农田就地培养生产丛枝菌根真菌生物菌剂肥料的方法

摘要

农田就地培养生产丛枝菌根真菌生物菌剂肥料的方法，属于其特征在于包括以下步骤：1)农田培养池及培养基质的制作；2)移植丛枝菌根真菌共生体及其培养；3)生物肥料吸收转化；4)生物肥料的收集。本发明与现有技术相比存在以下有益效果：1)取材容易，培养简单，成本低廉；2)培养技术和生产技术便于在农村推广应用；3)生产技术绿色环保，有利于发展现代农业。且本发明的肥料可以降低速效化肥的用量，减少部分农药的施用量，从而可以以减轻对土壤、水资源和大气的污染，尤其适用于农作物幼苗和药用植物的栽培。试验表明，使用本发明的肥料的农作物比普通培养的农作物增产达50％以上。

说明书

技术领域

本发明属于生物肥料的生产技术领域，具体涉及一种农田就地培养生产丛枝菌根真菌生物菌剂肥料的方法。

背景技术

丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)是古老而广泛的共生体，与陆地上80％以上的植物有共生关系。在这种共生系统中，植物经光合作用合成的糖类可以输送给AM真菌的内生菌丝(一般是己糖)，内生菌丝把己糖合成脂类，再输送给外生菌丝，以供该菌的生长繁殖。AM真菌将菌丝伸延到土壤中去，从而扩大了植物的吸收面，可以提高对土壤营养物质的吸收，如P、N、S、Zn和水等物质，增强植物对疾病的抵抗力和抗旱能力。但是AM真菌是共生专一性的，必须在有植物根宿主存在的条件下才能生长繁殖，从而完成其生命循环过程，因此其菌剂的生产则较困难，在实际生产中的应用一直受到限制。

AM真菌是世界上分布最广泛的菌根类型，其寄生范围比外生菌根要广泛得多。当前菌根生物技术研究方向首先是菌根接种体的大量繁殖问题，特别是AM真菌。我国已基本具备AM真菌菌剂生产技术，然而，由于缺少基础设施和设备的投入，再加上农田推广应用的运输和使用成本高，至今没有进行大规模工厂化生产。

而发展农田就地培养AM真菌生物活性肥料技术，可以适用于绿色和有机农产品的生产应用，大大降低使用成本，便于推广应用。利用内生AM真菌可以有效吸收有机农家肥(动物粪便)及其它不同种类的氮源(味精废液和蛋白水解液)，如NO₃^-，NH₄⁺，氨基酸和可溶性蛋白质，也可以提高其它肥料(磷P)的吸收。AM真菌生物活性菌剂肥料通过吸收无机和有机氮可以提高这些普通氮肥的利用效率，具有缓释氮肥的功效，减少湖泊河流中的硝酸盐含量。

此外，当前的生物肥料主要集中于细菌，如根瘤菌，固氮菌，硅酸盐细菌，解磷和解钾菌，还没有共生真菌类生物肥料。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种农田就地培养生产丛枝菌根真菌生物菌剂肥料的技术方案，该方法简单，成本低廉，绿色环保，便于在农村推广利用。

所述的农田就地培养生产丛枝菌根真菌生物菌剂肥料的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)农田培养池及培养基质的制作

在农田中，用聚乙烯塑料膜和木桩围成培养池，然后在培养池中加入由热火坌5-15份，蛭石40-60份，腐殖性土20-30份混合而成的培养基质；

2)移植丛枝菌根真菌共生体及其培养

将培养好的寄主植株与丛枝菌根真菌的共生体，移栽至培养池中进行培养，培养期间，每一星期在培养基质中浇营养液一次，同时再在每株共生体中浇入根浸出原液，复合氨基酸营养液和腐殖酸铵溶液，

所述的营养液配方为：KNO₃ 300-500mg/L，Ca(NO₃)₂ 520-720mg/L，MgSO₄ 160-360mg/L，H₃BO₃ 3-6mg/L，MnCl₂.4H₂O 1-5mg/L，ZnSO₄.7H₂O 1-5mg/L，CuSO₄.5H₂O 0.05-1mg/L，H₂MoO₄.H₂O 0.05-1mg/L，

所述的根浸出原液为：培养Ri T-DNA转化的胡萝卜根组织得到的液体，

所述的复合氨基酸营养液为：17种标准氨基酸的混合溶液；

3)生物肥料吸收转化

寄主植株与丛枝菌根真菌的共生体在培养池中培养6-8周后，在离寄主植株10-15cm处用300-500目尼龙网将培养池隔成两室，在没有共生体的一室培养池中，加入动物粪便，味精废液或蛋白水解液，以便穿过尼龙网的丛枝菌根真菌菌丝进行生物肥料的吸收转化；

4)生物肥料的收集

生物肥料的吸收转化4-8个星期后，去除寄主植株的叶和茎，收集寄主植株的根和丛枝菌根真菌菌丝，并和培养池中的培养基质搅拌，即得到丛枝菌根真菌生物菌剂肥料。

所述的农田就地培养生产丛枝菌根真菌生物菌剂肥料的方法，其特征在于所述的步骤1)中培养基质含有热火坌10-15份，蛭石50-60份，腐殖性土25-30份。

所述的农田就地培养生产丛枝菌根真菌生物菌剂肥料的方法，其特征在于所述的步骤2)中所述的寄主植株为洋葱或百喜草，所述的丛枝菌根真菌为根内球囊霉、摩西球囊霉、幼套球囊霉或本土丛枝菌根真菌的一种或一种以上的混合菌体。

所述的农田就地培养生产丛枝菌根真菌生物菌剂肥料的方法，其特征在于所述的步骤2)中所述的寄主植株与丛枝菌根真菌的共生体为寄主根侵染率达50-90％，孢子数达10-20个/g的共生体。

所述的农田就地培养生产丛枝菌根真菌生物菌剂肥料的方法，其特征在于所述的步骤2)中每一星期浇15-25ml营养液一次，同时再在每株共生体中加入根浸出原液10-25ml，复合氨基酸营养液15-25ml，浓度为1-3％的腐殖酸铵溶液2-5ml，

所述的营养液含有：KNO₃ 350-450mg/L，Ca(NO₃)₂ 550-600mg/L，MgSO₄200-300mg/L，H₃BO₃ 4-5mg/L，MnCl₂.4H₂O 2-4mg/L，ZnSO₄.7H₂O 2-4mg/L，CuSO₄.5H₂O 0.1-0.5mg/L，H₂MoO₄.H₂O 0.1-0.5mg/L。

所述的农田就地培养生产丛枝菌根真菌生物菌剂肥料的方法，其特征在于所述的步骤3)中尼龙网为400目。

所述的农田就地培养生产丛枝菌根真菌生物菌剂肥料的方法，其特征在于所述的步骤3)菌丝进行生物肥料的吸收转化的同时，通过剪去部分寄主植株的叶片或向寄主植株叶片喷洒浓度为0.5％的氨基酸叶面肥，并浇施矮壮素稀释液。

所述的农田就地培养生产丛枝菌根真菌生物菌剂肥料的方法，其特征在于所述的步骤4)中得到的丛枝菌根真菌生物菌剂肥料中加入浓度为1.0％的葡萄糖溶液和根浸出原液制备成农田用栽培肥料。

所述的农田就地培养生产丛枝菌根真菌生物菌剂肥料的方法，其特征在于 所述的丛枝菌根真菌生物菌剂肥料、葡萄糖溶液与根浸出原液三者的重量比为100∶0.5-5∶0.05-0.5。

本发明利用内生AM真菌菌丝吸收无机、有机氮和其它营养物质的能力，以及菌丝储存和输送N给植物的机理，使用特殊的培养基质和植物宿主，培养好该菌的共生体(菌丝和孢子)，再把该共生体由农民自己在耕作地进行大批量地培养，同时可以施加有机肥和化学氮肥，甚至可以使用味精发酵废液(含有高浓度(NH₄)₂SO₄和多种氨基酸)，为菌体充分吸收后，把N主要以精氨酸(Arg)形式储存在菌体中，再制做成生物菌剂肥料播种于农作物的根部，来增产增收。

该生物菌剂肥料不同于以固氮菌为主的复合微生物肥料或生物氮肥，而是以AM真菌的繁殖体(孢子，菌丝)为菌剂，以其从培养基质吸收无机和有机氮而储存于菌体内的氮作为生物氮(主要是精氨酸)，再把菌体内的生物氮输送给与其共生的植物，来完成氮的吸收利用过程。该生物氮肥菌剂对宿主专一性不如根瘤菌强，大多数的植物都可被AM真菌所侵染。除了具有氮肥的作用，还具有活化土壤养分、改善作物矿物质营养；提高植物抗旱和抗病能力；促进植物生长发育，增加产量和改善品质等生物功效。

上述的农田就地培养生产丛枝菌根真菌生物菌剂肥料的方法与现有技术相比存在以下有益效果：1)取材容易，培养简单，成本低廉；2)培养技术和生产技术便于在农村推广应用；3)生产技术绿色环保，有利于发展现代农业。

且本发明得到的肥料可以降低速效化肥的用量，减少部分农药的施用量，从而可以以减轻对土壤、水资源和大气的污染，尤其适用于农作物幼苗和药用植物的栽培。试验表明，使用本发明的肥料的农作物比普通培养的农作物增产达50％以上。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步说明本发明。

实施例1

1)农田培养池及培养基质的制作

在农田中，用聚乙烯塑料膜和木桩围成培养池，木桩的间距是60cm×60cm，培养池四周和底部用塑料膜围成，培养池的体积为60cm×60cm×20cm，然后根据培养池的体积在培养池中加入由热火坌15份，蛭石50份，腐殖性土25份混合而成的培养基质；热火坌是农田泥土经稻草焚烧后粉碎而成，蛭石从市场购买，腐殖性土由泥土和树叶残枝堆积腐烂后得到；

2)移植丛枝菌根共生体及其培养

寄主植株与丛枝菌根真菌的共生体：制作培养容器，取不锈钢小桶，大小为6.0×1.1×22.5cm³(上口直径×下口直径×高)，底部有孔，孔用医用纱布堵住，小桶深且镂空，这样有利于真菌菌根根系向下生长，且底部不会积水。每桶装160g沙子，挑选地上部分高度为4-7cm，并长有两片嫩叶的长势较好的寄主百喜草或洋葱幼苗移栽至小桶内，2株/桶，将丛枝菌根真菌大约10-30个孢子接种至寄主苗的根上，丛枝菌根真菌可以为根内球囊霉Glomusintraradices，摩西球囊霉Glomus mosseae，幼套球囊霉Glomus etunicatum或本土丛枝菌根真菌的一种或一种以上的混合菌体。移栽后，每周加2ml/桶Hoagland营养液，每两天浇1次水。

在培养6-8周后，寄主根侵染率达到50％以上，孢子数达到10个/g时，移栽共生体至步骤1)的培养池中进行培养，每个培养池移植5株培养好的共生体，共生体植株的间距是20cm×20cm。培养期间，每一星期浇20ml营养液一次，同时再在每株共生体的周围培养基质中浇入根浸出原液15ml，复合氨基酸营养液20ml，和浓度为3％的腐殖酸铵溶液4ml/每株，这些营养因子有利于菌丝的繁殖和扩展。

所述的营养液配方为：KNO₃ 400mg/L，Ca(NO₃)₂ 620mg/L，MgSO₄260mg/L，H₃BO₃ 4.96mg/L，MnCl₂.4H₂O 2.8mg/L，ZnSO₄.7H₂O 2.22mg/L，CuSO₄.5H₂O0.18mg/L，H₂MoO₄.H₂O 0.19mg/L，不加磷酸盐。

所述的根浸出原液的制作方法：将Ri T-DNA转化的胡萝卜根培养在含有M固体培养基的培养皿中；小心地将根移植到含有蔗糖的液体M培养基中，24℃生长4周；最后收集得到根浸出原液，储存在-20℃备用。

所述的复合氨基酸营养液(浓度约为0.1mmol)为：含有17种标准的氨基酸混合溶液。天冬氨酸，苏氨酸，丝氨酸，谷氨酸，甘氨酸，丙氨酸，胱氨酸，缬氨酸，甲硫氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸，盐酸赖氨酸，组氨酸，精氨酸和脯氨酸。

3)生物肥料吸收转化

寄主植株与丛枝菌根真菌的共生体在培养池中培养6周后，在离寄主植株15cm处用400目尼龙网将培养池隔成两室，在没有共生体的一室培养池中，加入动物粪便，味精废液或蛋白水解液，丛枝菌根真菌穿过尼龙网达到另一室培养池中，进行生物肥料的吸收转化；

4)生物氮的储存

菌丝进行生物肥料的吸收转化的同时，通过剪去部分寄主植株的叶片或向寄主植株叶片喷洒浓度为0.5％的氨基酸叶面肥，用量20ml/株；并用500毫克/升的矮壮素稀释液按每株30-50毫升浇施；

5)生物肥料的收集

生物肥料的吸收转化6个星期后，去除寄主植株的叶和茎，收集寄主植株的根和丛枝菌根真菌菌丝，并和培养池中的培养基质搅拌，即得到丛枝菌根真菌生物菌剂肥料；用MPN法检测生物肥料菌剂产品，含生物氮以精氨酸计约2.5mg/100mg(菌根繁殖体)，活性孢子繁殖体80-100个/克干菌剂肥料。

6)生物肥料应用

得到的丛枝菌根真菌生物菌剂肥料按丛枝菌根真菌生物菌剂肥料、浓度为1％的葡萄糖溶液与根浸出原液三者的重量比100∶1∶0.5，制得农田用栽培肥料，用于农田中栽培幼苗。

实施例2

步骤1)中采用热火坌5份，蛭石40份，腐殖性土20份；步骤2)中采用寄主根侵染率达到80％以上，孢子数达到20个/g的共生体，且培养期间，每一星期浇15ml营养液一次，同时再在每株共生体的周围培养基质中浇入根浸出原液10ml，复合氨基酸营养液15ml，和浓度为2％的腐殖酸铵溶液5ml/每株，采用的营养液配方为：KNO₃ 500mg/L，Ca(NO₃)₂ 720mg/L，MgSO₄ 360mg/L，H₃BO₃6mg/L，MnCl₂.4H₂O 5mg/L，ZnSO₄.7H₂O 5mg/L，CuSO₄.5H₂O 1mg/L，H₂MoO₄.H₂O 1mg/L，不加磷酸盐；步骤3)中寄主植株与丛枝菌根真菌的共生体在培养池中培养6-8周后，在离寄主植株12cm处用500目尼龙网将培养池隔成两室；步骤4)中生物肥料吸收转化4周；其他步骤与实施例1相同，最后得到与实施例1具有相同效果的丛枝菌根真菌生物菌剂肥料，然后按丛枝菌根真菌生物菌剂肥料、葡萄糖溶液与根浸出原液三者的重量比为100∶0.5∶0.05进行配比，制成农田用栽培肥料用于农作物栽培，最后也能取得与实施例1相同的技术效果。

实施例3

步骤1)中采用热火坌10份，蛭石60份，腐殖性土25份；步骤2)中采用寄主根侵染率达到70％以上，孢子数达到15个/g的共生体，且培养期间，每一星期浇25ml营养液一次，同时再在每株共生体的周围培养基质中浇入根浸出原液25ml，复合氨基酸营养液25ml，和浓度为3％的腐殖酸铵溶液2ml/每株，采用的营养液配方为：KNO₃ 300mg/L，Ca(NO₃)₂ 520mg/L，MgSO₄160mg/L，H₃BO₃ 3mg/L，MnCl₂.4H₂O 1mg/L，ZnSO₄.7H₂O 1mg/L，CuSO₄.5H₂O 0.05mg/L，H₂MoO₄.H₂O 0.05mg/L，不加磷酸盐；步骤3)中寄主植株与丛枝菌根真菌的共生体在培养池中培养7周后，在离寄主植株15cm处用400目尼龙网将培养池隔成两室；步骤4)中生物肥料吸收转化6周；其他步骤与实施例1相同，最后得到与实施例1具有相同效果的丛枝菌根真菌生物菌剂肥料，然后按丛枝菌根真菌生物菌剂肥料、葡萄糖溶液与根浸出原液三者的重量比为100∶2∶0.3进行配比，制成农田用栽培肥料用于农作物栽培，最后也能取得与实施例1相同的技术效果。