焦磷酸测序检测HBV拉米夫定耐药突变位点的PCR与测序引物

摘要

一种用于焦磷酸测序检测HBV拉米夫定耐药突变位点的PCR引物与测序引物。引物序列包括：上游引物：5′TATTCCCATCCCATCATC3′下游引物：5′CCCAACWYCCAATTACATATCCC3′测序引物sequencing primer1：5′GCTTTCGCAARATWCC3′；(用于检测rtV173L)sequencing primer 2：5′AGTGGGCCTCAGTCCGTTTC3′；(用于检测rtL180M，rtA181V/T)sequencing primer 3：5′CCAYTGTBTGGCTTTC3′(用于检测rtS202G/I，rtM204V/I)。

说明书

技术领域

本发明是一种适用焦磷酸测序方法检测HBV拉米大定耐药突变位点的PCR引物和测序引物。

背景技术

焦磷酸测序技术是一项新型DNA测序技术。在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将DNA单链上每一个dNTP聚合与一次荧光信号释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。

乙肝病毒(HBV)是双链DNA分子，由3200个左右碱基对(bp)组成，根据HBV基因序列的同源性，可将HBV分为A、B、C、D、E、F，G，H8种基因型。HBV基因组由S、C，P、X4个开放阅读框组成，HBV变异可发生在其4个阅读框的任何一个区域内，常见的基因变异有前c区、c基因启动子区变异异以及HBV聚合酶(P)基因区YMDD变异等。乙肝病毒是一种易高度变异的病毒，在其逆转录复制过程中因RNA聚合酶和逆转录酶缺乏校正功能，可发生一个或多个核苷酸的变异。HBV-DNA可以在慢性持续性感染过程中自然变异，也可以在免疫压力下发生变异，甚至在各种抗病毒治疗药物诱导下变异。HBV变异的发生可引起乙肝病毒的生物学特性发生改变、对药物产生拮抗性，最终导致肝炎再发作。拉米夫定是一种核苷类似物，已广泛应用于慢性乙肝患者的抗病毒治疗，能抑制HBV逆转录酶活性，阻止病毒核酸的复制但长期使用会导致HBV P基因区发生点突变而导致耐药。

乙肝病毒耐药突变的检测方法包括直接测序法，基因芯片法，PCRmnh-ELISA法等。对比这些方法，焦磷酸测序法有其独特的优势，焦磷酸测序具有高通量，操作简便，检测灵敏度高等特点。在焦磷酸测序的过程中，对目的片段很好的扩增和对待测位点的确定是整个实验成功的关键。

发明内容

本发明的目的在于提供适用于焦磷酸检测HBV拉米大定耐药突变的PCR引物和测序引物。

基于以上目的，本发明采用以下技术方案：

用于扩增目的片段的PCR引物序列包括：

上游引物：5′TATTCCCATCCCATCATC3′

下游引物：5′CCCAACWYCCAATTACATATCCC3′

用于检测耐药突变位点的测序引物包括：

sequencing primer1：5′GCTTTCGCAARATWCC3′；(用于检测rtV173L)

sequencing primer 2：5′AGTGGGCCTCAGTCCGTTTC3′；(用于检测rtL180M，rtA181V/T)

sequencing primer 3：5′CCAYTGTBTGGCTTTC3′(用于检测rtS202G/I，rtM204V/I)

本发明的具体是原理是，利用PCR扩增出要检测的目的片段，通过DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶协同作用，将DNA单链上每一个dNTP聚合与一次荧光信号释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时检测DNA序列的目的，再与标准序列比较，得出结果。

附图说明

利用PCR引物对与测序引物进行焦磷酸测序检测HBV DNA rtV173L突变位点测序图。

见附图1

具体实施方式

1，PCR引物的设计：通过对HBV各个基因型进行序列比较分析，选择含有拉米夫定耐药突变位点的P区基因高保守区域，设计多对引物。最优引物为：

上游引物：5′TATTCCCATCCCATCATC3′

下游引物：5′CCCAACWYCCAATTACATATCCC3′

2，测序引物设计，选取拉米夫定耐药突变位点前10个左右碱基，设计测序引物如下：

sequencing primer1：5′GCTTTCGCAARATWCC3′；(用于检测rtV173L)

sequencing primer 2：5′AGTGGGCCTCAGTCCGTTTC3′；(用于检测rtL180M，rtA181V/T)

sequencing primer 3：5′CCAYTGTBTGGCTTTC3′(用于检测rtS202G/I，rtM204V/I)

3，反应体系的优化：病人的血清作为待检样本，分装后保存于-20℃。

3.1，PCR引物浓度的优化：在反应体系中其它条件相同的情况下，将PCR引物的浓度分别从0.1μM至1.6μM作倍比连续稀释，通过实验结果的分析，确定了PCR引物最佳浓度为0.25μM

利用上述引物进行反应体系的建立，最终确定PCR反应体系为50μM。

4，PCR反应条件如下：

95℃2min，1个循环；95℃10sec，52℃15sec，72℃20sec，40个循环；72℃2min，1个循环。

5，上机操作按照测序仪说明书进行设置和操作。

6，检测结果分析：

测序图上直接读出序列，与标准序列比较，如果样品含有拉米夫定耐药突变，测序图上的序列与标准序列会不一致。

本发明的优点在于：

(1)本发明提供的PCR引物扩增目的片段，跑胶结果显示，低至10000拷贝/ml的HBVDNA片段的条带亮，说明本发明提供的PCR引物扩增效率高。

(2)不含目的片段的阴性样本没有条带，说明本发明提供的PCR引物特异性好

(3)从测序图上看，本发明提供的测序引物能很好的检测待测突变位点，灵敏度高。