铜污染土壤的海州香薷总黄酮提取物在制备血管扩张药物中的应用

摘要

本发明公开了铜污染土壤的海州香薷总黄酮提取物在制备血管扩张药物中的应用。本发明的海州香薷总黄酮的舒血管效应明显优于杭白菊总黄酮提取物、银杏叶总黄酮和大豆总黄酮。

说明书

技术领域

本发明涉及铜污染土壤的海州香薷总黄酮提取物在制备血管扩张药物中的应用。

背景技术

重金属污染土壤的绿色植物修复技术，是通过植物光合作用，充分利用太阳能，吸收固定空气中的CO₂，转化为生物质中的碳；同时通过收割大量富含重金属的生物质，达到带走土壤中重金属的目的；是一种具有低廉高效、环境友好、绿色低碳等优势的生物环保创新技术，已经得到了国内外各级政府和科学家的高度认可。我国铜富集植物海州香薷能耐受污染土壤中的高铜，明显降低污染土壤中水溶态或醋酸提取态铜含量，在不破坏农田生态环境和种植功能的前提下，能够降低污染土壤中有效态铜含量，恢复土壤农耕、保障食品安全(中国专利，ZL200310108946.1，铜污染土壤的生物原位修复方法)。而且，我国大面积存在的镉铅铜中轻度污染农业土壤，我国Zn/Cd超积累及Pb富集植物东南景天、Cu富集植物海州香薷及其修复应用技术已经得到国内很多单位的采用；在上海望新中轻度污染蔬菜基地、浙江省富阳重金属污染农业土壤修复基地、浙江省慈溪市中轻度污染蔬菜基地，利用海州香薷-东南景天-蔬菜互作或间套作模式，已经建立了适合于我国国情的镉铅铜中轻度污染农业土壤的“边生产边修复”创新技术。土壤污染的修复植物是可再生的生物质资源；当今国际土壤学、植物营养学、环境科学领域的研究重点和难点是，如何将土壤修复植物高附加值利用，开发生物基化学品，实现重金属污染土壤的植物修复与可再生生物质资源利用的紧密结合。

海州香薷是唇形科香薷属植物，在东南亚地区多作为民间药草使用。近年来对海州香薷化学成分和药理作用的研究表明，其叶片和花枝的乙醇提取物在临床上有较好的抑菌抗炎、抗氧化功能。研究表明铜耐性/富集植物海州香薷能够及时清除铜离子产生的氧自由基，保护细胞膜完整性。铜污染土壤中生长的海州香薷全草、花枝等含有黄酮成分，我们已经报道了海州香薷总黄酮提取的方法(中国专利，ZL 200610050201.8，从铜污染土壤的修复植物海州香薷中提取总黄酮的方法)。生物类黄酮具有清除自由基和抗氧化的能力，其作用机理在于它阻止了自由基在体内的产生。生物类黄酮可以通过抗自由基作用直接抑制癌细胞生长及抗致癌因子达到抗癌、防癌作用；还可以保护细胞免受致癌因子损害。而且，生物类黄酮可以防止低密度脂蛋白发生脂质过氧化反应，降低病人血浆中的低密度脂蛋白被氧化的易感系数，提高血浆中低密度脂蛋白的抗氧化、抗凝聚、抗滞留能力，因而，可用来治疗各种因血脂高、脂质氧化所引起的疾病。

近年来，天然植物(如银杏、沙棘、大豆和杭白菊)的心血管效应受到了国内外学者的高度重视，目前对其有效部位的研究已经成为新药开发的热点。多项研究显示一些天然植物的黄酮类成分可通过减轻心脏缺血/复灌损伤发挥其心脏保护作用，通过舒张血管发挥其降低血压的作用。近年来的研究显示，大豆黄酮可剂量依赖性的舒张苯肾上腺素预收缩的大鼠主动脉，(IC₅₀＝33.6μM)[Santosh KM，Stewart EA，Choudhury Z，Cheng M，Khatab N，et al.Endothelium-dependent relaxation of rat aorta and main pulmonaryartery by the phytoestrogens genistein and daidzein.Cardio Res，2000，40：539-546]，而且大豆黄酮还可内皮非依赖性的舒张由去甲肾上腺素、KCl、CaCl₂预收缩的肠系膜动脉[Nevala R，Korpela R，Vapaatalo H.Plant-derived estrogens relax rat mesentericartery in vitro.Life Sci，1998，63(6)：95-100]。Torregrosa等观察了大豆黄酮等植物雌激素对家兔离体大脑动脉的作用，结果发现大豆黄酮可以剂量依赖性的舒张大脑基底动脉环[Torregrosa G，Burguete MC，Perez-Asensio FJ，Salom JB，Gil JV，AlborchE.Pharmacological profile of phytoestrogens in cerebral vessels：in vitrostudywith rabbit basilar artery.Eur J Pharmacol，2003，15，482(1-3)：227-234]。蒋惠娣等利用大鼠胸主动脉环模型，证实杭白菊乙酸乙酯提取物(CME)具有显著的舒血管作用[Jiang Huidi，Wang Lingfei，Zhou Xinmei，et al.Vasorelaxant effect andunderlying mechanism of EtoAc extract from Chrysanthemum morifolium in ratthoracic aorta.China Journal of Pathophysiology.2005，21(2)：334-338]。但未见有关沙棘和银杏叶总黄酮提取物舒张血管效应的报道。

目前，尚没有海州香薷总黄酮提取物具有舒张血管作用的文章被发表。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种铜污染土壤的海州香薷总黄酮提取物的用途：用于制备血管扩张药物。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种铜污染土壤的海州香薷总黄酮提取物在制备血管扩张药物中的应用。

本发明的铜污染土壤的海州香薷总黄酮提取物(Total Flavonoids of ElsholtziaSplendens，TFES)对离体大鼠胸主动脉具有剂量依赖性的血管舒张活性；50-100μg/ml中等浓度剂量的海州香薷总黄酮，可时间依赖性舒张苯肾上腺素(PE，10^-2mol/L)预收缩的胸主动脉血管环，其出现明显舒血管效应的时间为10min；且上述舒血管效应具有部分内皮依赖性。

本发明所说的剂量依赖性的心血管舒张活性，是200μg/ml高浓度剂量的海州香薷总黄酮TFES，使苯肾上腺素(PE)预收缩的内皮完整的离体大鼠胸主动脉血管环张力最大舒张效果可达91±5％，使KCl预收缩的内皮完整、去内皮的离体大鼠胸主动脉血管环张力最大舒张效果分别为55±8％和48±7％。

本发明所说的部分内皮依赖性的血管舒张活性，是一氧化氮合酶抑制剂L-NAME(0.1mmol/L)和鸟苷酸环化酶抑制剂ODQ(5×10^-4mol/L)预处理对TFES诱导的内皮完整动脉环舒张作用具有明显的抑制效应，但环氧合酶抑制剂吲哚美辛(Indo，0.01mmol/L)预处理对TFES诱导的内皮完整动脉环舒张作用无明显抑制作用。

本发明的离体大鼠胸主动脉血管环，是将体重为240-260g的Sprague-Dawley(SD)大鼠断头后迅速取出胸主动脉，置于通混合气的冰冷K-H液中，剔除周围结缔组织，剪成3-4mm宽的血管环。

本发明的大鼠胸主动脉血管环张力，是将血管环悬挂于盛有5ml K-H液的37℃恒温浴槽中，通以95％O₂+5％CO₂的混合气体，在孵育液中加入海州香薷总黄酮等实验试剂，采用RM6240微机信号采集系统记录血管环张力变化。

本发明中所用的海州香薷总黄酮提取物，可按申请号为200610050201.8的《从铜污染土壤的修复植物海州香薷中提取总黄酮的方法》进行制备，具体为：将种植在铜污染土壤的盛花期海州香薷全草、花枝和种子，风干后得到的风干物，粉碎并过10目筛至50目筛，加入10倍重量份至20倍重量份的体积浓度为40％-60％的水-乙醇混合溶剂，浸泡至微沸回流提取2次至3次，每次1小时至3小时，合并提取液，放置室温后，过滤，滤液减压浓缩，回收乙醇后，分别用蒸馏水、石油醚洗涤，除去杂质，然后母液分别用乙酸乙酯、正丁醇萃取，浓缩正丁醇萃取层后，得到棕黄色的海州香薷总黄酮粉末。

本发明的海州香薷总黄酮提取物作为血管扩张药物时，具体用法和用量如下：

根据离体动物实验有效剂量(IC₅₀＝50±6mg/L)，海州香薷总黄酮提取物作为血管扩张药物整体应用时，静脉注射5～20mg/kg(体重)海州香薷总黄酮提取物则可产生明显血管舒张效应。

本发明的显著优点和效果如下：

a)、本发明是以修复铜污染土壤的铜耐性/富集植物海州香薷为原料，具有显著的生态环境效应。重金属污染土壤的绿色植物修复技术，是通过植物光合作用，充分利用太阳能，吸收固定空气中的CO₂，转化为生物质中的碳，通过生物固碳降低空气中CO₂浓度；同时通过收割大量富含重金属的生物质，达到带走土壤中重金属的目的。海州香薷富集植物带走中轻度污染土壤的重金属时，预计每公顷污染土壤可生产植物生物量7.9吨/年(干重)，依据生物固碳8万元/吨的生态补偿机制计算，仅此项经济效益每公顷污染土壤为63.2万元/年，在减少CO₂浓度方面会产生重大国际环境效应。

b)、随着海州香薷植物修复铜污染土壤的大规模田间示范和应用推广，植物修复材料的产后处置和资源化是个急需解决的环境问题，可再生植物资源海州香薷中黄酮的开发利用，为拓展海州香薷黄酮在心血管疾病研究方面提供基础，促进我国可再生生物质植物资源的循环利用。

c)、本发明采用了简单合理的工艺条件，通过对水-醇浓度、乙醇用量、浸提时间的有效控制，使铜耐性/富集植物海州香薷全草、花枝和种子干粉中，总黄酮溶出量粗提物可达7.4-16％，对提取物进行离体大鼠胸主动脉的血管舒张作用测定，显示提取物具有部分内皮依赖性舒张血管效应，为从提取物中发现具有治疗心血管疾病的先导化合物提供了依据。

综上所述，本发明充分开发利用了铜耐性/富集植物海州香薷总黄酮提取物(totalflavonoids of Elsholtzia splendens)，测定了提取物对大鼠主动脉血管的舒张活性、及其诱导的血管舒张活性是否具有内皮依赖性；从而得出海州香薷总黄酮提取物能用于制备血管扩张药物。本发明创建了适合我国国情的土壤植物修复材料--海州香薷产后高附加值利用的新途径，从而促进我国铜污染土壤植物修复的可持续发展。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为实施例1中海州香薷总黄酮(TFES)对苯肾上腺素(PE)预收缩大鼠胸主动脉张力的影响；

图中：Mean SD，n＝12；^*P＜0.05，^**P＜0.01vs Control(Control代表对照；E+代表内皮完整)；^#P＜0.05，^##P＜0.01vs Control(Control代表对照；E-代表去内皮)。

图2为实施例2中海州香薷总黄酮(TFES)对KCl预收缩大鼠胸主动脉张力的影响；

图中：Mean SD，n＝12；^##P＜0.01 vs Control(Control代表对照；E+代表内皮完整)；^*P＜0.05vs Control(Control代表对照；E-代表去内皮)。

图3为实施例3中海州香薷总黄酮(TFES)对大鼠离体胸主动脉血管环舒张作用的时间依赖性。

图4为实施例4中L-NAME，ODQ或吲哚美辛(Indo)预处理对香薷总黄酮(TFES)血管舒张作用的影响；

图中：Mean SD，n＝12；^**P＜0.01，L-NAME+TFES组vs ES组；^#P＜0.01，ODQ+TFES组vs TFES组。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

下述实施例1～4中所用的海州香薷总黄酮提取物(TFES)均可按照如下方法得到：

盛花期收获种植在铜污染土壤的海州香薷花枝，烘干，粉碎后，过40目筛。称取干粉50g，用体积浓度为60∶40的乙醇-水溶液5000毫升，回流浸提4小时，冷却，抽滤，滤渣继续用同一种溶液提取，反复3次，冷却，抽滤，合并滤液，分光光度计测总黄酮含量为11.8％。乙醇回收，固体继续用蒸馏水稀释总黄酮粗提物，除去水不溶性杂质，再用石油醚萃取，除去脂溶性杂质，然后母液用乙酸乙酯萃取，除去乙酸乙酯萃取层，最后母液用正丁醇萃取，减压浓缩正丁醇萃取层，冷冻干燥得到总黄酮8.0克。

实施例1、海州香薷总黄酮提取物(TFES)对苯肾上腺素(PE)预收缩大鼠胸主动脉张力的影响

TFES对PE预收缩的内皮完整主动脉环张力影响组(n＝9)：选择内皮完整的血管环，加入PE(1μmol/L)预收缩的大鼠胸主动脉达稳态后，累积加入TFES，使灌流液中TFES浓度分别达5、10、25、50、100、200μg/ml；以加入TFES后的血管张力幅度与PE诱发的血管环的最大收缩幅度之间的比值反映血管张力的变化，绘制TFES对PE预收缩的内皮完整主动脉环的TFES浓度-舒张曲线。TFES对PE预收缩主动脉环张力影响组(n＝9)：使用去除内皮的血管环，其余方法同上，绘制TFES对PE预收缩的去内皮主动脉环的TFES浓度-舒张曲线(图1)。

结果表明，TFES浓度为5、10、25、50、100、200μg/ml，可使PE预收缩的内皮完整的主动脉血管环有明显的舒张作用(^#p＜0.01)，并呈现浓度依赖性(图1)，最大舒张效果可达91±5％；去除内皮后，这种舒张作用部分被取消。

上述实施例1中所用的大鼠离体胸主动脉环的制备方法如下：将体重为240-260g的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠断头后迅速取出胸主动脉，置于通混合气的冰冷K-H液中，小心去除周围结缔组织，血管剪成3-4mm宽的血管环。根据实验需要去内皮，将血管环悬挂于经37℃预热容量为5mLK-H液的浴槽内，一端固定，一端通过张力换能器连接RM6240微机信号采集系统，记录血管环张力。调零30min后，静息张力设为2g，平衡1h。加入60mmol/L KCl，重复3次，以激发血管环活性。加入1μmol/L苯肾上腺素PE预收缩血管环达峰值，加入10μmol/L ACh检验血管内皮完整性。以PE或KCl诱发最大收缩幅度为100％，以加入药物后的血管张力幅度与PE或KCl诱发最大收缩幅度之间的比率反映血管张力的变化。

实施例2、海州香薷总黄酮提取物(TFES)对KCl预收缩大鼠胸主动脉张力的影响

TFES对内皮完整KCl预收缩主动脉环张力影响组(n＝9)：选择内皮完整的血管环，用KCl(60mmol/L)预收缩达到稳态后，采用累积加药法加入TFES，使灌流液中TFES浓度分别达5、10、25、50、100、200μg/ml；以加入TFES后的血管张力幅度与KCl诱发的血管环的最大收缩幅度之间的比值反映血管张力的变化，绘制TFES对PE预收缩的内皮完整主动脉环的TFES浓度-舒张曲线。TFES对去内皮KCl预收缩主动脉环张力影响组(n＝8)：使用去除内皮血管环，其余方法同上，绘制TFES对KCl预收缩的去内皮主动脉环的TFES浓度-舒张曲线(图2)。

结果表明，TFES对KCl预收缩的内皮完整或去内皮胸主动脉均产生浓度依赖性的舒张作用，最大舒张效果分别为55±8％和48±7％(图2)。

大鼠离体胸主动脉环的制备方法同实施例1中的方法。

实施例3、TFES对大鼠离体胸主动脉血管环舒张作用的时间依赖性

选择内皮完整，用PE(1μmol/L)预收缩内皮完整主动脉环达稳态后，加入TFES(0.05g/ml)使灌流液浓度达到100μg/ml，每3min记录血管张力变化；同时选择去内皮的主动脉环，用PE(1μmol/L)预收缩去内皮主动脉环达稳态后，方法同上，每3min记录血管张力变化；测定TFES舒血管作用是否存在时间依赖性(图3)。

结果表明，对内皮完整的血管环用PE预处理，在保持TFES为100μg/ml浓度环境下观察血管的张力变化，得到血管内皮最大舒张程度是峰值的9.31％±0.11，最大舒张时间T_max及舒张一半时间T_1/2分别大于60min和19.78±3.56min。对去内皮血管进行相同操作，得到血管内皮最大舒张程度是峰值的14.00％±0.25，最大舒张时间T_max及舒张一半时间T_1/2分别为大于60min和35.51±7.12min，有内皮组的T_1/2显著性小于无内皮组的(p＜0.05)(图3)。

实施例4、L-NAME、ODQ、吲哚美辛预处理对TFES诱导的舒张反应的影响

内皮完整的主动脉环，分别用100μmol/L一氧化氮合酶抑制剂(L-NAME)、500μmol/L鸟苷酸环化酶抑制剂(ODQ)或10μmol/L环氧合酶抑制剂吲哚美辛预处理30min后，再用PE(1μmol/L)预收缩血管达稳态后，采用累积加药法加入TFES，使灌流液中TFES浓度分别达5、10、25、50、100、200μg/ml；观察内皮完整主动脉环的TFES浓度-舒张曲线(图4)。

结果表明，L-NAME和ODQ预处理对TFES诱导的内皮完整动脉环舒张作用具有明显的抑制效应，但吲哚美辛预处理对香薷总黄酮诱导的内皮完整动脉环舒张作用无明显影响(图4)。说明TFES的部分内皮依赖性舒血管作用机制涉及NO-cGMP信号转导途径，为海州香薷总黄酮在心血管疾病防治中的应用提供了依据。

对比实验：以多种不同的总黄酮提取物作为实验对象，分别按照实施例1所述的方法测定其对苯肾上腺素(PE)预收缩大鼠胸主动脉张力的影响，选择内皮完整的血管环，使灌流液中总黄酮提取物的浓度为100μg/ml，结果如下：

100μg/ml的杭白菊总黄酮提取物可使苯肾上腺素预收缩的大鼠胸主动脉舒张约69±6％；

100μg/ml的银杏叶总黄酮和100μg/ml的大豆总黄酮的血管舒张效应分别为70±5％和71±6％；

而本发明所述的100μg/ml的海州香薷总黄酮的舒张效应为78±7％。

以上结果说明：本发明的海州香薷总黄酮的舒血管效应明显优于杭白菊总黄酮提取物、银杏叶总黄酮和大豆总黄酮。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。