糖尿病足感染病原菌的分布与取材及基于高通量测序技术的病原菌快速鉴定

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述：
　　第一章 糖尿病足创面感染病原菌分布及耐药性15年变迁
　　目的：
　　探讨DF创面感染病原菌分布特点及耐药性变迁，指导临床抗生素选择，提高经验性抗感染治疗的有效性。
　　对象及方法：
　　1.研究对象
　　收集2000年1月至2014年12月在南方医科大学南方医院住院治疗的580例DFI患者的病例资料，回顾性分析其一般临床资料、创面棉拭子微生物培养及药敏结果。580例患者均符合WHO制定的糖尿病诊断标准及IDSA制定的DFI诊断标准。
　　2.研究方法
　　(1)分组:580例DFI患者按照溃疡PEDIS感染级别分为PEDIS2级组(96例)，PEDIS3级组（314例），PEDIS4级组（170例）;根据有无合并下肢动脉缺血和周围神经病变，判断溃疡性质为神经性（339例）、缺血性（48例）、混合性溃疡（193例）;季节采用候温法划分，根据广东省月平均气温将季节划分为春季（2～3月）、夏季（4～10月）、秋季（11～1月）3个季节。比较上述各组病原菌分布特点。并根据耐药性变化趋势将资料按年份分为2组:2000～2010年、2011～2014年，分析15年来DFI病原菌对不同抗生素的耐药性变迁情况。
　　(2)统计分析:采用SPSS19.0版软件进行统计分析。计量资料用Kolmogorov-Smimov test检验是否为正态分布，符合正态分布的计量资料用平均数±标准差表示，不符合正态分布的数据以中位数（第一四分位数，第三四分位数）表示。计数资料用率或构成比表示，多组间比较采用卡方检验。利用Logistic回归分析DFI病原菌分布的影响因素。取P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果：
　　1.Logistic回归分析结果提示DF溃疡PEDIS感染级别(P＜0.001)及季节（P＜0.01）共同影响DFI病原菌类型。溃疡性质对DFI病原菌分布的影响无统计学意义（P＞0.05）。
　　2.PEDIS2级的DFI溃疡在各季节均以G+菌感染为主;PEDIS4级的DFI溃疡在各季节均以G-菌感染占优势;而PEDIS3级者在春秋季以G+菌感染为主(55.3％)，夏季以G-菌感染为主(53.3％)(P＜0.05)。各个季节DFI创面的混合感染率均随着PEDIS级别的增加而上升（P＜0.01）。
　　3.G+菌以葡萄球菌属为主(44.7％)，对青霉素、氨苄西林完全耐药，对万古霉素、利奈唑胺100％敏感，15年来对阿莫西林/克拉维酸钾的耐药率由15.0％上升至48.1％(P＜0.05);G-菌以肠杆菌科最常见(61.3％)，对氨苄西林耐药率最高(91.3％)，对美罗培南最敏感(99.5％)，15年来对头孢噻肟的耐药率由29.2％增长至43.7％(P＜0.05)。
　　结论：
　　1、对DFI患者经验性抗感染治疗时可综合考虑溃疡PEDIS级别与季节因素对感染病原菌类型的影响，并结合不同类型病原菌对抗生素的敏感性特点有针对性地选择抗生素。
　　2、15年来我院DFI病原菌随着时间变迁对多种抗生素的耐药性较早年有升高趋势，其中β-内酰胺类、头孢菌素类尤甚。根据伤口特征合理有针对性地使用抗菌药物，减少抗生素的滥用，对防止、延缓病原菌的耐药性增长，提高抗感染治疗的有效性有重大意义。
　　第二章 糖尿病足感染创面拭子及深部组织微生物培养结果的一致性研究
　　目的：
　　在不同感染程度DFI创面中比较棉拭子及深部组织标本微生物培养结果的一致性，评价创面棉拭子培养对DFI病原学诊断的有效性。
　　对象及方法：
　　1.研究对象
　　本研究连续纳入了2014年10月至2015年7月在南方医科大学南方医院住院治疗的56例DFI患者。56例患者均符合WHO制定的DM诊断标准及IDSA制定的DFI诊断标准。本研究经南方医院伦理委员会批准并取得了所有纳入患者的知情同意书。
　　2.研究方法
　　(1)分组:按照创面PEDIS感染级别分为3组:2级（10例）、3级(29例)、4级(17例)。
　　(2) DFI创面棉拭子擦拭取样:采用Levine棉拭子擦拭法。
　　(3) DFI创面深部组织取样:采用组织钻取法。
　　(4)微生物培养:参照《全国临床检验操作规程》进行。
　　结果：
　　1.DFI创面棉拭子标本及深部组织标本均培养出81株病原菌（平均每个标本1.4株）。在不同PEDIS级别组中，2种不同取样方法对于单一感染或混合感染的诊断均无显著差异(P＞0.05)。
　　2.在PEDIS2级的DFI创面中，80.0％的棉拭子标本培养结果与对应深部组织培养出的病原菌完全一致，而在PEDIS3级和4级的DFI创面，该比例显著下降至31.0％及29.4％(P＜0.05)。
　　3.以深部组织培养结果作为金标准，评价棉拭子培养对DFI微生物学诊断的价值得出，棉拭子培养对于所有G+菌种类鉴定的敏感性均大于60％，特异性均大于80％。而在G-菌种类鉴定中，棉拭子微生物培养对于某些常见感染病原菌（如大肠埃希氏菌、摩根氏菌、枸橼酸杆菌）鉴定的敏感性很低(33.3％)，另外有一些在深部组织标本中培养阳性的G-菌（沙雷氏菌、不动杆菌、皮氏拉斯通氏菌、抗坏血酸克鲁依弗氏菌）均未在对应的棉拭子标本中分离出来。
　　结论：
　　1.创面棉拭子标本微生物培养鉴定对于指导PEDIS2级DFI患者的抗感染治疗方案，具有较高的可靠性。
　　2.对于PEDIS感染级别≥3级的DFI患者而言，创面棉拭子标本对病原菌鉴定的可靠性显著下降，尤其是易遗漏深部组织感染G-菌的诊断。因此，进行创面深部组织培养对于该类患者的DFI病原学诊断有必要性。
　　第三章 基于高通量测序技术的糖尿病足感染病原菌快速鉴定及皮肤菌群多样性研究
　　目的：
　　验证基于PGM平台的16S rRNA基因高通量测序技术在DFI病原菌快速鉴定中的可行性。并利用该技术比较DFI创面棉拭子标本及深部组织标本的微生物学检测结果。同时，分析皮肤表面与DFI创面菌群结构的差异性，探讨创面中占主导作用的致病菌，推测皮肤微生态中可能的益生菌。
　　对象及方法：
　　1.研究对象
　　纳入2015年1月至2015年7月在南方医科大学南方医院住院治疗的10例DFI患者。10例患者均符合WHO制定的DM诊断标准及IDSA制定的DFI诊断标准。本研究经南方医院伦理委员会批准并取得了所有纳入患者的知情同意书。
　　2.研究方法
　　(1)标本取材方法:DFI创面拭子擦拭取样采用Levine棉拭子擦拭法(S组，编号为SI、S2...S9、S10）;DFI创面深部组织取样采用组织钻取法（T组，编号为T1、T2...T9、T10）;皮肤表面微生物取样采用无菌棉拭子擦拭法（C组，编号为C1、C2...C9、C10）。
　　(2)传统细菌培养:参照《全国临床检验操作规程》进行。
　　(3)基因组DNA的提取与检测:采用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒对所有标本进行基因组DNA提取。
　　结果：
　　1.通过16SrRNA基因高通量测序检测到的菌属种类（平均每个样本66.1种）显著多于传统细菌培养检测到的菌属种类（平均每个样本1.5种）(P＜0.001)，且测序结果分析得出的菌群中均包含了传统细菌培养鉴定得出的病原菌。然而，80％传统细菌培养结果与测序诊断的优势菌群（丰度最高）不一致。
　　2.基于测序结果进行Alpha多样性分析，结果显示: C组OTU数量、菌属数量及香农指数均显著高于T组及S组(P＜0.001)，而S组与T组之间的OTU数量、菌属数量及香农指数均无统计学差异(P＞0.05)。
　　3.基于测序结果进行Beta多样性分析，Venn图提示，C组与T组之间、C组与S组之间、S组与T组之间重叠的菌种序列数分别仅占11.4％、11.0％、31.0％。主成分分析显示代表C组样本的点与代表S组、T组的点能显著分开。部分代表S组样本的点与对应T组样本的距离很近（如S1和T1），而另一部分却明显的分离开（如S3和T3）。
　　结论：
　　1.基于PGM测序平台的16S rRNA基因高通量测序技术可能作为临床DFI病原菌快速鉴定的有效手段。
　　2.进行创面深部组织培养对于PEDIS3-4级的DFI患者的病原学诊断有必要性。
　　3.皮肤表面的微生物多样性显著高于DFI创面，皮肤表面的Staphylococcus，Actinobacteria及Propionibacteriaceae等菌群与糖尿病患者皮肤微生态的相关性明显，而厌氧菌Bacteroidales及Lactobacillales在DFI创面菌群结构中有显著性影响。

目录

摘要

第一章 糖尿病足创面感染病原菌分布及耐药性15年变迁

第1节 前言

第2节 对象与方法

第3节 结果

第4节 讨论

第二章 糖尿病足感染创面拭子及深部组织微生物培养结果的一致性研究

第1节 前言

第2节 对象与方法

第3节 结果

第4节 讨论

第三章 基于高通量测序技术的糖尿病足感染病原菌快速鉴定及皮肤菌群多样性研究

第1节 前言

第2节 对象与方法

第3节 结果

第4节 讨论

全文小结

参考文献

附录

成果

致谢

声明