单核细胞增生利斯特氏菌菌株及其用途

摘要

本发明公开了一株单核细胞增生利斯特氏菌菌株及其用途。本发明单核细胞增生利斯特氏菌菌株(Listeria monocytogenes)的微生物保藏号是CGMCCNo.3342。本发明菌株同时对磷霉素、四环素、诺氟沙星及头孢噻肟四种抗生素耐受，为四重耐药菌株，可用于单一耐药机制和多重耐药机制的研究，同时也可用于耐药性消除试验的研究。本发明菌株是一株携带可转移的tetM基因的特殊菌株，可用于tetM耐药基因水平传播机制的研究，同时也为研究四环素耐药性扩散的防控手段提供物质基础。

说明书

技术领域

本发明涉及一种革兰氏阳性小杆菌，尤其涉及一株单核细胞增生利斯特氏菌菌株及其用途，属于细菌学领域。

背景技术

单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes，L.M.)为革兰氏阳性小杆菌。其广泛存在于土壤、水域、昆虫、植物、动物体内。食品是该菌致病的主要载体。据WHO(1999)报道，4％～8％的水产品，5％～10％的奶与奶制品，30％以上的肉与肉制品，15％以上的家禽均被该菌污染。由于该菌在4℃的环境下仍可生长繁殖，因此也成为冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一(沈红，蒋兴祥，赵霞贇，等.食品中单核细胞增生利斯特氏菌检测及污染现状分析[J]，中国人兽共患病学报，2007，23(4)：417.)。

L.M.作为国际公认的四大食源性致病菌之一，可引起全球性的人兽共患病--利斯特菌病。该病感染对象主要是新生儿(畜)、孕妇(畜)、免疫功能低下者及老年人群(家畜)，临床症状表现为脑膜炎、败血症、流产、脓肿等，最突出的特点是临床病死率较高，可达30-70％。该病在发达国家发病率较高，常呈暴发性流行。近年来，在欧美日等国家此菌的危害程度甚至超过沙门氏菌。目前在我国虽无爆发性流行，但一些散在病例已见报道。

近些年随着抗生素在农业、畜牧业生产中的广泛使用，特别是在食源性动物中作为促生长剂的使用，导致了食源性细菌耐药性的普遍发生。而这些耐药菌株的出现导致临床治疗失败、并发症增多、感染复发及治疗时间延长等情况的发生。更为严重的是有些耐药菌株的耐药基因可在不同种的食源性致病菌之间进行转移，导致其耐药性进一步传播和扩散，这更大大增加食源性疾病的防控难度。鉴于此，开展有关食源性致病菌的耐药性监测、耐药机制及耐药性水平传播机制等研究具有重要意义。

1988年之前，L.M.被认为对所有抗生素敏感，所以对该菌的相关耐药性研究较少。但自1988年首次报道L.M.的四环素耐受株以来，不断从食品、环境及人利斯特菌病散发病例中分离到对一种或多种抗生素耐受的L.M(Paciorek J.Antimicrobial susceptibilities of Listeria monocytogenes strains isolated from2000to2002in Poland.Pol J Microbiol，2004，53(4)：279-281.Aureli P，Ferrini AM，Mannoni V，et al.Susceptibility of Listeria monocytogenes isolated from food in Italy toantibiotics.Int J Food Microbiol，2003，83(3)：325-330.)。此后，国内外学者逐步展开了对该菌的耐药性研究。国内学者对L.M.的耐药性研究较少。仅有的几篇报道也主要集中在耐药谱分析上(张亚兰，冉陆，利迎惠，等.2003-2004中国食品中单核细胞增生利斯特菌耐药监测[J].中国食品卫生杂志，2006，18(5)：398-240.杨洋，付萍，郭云昌，等.中国食源性单核细胞增生利斯特菌耐药性趋势分析.卫生研究，2008，37(2)：183-186.)，未见有关耐药机制及耐药基因水平传播的相关报道。国外学者对L.M.的耐药性研究大多集中在耐药谱的分析和耐药机制的探讨方面(Bertrand S，Huys G，Yde M，et al.Detection and characterization of tetM intetracycline-resistant Listeria strains from human and food-processing origins inBelgium and France.J Med Microbiol，2005，54(12))1151-1156.Srinivasan V，Nam HM，Nquven LT，et al.Prevalence of antimicrobial resistance genes in Listeria monocytogenesisolated from dairy farms.Foodborne Pathog Dis，2005，2(3)：201-211.Poros-Gluchowska J，Markiewicz Z.Antimicrobial resistance of Listeria monocytogenes.ActaMicrobiol Pol，2003，52(2)：113-129.)。仅在2002年，Pourshaban等研究发现从食品中分离的L.M.所携带四环素耐药基因tetM能通过接合作用转移给另一株对四环素敏感的L.M.菌株和粪肠球菌(Pourshaban M，Ferrini A M，Mannoni V，et al.Transferable tetracycline resistance in Listeria monocytogenes from food in Italy.J MedMicrobiol，2002，51：564-566.)。目前未见该基因向其他菌株转移的报道。

基于L.M.给人类带来的严重健康隐患及其耐药性传播所导致的严重后果，应大力开展该菌的耐药机制及耐药基因传播方面的研究。这样才能为阻止其耐药性的扩散和新型抗菌药物的研制提供理论基础，而目前之所以没能深度开展这方面的工作，很主要的一个原因是缺乏进行此类研究的合适的菌株。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是基于国内缺乏用于耐药机制及耐药基因传播研究的单核细胞增生利斯特氏菌菌株，提供一种四重耐药且携带可以转移的四环素耐药基因tetM的单核细胞增生利斯特氏菌菌株，该菌株可以作为标准的试验用菌株。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一株四重耐药且携带可以转移的四环素耐药基因的单核细胞增生利斯特氏菌菌株(Listeria monocytogenes)D38，其分类命名是单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)，其微生物保藏号是CGMCC No.3342；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏时间；2009年10月19日。

本发明单核细胞增生利斯特氏菌D38菌株的分离方法如下：

分离培养无菌取市售生猪肉样品置于增菌液中进行两次增菌，用接种环沾取增菌液，在科玛嘉利斯特显色培养基上划线接种，30℃培养24h后，挑取培养基上大小为1-2mm、蓝色带有白色晕环的圆形菌落在血琼脂平板上划线培养，继续于30℃培养24h。然后选择血平板上具有明显β溶血环的菌落穿刺于SIM半固体培养基，25℃培养48h，细菌沿穿刺线扩散生长，呈云雾状，距培养基表面数毫米处出现一个倒伞形生长区。然后进一步将血平板上的具有以上特征的菌落接种于TSA-YE培养基上进行纯培养。

菌株鉴定将纯培养的细菌进行革兰氏染色，显微镜观察菌落为阳性短杆菌，两端钝圆，多单在，有的呈V字型排列，初步鉴定为单核细胞增生利斯特氏菌。将此菌株制成菌悬液，注入API生化试剂条上的每一个小管，在需氧条件下，36℃培养24小时，其反应结果符合单核细胞增生利斯特氏菌数码图谱。进而又利用基因组提取试剂盒提取上述菌株的基因组，并采用PCR方法扩增单核细胞增生利斯特氏菌的特异性基因，结果扩增到大小约210bp的特异性基因片段hlyf，进一步证实了分离到的菌株为单核细胞增生利斯特氏菌。

按照NCCLS制定的K-B法实验操作过程及结果判定标准对本发明菌株进行耐药谱分析发现，本发明菌株同时对磷霉素、四环素、诺氟沙星及头孢噻肟四种抗生素耐受，为四重耐药菌株。本发明菌株可作为科研工作者标准的试验用菌株，可用于单一耐药机制和多重耐药机制的研究，同时也可用于耐药性消除试验的研究。

对本发明菌株的四环素耐药机制进行研究发现，该菌株携带tetM耐药基因，且通过接合作用，该基因可以转移至猪链球菌，表明该菌株是一株携带可转移的tetM基因的特殊菌株。该菌株可用于tetM耐药基因水平传播机制的研究，同时也为研究四环素耐药性扩散的防控手段提供物质基础。

总之，本发明菌株为单核细胞增生利斯特氏菌多重耐药机制、耐药性水平传播机制及其相应的防控措施的的研究提供物质平台。

附图说明

图1本发明菌株特异性基因hlyf的PCR鉴定结果M：DNA Maker DL2000，1：本发明菌株的PCR产物。

图2本发明菌株四环素耐药基因tetM的PCR扩增结果；M：DNA Marker 2000；1：阴性对照；2：本发明菌株的PCR产物。

图3各菌株红霉素耐药基因ermB的PCR鉴定结果；M：DNA Marker 2000；1：B22菌株；2：D38菌株；3-21：接合菌株。

图4各菌株四环素耐药基因tetM的PCR鉴定结果；M：DNA Marker 2000；1：B22菌株；2：D38菌株；3-21：接合菌株。

图5各菌株猪链球菌特异性基因cps的PCR鉴定结果；M：DNA Marker2000；1：B22菌株；2：D38菌株；3-21：接合菌株。

图6各菌株单核细胞增生利斯特氏菌特异性基因hlyf的PCR鉴定结果；M：DNA Marker 2000；1：D38菌株；2：B22菌株；

3-21：接合菌株。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1本发明菌株的分离鉴定

一、试验材料

1样品来源哈尔滨市各大超市和集贸市场采集鲜猪肉。

2标准菌株单核细胞增生利斯特氏菌CMCC54006购自中国医学细菌保藏中心。

3培养基LB₁、LB₂增菌液和SIM动力半固体培养基购自北京陆桥生物公司，科玛嘉利斯特显色培养基购自郑州博赛生物工程有限责任公司，TSA-YE固体培养基、TSB-YE液体培养基购自青岛海博生物技术有限公司产品，血平板由哈尔滨兽医研究所细菌室自制。

4引物单核细胞增生利斯特氏菌特异性引物(检测溶血素基因hlyf的引物)由金思特科技(南京)有限公司合成。引物序列如下：

Hlyf-U：5′-CGCAACAAACTGAAGCAAAGG-3′，

Hlyf-L：5′-TTGGCGGCACATTTGTCAC-3′

二、试验方法

1菌株分离按照国标《食品卫生微生物学检验-单核细胞增生利斯特氏菌》GB/T 4789.30-2008进行：以无菌操作取样品25g加入到225mL LB₁增菌液中，30℃培养24h后，移取0.1mL转种于10mL LB₂增菌液内进行二次增菌，于30℃培养24h。取LB₂二次增菌液划线接种于科玛嘉利斯特显色培养基上，37℃培养24h后，挑取可疑菌落划线培养于血琼脂平板，37℃培养24h。然后选择血平板上可疑菌落穿刺于SIM半固体培养基，25℃培养48h，观察其生长情况。并进一步将疑似菌落接种于TSA-YE培养基上进行纯培养。

2菌株鉴定

2.1染色镜检参照《伯杰细菌鉴定手册》(R.E.布坎南，N.E.吉本斯.中国科学院微生物研究所《伯杰细菌鉴定手册》翻译组译.伯杰细菌鉴定手册[M].第8版.北京：科学出版社，1984.)，进行革兰氏染色，观察细菌的形态结构。同时，用生理盐水制成菌悬液，在油镜下观察该菌的运动情况。

2.2API Listeria鉴定将上述鉴定为疑似单核细胞增生利斯特氏菌的菌落制成菌悬液，注入API Listeria试剂条上的每一个小管，在需氧条件下，37℃培养24小时，参考说明书中读表，在3分钟内读完所有的反应。

2.3PCR鉴定将API Listeria试剂条鉴定为单核细胞增生利斯特氏菌阳性的菌落接种于TSB-YE培养基，37℃培养24h后，用基因组DNA提取试剂盒提取该菌株的基因组。然后以94℃预变性3min；94℃变性30s，61℃退火35s，72℃延伸35s，30个循环；72℃终延伸5min的反应条件PCR扩增单核细胞增生利斯特氏菌的特异性基因hlyf。

三、试验结果

1菌落特征在科玛嘉利斯特菌显色培养基上形成蓝色带有白色晕环的圆形菌落，大小为1-2mm。且此菌落在血平板上可形成狭窄、透明的β溶血环，穿刺于SIM半固体培养基，可见细菌沿穿刺线扩散生长，呈云雾状，距培养基表面数毫米处出现一个倒伞形生长区。进一步经革兰氏染色鉴定，此类菌落为阳性短杆菌，两端钝圆，多单在，有的呈V字型排列。在油镜下观察可见明显的旋转翻滚运动。

2.2API鉴定结果无害利斯特氏菌/单核细胞增生利斯特氏菌阴性，七叶苷阳性，α-甘露糖苷酶阴性，D-阿拉伯醇阳性，D-木糖阴性，鼠利糖阳性，D-甲基-葡萄糖苷阳性，核酸阴性，1-磷酸葡萄糖阴性，D-塔格糖阴性。

2.3PCR鉴定结果从API Listeria试剂条鉴定为阳性的菌株中均扩增到大小为210bp的特异性基因片段hlyf，证实分离到的菌株为单核细胞增生利斯特氏菌(见图1)。

实施例2本发明菌株的耐药谱分析

一、试验材料

试验用药敏片均购自北京天坛药物生物技术开发公司。

二、试验方法

将本发明实施例1所分离到的D38菌株接种到TSB-YE培养基，37℃培养18h后用灭菌生理盐水洗下，并稀释菌液至0.5麦氏比浊，菌液浓度校正后在15min内接种完毕。用灭菌棉拭子蘸取菌液，在管内壁将多余菌液旋转挤去后在TSA-YE平板均匀涂布接种3次，每次旋转平板60°，最后沿平板边缘涂布一圈。加盖后放置5min，待平板稍干后用镊子将药敏纸片平放在平板上，并轻压使其紧贴平板表面。每个平板贴4张药敏纸片，两纸片相距25mm，纸片与平板边缘不小于15mm，贴好纸片的平板于37℃培养18h后观察结果。

三、试验结果

试验结果如下(抑菌环直径)：万古霉素22.5mm、多西环素16.6mm、麦迪霉素27.0mm、克拉霉素32.0mm、磷霉素0.0mm、呋喃妥因19.0mm、多粘菌素B9.0mm、氨苄西林29.0mm、四环素9.5mm、卡那霉素19.0mm、链霉素17.0mm、氯霉素25.0mm、诺氟沙星11.5mm、先锋V26.0mm、林可霉素16.0mm、红霉素26.0mm、罗红霉素31.0mm、青霉素28.0mm、利福平23.0mm、头孢噻吩25.0mm、头孢噻肟0.0mm、庆大霉素20.0mm、复方新诺明28.0mm、环丙沙星19.0mm。

根据NCCLS判断标准，本发明菌株对磷霉素、四环素、诺氟沙星和头孢噻肟四种药物耐受，为四重耐药菌株。

实施例3本发明菌株四环素耐药基因的确定

一、试验材料

1试剂：DNA Marker、Ex Taq酶购自大连宝生物工程有限公司。

2引物：四环素耐药基因tetM特异性引物由金思特科技(南京)有限公司合成。引物序列如下：

tetm-U  5′-ACAGAAAGCTTATTATATAAC-3′

tetm-L  5′-TGGCGTGTCTATGATGTTCAC-3′

二、试验方法

将本发明D38菌株接种于TSB-YE培养基，37℃培养24h后，用基因组DNA提取试剂盒提取该菌株的基因组。然后以95℃预变性5min，94°变性30s，50°退火30s，72°延伸1min，30个循环，72°终延伸10min的反应条件PCR扩增四环素耐药基因tetM。

三、试验结果

从本发明菌株中扩增到大小约171bp的特异性基因片段tetM。具体扩张结果见图2.

实施例4本发明菌株四环素耐药基因的接合转移试验

一、试验材料

1供体菌株：本发明实施例1所分离的D38菌株；

2受体菌株：耐受红霉素的猪链球菌(B22)由哈尔滨兽医研究所提供。

3引物：四环素耐药基因tetM、红霉素耐药基因ermB、单核细胞增生利斯特氏菌特异性基因hlyf及猪链球菌特异性基因cps的引物均由金思特科技(南京)有限公司合成。引物序列分别如下：

tetm-U 5′-ACAGAAAGCTTATTATATAAC-3′

tetm-L 5′-TGGCGTGTCTATGATGTTCAC-3′

ermB-U 5′-GCGGATCCATGAACAAAAATATAAAAT-3′

ermB-L 5′-GCGTCGACTTTCCTCCCGTTAAATAAT-3′

hlyf-U：5′-CGCAACAAACTGAAGCAAAGG-3′-3′

hlyf-L：5′-TTGGCGGCACATTTGTCAC-3-3′

CPS-U 5′-ATGTTTGGAATACGCAGAGCAAAGAT-3′

CPS-L 5′-CAACAAGGGCTATTAAAGATACCGC-3′

二、试验方法

1.从新鲜培养D 38、B22的TSA-YE平板上挑取单菌落分别接种到含四环素(浓度20μg/mL)和红霉素(浓度5μg/mL)的TSB-YE液体培养基中，37℃ 200rpm培养过夜。

2.分别将过夜培养的D38、B22菌液以1％的接种量转接到四环素(浓度20μg/mL)和红霉素(浓度5μg/mL)的TSB-YE液体培养基中，37℃200rpm培养2-3h。当两种菌液的OD₆₀₀为0.4-0.5时，停止培养。

3.将两种菌液分别取1mL 6000rpm离心5min，用相应无抗的液体培养基漂洗3-5次。将两种菌液以1∶1比例混合(各取100μL)，常温下6000rpm，离心5min。

4.彻底去上清，加入100μL新鲜的TSB-YE液体培养基重悬细菌沉淀。

5.将细菌重悬液50μL点种于不加抗生素的TSA-YE固体培养基平板上的硝酸纤维素膜上，37℃接合反应24h。

6.用1.5mL新鲜的TSB-YE液体培养基把硝酸纤维素膜上接合好的菌重新收集，6000rpm离心3min，用200μL TSB-YE液体培养基悬起，分别取100μL菌悬液涂布于含四环素(浓度20μg/mL)和红霉素(浓度5μg/mL)的筛选培养基平板上，37℃培养24h。

7.挑选长出的单菌落在不含四环素和红霉素的TSA-YE培养基平板上进行3次传代培养，37℃过夜培养。

8.挑取传代3次的单菌落，在含四环素(浓度20μg/mL)和红霉素(浓度5μg/mL)的TSB-YE液体培养基中37℃过夜培养。

9.PCR鉴定前样品处理：取1mL菌液与1.5mL EP管中，12000rpm离心3min，弃去培养基。用1mL水将菌悬起，12000rpm离心3min，弃上清，如此反复洗3次。用50μL水将菌悬起，沸水煮样6min后迅速冰浴10min。12000rpm离心3min，取上清。将此上清做为模板进行PCR鉴定。

10.采用PCR方法分别对供体菌株、受体菌株及接合菌株的红霉素耐药基因ermB、四环素耐药基因TetM、猪链球菌特异性基因Cps及单核细胞增生利斯特氏菌特异性基因Hlyf进行扩增。其中tetM基因和hlyf基因的PCR反应条件如前所述。ermB基因的反应条件为：95℃预变性5min，94°变性1min，50°退火1min，72°延伸1min，30个循环，72终延伸10min。cps反应条件为：95℃预变性5min，94°变性30s，50°退火30s，72°延伸1min，30个循环，72°终延伸10min。

三、试验结果

1.本发明菌株D38与猪链球菌B22接合共得到接合菌株19株，接合转移率为4×10^-7。

2.接合菌株经PCR鉴定结果如下：接合菌株均扩增到大小约751bp的红霉素耐药基因ermB(图3)、大小约171bp的四环素耐药基因tetM(图4)及大小约351bp的猪链球菌B22特异性片段cps(图5)，未扩增到单核细胞增生利斯特氏菌特异性基因hlyf(图6)。

上述试验结果说明本发明菌株D38中的四环素耐药基因通过接合作用转移到了猪链球菌B22中。