌峰的区间记为1，未出现待检测病原菌峰的区间记为0，得七种病原菌标准菌株CE-SSCP电泳图的二进制编码结果，如图3，将所得二进制编码转化为十进制码并以表1形式列出，如下：

表1

  细菌名称  sscp模式(二进制)  sscp模式(十进制)  金黄色葡萄球菌  00000101111  47  大肠埃希菌  00000101  5  铜绿假单胞菌  00000001  1  表皮葡萄球菌  00010100  20  肺炎克雷伯菌  01001101  77  粪肠球菌  01011100  92  肺炎链球菌  00010000  16

(三)待测血液样本中的病原菌检测，操作如下：

(1)取七份不同的血液样本各0.5ml并分别加入七个1.5ml EP管中，再向每个EP管中加入1ml碱裂解液(所述碱裂解液所含组分及相应组分在溶液中的浓度分别为0.5MNaOH和0.05M柠檬酸钠)于室温下混匀10min后，得七份混合液；

(2)对步骤(1)所得七份混合液分别进行如下操作：于4℃13000g转速的条件下离心5min，弃去上清液后加入0.5ml Tris-Hcl(0.5M，PH＝8.0)，再于4℃13000g转速下离心5min，弃去上清液后再按照本步骤前述操作重复两次；得七份沉淀；

(3)对所得七份沉淀分别进行如下操作：用0.1ml的Tris-EDTA溶液(Tris-EDTA溶液所含组分及相应组分在该溶液中的浓度分别为：10mMTris-Hcl和1mM EDTA，PH＝8.0)重悬后于100℃煮沸1h，然后迅速冰浴5min，再煮沸2mi n，然后重复本步骤前述操作2次，最后于4℃13000g转速下离心15mi n；最后得七份上清液，所得上清液于-20℃保存备用；

(4)分别从各上清液中提取七份血液样本的细菌基因组DNA并采用与步骤②相同的反应体系及循环参数对所得细菌基因组DNA进行PCR扩增，分别得到七份血液样本细菌基因组DNA的PCR扩增产物；

(5)将步骤(4)所得的七份血液样本细菌基因组DNA的PCR扩增产物进行CE-SSCP分析，得七份血液样本细菌基因组DNA的PCR扩增产物的CE-SSCP电泳图并按照二进制编码方法进行编码，得图4，本步骤CE-SSCP分析的操作步骤及条件步骤④相同；

(6)将图4中二进制编码转化为十进制编码，得七份待测血液样本CE-SSCP电泳的十进制编码结果，见表2，然后与表1中所得的十进制编码进行比对，可得47为金黄色葡萄球菌，5为大肠杆菌，1为铜绿假单胞菌，20为表皮葡萄球菌，77为肺炎克雷伯菌，92为粪肠球菌，16为肺炎链球菌。

表2

  sscp模式(二进制)  sscp模式(十进制)  检测结果  00000101111  47  金黄色葡萄球菌  00000101  5  大肠埃希菌  00000001  1  铜绿假单胞菌  00010100  20  表皮葡萄球菌  01001101  77  肺炎克雷伯菌  01011100  92  粪肠球菌  00010000  16  肺炎链球菌

常规血液病原菌检测方法一般是将血液样本送检后，立即放入培养箱培养，显示阳性后，再接种血平板培养18-24h，然后挑取标准菌株进行生化鉴定。相对于常规方法而言，本发明的方法大大提高了检测速度，并且重复性好、检测灵敏度高，通过编码比对直接得到检测结果，判定更加直观简便，能够用于检测血液样本中痕量的细菌基因组DNA，非常适合临床应用。

因模板DNA扩增过程中，扩增循环参数对于扩增产物特异性有着重要影响，变性温度低，或者会因解链不完全而导致PCR扩增失败，或者会造成扩增时间延长，而温度过高会对酶的活性有影响，退火温度与复性温度影响PCR扩增产物特异性，延伸温度的选择影响引物和模板的结合，本发明设计的PCR扩增的循环参数为：94℃预变性5min；94℃变性40s，54℃退火45s，72℃延伸40s，共30个循环；72终延伸℃5min，PCR扩增结束；使得扩增产物的特异性较高，方法的重复性较好。

本实施例中，CE-SSCP分析的电泳参数为：进样电压15.0KV，电泳电压13.0KV，电泳温度35℃，使DNA分子泳动速率更快，分辨率更高，带型更整齐。

需要说明的是：临床上，血液同时感染多种病原菌的情况极少，采用本发明方法进行检测时，如若待测血液样本细菌基因组DNA扩增产物CE-SSCP电泳的十进制编码结果与七种病原菌标准菌株DNA的PCR扩增产物CE-SSCP电泳的十进制编码结果不同，说明待测血液样本感染多种病原菌，则可通过如下几种途径得到检测结果：a.将几者的CE-SSCP电泳图直接进行比对，根据出峰时间不同得到血液感染病原菌的检测结果；b.重新采用其它的常规方法(革兰染色，生化反应等)进行检测。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110>中国人民解放军第三军医大学第一附属医院

<120>基于机器码识别技术的血液病原菌快速检测方法

<160>2

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>上游引物

<400>1

ttgtaaatac cgcccgtca                        19

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>下游引物

<400>2

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