人乳头瘤病毒和沙眼衣原体嵌合核酸疫苗及其用途

摘要

本发明涉及人乳头瘤病毒和沙眼衣原体嵌合核酸疫苗及其用途。更具体而言，本发明涉及一种包含编码沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位蛋白的核酸序列和编码人乳头瘤病毒6b型L1蛋白的核酸序列的嵌合核酸序列，包含该嵌合核酸序列的重组载体和宿主细胞，以及所述重组载体的制备方法和在制备用于预防或治疗人乳头瘤病毒和沙眼衣原体相关疾病的嵌合疫苗中的用途。本发明的疫苗对HPV和CT相关的疾病具有高效、安全的免疫预防和治疗作用，且制备工艺、免疫过程简单、效果明显、可重复性强。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术和免疫学领域，具体而言涉及一种人乳头瘤病毒和沙眼衣原体嵌合核酸疫苗、其制备方法、及其在防治人乳头瘤病毒感染和相关肿瘤(如尖锐湿疣)和沙眼衣原体感染中的应用。

背景技术

人乳头瘤病毒(HPV)和沙眼衣原体(CT)均为性传播疾病(STDs)的主要病原。

主要由HPV6b和11型感染引起的尖锐湿疣，近几年发病迅猛增长，已跃居STDs发病的第二位，并已波及儿童(咽喉乳头瘤)，且经电灼、激光、手术等现有的方法治疗后极易复发。

而CT则引起男性尿道炎和女性宫颈炎，据报道男性尿道炎中有50-60％由CT感染引起(J，G，B等，Bacteriological finding in the urethra in men with and without non-gonococcal urethritis，患或未患非淋球菌性尿道炎的男性尿道细菌学研究，2007，64(12)：833-6)，并常与其它病原混合感染，通过性传播感染女性泌尿生殖道，导致不良妊娠，如流产、死胎等，并与宫颈癌发生密切相关。CT感染经治疗后极易复发，WHO估计全球约有9千万名CT患者，美国每年用于治疗CT感染耗资数十亿美元(Wang SA，Papp JR，Stamm WE等，Evaluation of antimicrobial resistance and treatment failures for Chlamydia trachomatis：a meeting report.沙眼衣原体耐药性和治疗失败评估：会议报告，J Infect Dis.2005，191(6)：917-23.Epub 2005Feb 11)。

近年来，我国由HPV和CT引起的STDs发病呈持续上升趋势。由此可见，HPV和CT已对人类健康构成了极大危害。对于HPV和CT，尤其对CT感染性疾病，迄今尚缺乏有效的防治方法。而寻求有效的疫苗，尤其是能同时防治HPV和CT感染这种性传播疾病的疫苗研究，是各国相关学科工作者的重要课题之一。

核酸疫苗，即DNA疫苗，是一种新型疫苗，其由编码目的抗原的基因和质粒的表达载体组成，直接导入宿主细胞后并不与宿主染色体整合，而是通过细胞的转录系统表达蛋白抗原，诱导机体产生特异的细胞免疫和体液免疫。

核酸疫苗的发展被称为继完整病原体疫苗和基因工程重组蛋白疫苗后的“第三次疫苗革命”。与传统的弱毒或灭活疫苗相比，核酸疫苗具有便于储存和运输的优点。与亚单位疫苗相比，核酸疫苗具有能长期激活机体全面免疫反应(细胞免疫反应和体液免疫反应)、制备工艺简单和费用低廉(不用纯化蛋白)的优点。

研究证明：基于HPV6b L1的蛋白疫苗，对预防生殖道尖锐湿疣具较好的效果，并已成功上市。每一种乳头瘤病毒均含有由500个氨基酸组成的L1蛋白，可在其上插入一些外源性抗原形成一嵌合蛋白。目前，HPV L1DNA疫苗的研究已显示具有与HPV L1蛋白同样的免疫保护作用(产生特异性的体液免疫和细胞免疫)。

CT有19个血清型别，其中D、E、F、G和H等血清型主要引起泌尿生殖道感染，而其中E和D型则是国内外报道(参见：陈丽丽，吴移谋，邓仲良等.中国南方部分城市泌尿生殖道沙眼衣原体基因分型研究.中华皮肤科杂志，2006，39：275-277；以及Suchland RJ，Eckert LO，Hawes SE等，Longitudinal assessment of infecting serovars of Chlamydia trachomatis in Seattle，西雅图沙眼衣原体感染血清型的纵向分析，public health clinics：1988-1996.Sex Transm Dis，2003，30：357-361.)中最为常见的型别。

CT主要以其主要外膜蛋白(MOMP)作为疫苗的研究基础(可参见：Pal S，Theodor I，Peterson EM，de la Maza LM.，Immunization with the Chlamydia trachomatis mouse pneumonitis major outer membrane protein can elicit a protective immune response against a genital challenge.鼠肺炎沙眼衣原体主要外膜蛋白免疫可诱发抗生殖道感染的保护性免疫反应，Infect Immun，2001，69(10)：6240-7；以及Zhang D，Yang X，Berry J，Shen C，McClarty G，Brunham RC.J的DNA vaccination with the major outer-membrane protein gene induces acquired immunity to Chlamydia trachomatis(mouse pneumonitis)infection.含有主要外膜蛋白基因的DNA疫苗引发抗沙眼衣原体(鼠肺炎)感染的获得性免疫，Infect Dis.1997；176(4)：1035-40)。

目前的研究包括：①亚单位疫苗：选用MOMP或其可变区的肽链作为抗原，但效果不理想，其主要原因可能是每一血清型别的MOMP抗原性不一样。②重组疫苗：通过基因工程将MOMP基因克隆到大肠杆菌，使之高效表达，分离纯化后作为疫苗，其免疫保护作用有待进一步研究。③合成多肽疫苗：以MOMP的可变区为基础，选择CTL或Th表位，人工合成肽链，可产生一定的保护性细胞和体液免疫，但免疫原性较弱。④DNA疫苗：将编码MOMP或其上的某一段肽链基因克隆到质粒上后作为疫苗，由于抗原的产生是内源性的并且具天然结构，可诱导机体产生细胞免疫和体液免疫，被认为是目前研究中最有希望的CT疫苗。

综上所述，本领域迫切需要开发出一种可同时防治多种疾病的多价疫苗，尤其是一种可同时防治HPV和CT的更安全、高效的核酸疫苗。

发明内容

本发明的目的正是提供一种可用于同时防治人乳头瘤病毒感染、其相关肿瘤(如尖锐湿疣)和沙眼衣原体感染的人乳头瘤病毒和沙眼衣原体嵌合核酸疫苗。

在本发明的第一方面，提供了一种嵌合核酸序列，所述序列包含：

(a)编码沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位蛋白的核酸序列；和

(b)编码人乳头瘤病毒6b型L1蛋白的核酸序列。

在一个优选例中，所述沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位蛋白是含有多个CTL表位、Th表位和B细胞表位的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述多个CTL表位、Th表位和B细胞表位的氨基酸序列是串联排列的。

在另一个优选例中，(a)和(b)中的核酸序列经人源密码子优化修饰。

在另一优选例中，所述编码沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位蛋白的核酸序列连接于编码人乳头瘤病毒6b型L1蛋白的核酸序列的羧基端或氨基端，优选羧基端。

在另一优选例中，(a)和(b)中的核酸序列直接连接或通过连接序列连接。

在本发明的一个实施方式中，所述沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位蛋白的序列如SEQ ID NO：2所示。

在本发明的另一个实施方式中，所述人乳头瘤病毒6b型L1蛋白的序列如SEQID NO：5所示。

在本发明的另一个实施方式中，所述编码沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位蛋白的核酸序列选自：SEQ ID NO：1(即未经人源化密码子优化的原序列)和SEQ IDNO：3(即经人源化密码子优化的序列)。

在本发明的另一个实施方式中，所述编码人乳头瘤病毒6b型L1蛋白的核酸序列选自：SEQ ID NO：4(即未经人源化密码子优化的原序列)和SEQ ID NO：6(即经人源化密码子优化的序列)。

在本发明的第二方面中，提供了一种重组载体，所述载体包含本发明上述的嵌合核酸序列。

在一个优选例中，所述载体选自：真核表达载体或原核表达载体，优选细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、或哺乳动物细胞病毒，更优选pcDNA3.1(+)、pSIREN-NEO、pET32a(+)、pQE30、pGEX-4T-1、pPICZA。

在本发明的第三方面中，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明上述的载体。

在一个优选例中，所述宿主细胞选自原核细胞、低等真核细胞或高等真核细胞，优选动物细胞、大肠杆菌、或酵母菌，更优选COS-7细胞、COS-1细胞、E.coli或GS115。

在本发明的第四方面中，提供了本发明上述的嵌合核酸序列、重组载体或宿主细胞在制备用于预防或治疗人乳头瘤病毒和沙眼衣原体相关疾病的嵌合疫苗中的用途。

在一个优选例中，所述人乳头瘤病毒和沙眼衣原体相关疾病选自：人乳头瘤病毒感染、人乳头瘤病毒感染相关肿瘤、或沙眼衣原体感染，优选尖锐湿疣、咽喉乳头瘤、尿道炎、宫颈炎、沙眼。

在本发明的第五方面中，提供了一种组合物，其包含有效量的本发明前述的的嵌合核酸序列、重组载体或宿主细胞和药学上或免疫学上可接受的载体、赋形剂或佐剂。

在一个优选例中，所述组合物为免疫组合物或药物组合物，优选疫苗。

在一个优选例中，所述载体、赋形剂或佐剂选自：脂质体、淀粉、明胶、铝盐佐剂、皂苷佐剂或Ribi佐剂。

在另一优选例中，所述组合物中含有0.01-99.9wt％的权利要求6所述的重组载体，优选0.1-99.0wt％。

在另一优选例中，所述组合物为肌肉注射、皮肤免疫、粘膜免疫或静脉注射。

在本发明的第六方面，提供了一种制备本发明上述重组载体的方法，所述方法包括：

(i)提供编码沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位蛋白的核酸序列以及编码人乳头瘤病毒6b型L1蛋白的核酸序列；

(ii)连接所述核酸序列，形成嵌合核酸序列；

(iii)将步骤(ii)所得嵌合核酸序列克隆到载体中。

在一个优选例中，所述沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位蛋白的序列如SEQ ID NO：2所示。所述人乳头瘤病毒6b型L1蛋白的序列如SEQ ID NO：5所示。

在另一优选例中，所述编码沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位蛋白的核酸序列选自：SEQ ID NO：1(即未经人源化密码子优化的原序列)、SEQ ID NO：3(经人源化密码子优化的序列)。

在另一优选例中，所述编码人乳头瘤病毒6b型L1蛋白的核酸序列选自：SEQ ID NO：4(即未经人源化密码子优化的序列)、SEQ ID NO：6(经人源化密码子优化的序列)。

在另一优选例中，所述编码沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位蛋白的核酸序列连接于编码人乳头瘤病毒6b型L1蛋白的核酸序列的羧基端或氨基端，优选羧基端。

应理解的是，本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1：经人源密码子修饰的沙眼衣原体多表位DNA疫苗的核酸序列。

图2：经人源密码子修饰的HPV6b结构蛋白(L1)基因序列。

图3：pcDNA3.1(+)/HPV6b L1/CT MOMP多表位重组质粒鉴定图。

图中，“M1”表示：DL1000DNA标记；“1”表示：质粒pcDNA3.1(+)；“2”表示：pcDNA3.1(+)/HPV6b L1/CT MOMP多表位；“3”表示：pcDNA3.1(+)/HPV6b L1/CT MOMP多表位/XhoⅠ+HindⅢ；“4”表示：HPV6bL1PCR产物；“5”表示：pcDNA3.1(+)/HPV6b L1/CT MOMP多表位/BamHⅠ+XhoⅠ+HindⅢ；“6”表示：CT MOMP多表位PCR产物；“M2”表示：DL250DNA标记。

图4：pcDNA3.1(+)/HPV6b L1/CT MOMP多表位重组真核质粒表达的SDS-PAGE电泳分析。

图中，“M”表示：预染的蛋白质标记；“1”表示：pcDNA3.1(+)转染的COS-7；“2”表示：pcDNA3.1(+)/HPV6b L1/CT MOMP多表位重组质粒转染的COS-7细胞。

图5：pcDNA3.1(+)/HPV6b L1/CT MOMP多表位重组真核质粒表达的蛋白质印迹电泳分析。

图中，“M”表示：预染的蛋白质标记；“1”表示：pcDNA3.1(+)转染的COS-7；“2”表示：pcDNA3.1(+)/HPV6b L1/CT MOMP多表位重组质粒转染的COS-7细胞。

图6：各组小鼠免疫后产生特异性IgG抗体水平。

图中，“1”表示：PBS对照组；“2”表示：pcDNA3.1(+)组；“3”表示：pcDNA3.1(+)/CT MOMP多表位重组质粒组；“4”表示：pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/CT MOMP多表位重组质粒组。

图7：各组小鼠免疫后阴道分泌物产生sIgA抗体水平。

图中，“1”表示：PBS对照组；“2”表示：pcDNA3.1(+)组；“3”表示：pcDNA3.1(+)/CT MOMP多表位重组质粒组；“4”表示：pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/CT MOMP多表位重组质粒组。

图8：免疫小鼠脾淋巴细胞对携带CT MOMP多表位蛋白抗原靶细胞的特异性CTL杀伤率。

图9：免疫小鼠脾淋巴细胞对携带HPV6bL1蛋白抗原靶细胞的特异性CTL杀伤率。

图10：PBS对照组小鼠生殖道炎症情况。

图11：E血清型沙眼衣原体攻击各组疫苗组及对照组小鼠生殖道炎症情况和维持时间。

图12：ELISA检测用优化和未优化的HPV6b L1核酸免疫的小鼠血清中的抗HPV6bL1特异性抗体。

图中，第4w血清抗体均值比较，与其它3组相比，*P＜0.05；第6w血清抗体均值比较，与其它3组相比，**P＜0.05；与载体组和PBS对照相比，△P＜0.05；第8w血清抗体均值比较，与其它3组相比，***P＜0.05；与载体组和PBS对照相比，△△P＜0.05。

图13：用优化和未优化的HPV6b L1核酸免疫的免疫小鼠脾细胞特异性CTL杀伤活性。

图中，E∶T在5∶1时，pcDNA3.1(+)/HPV6b L1(优化)组与pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(wt)组、pcDNA3.1(+)组和PBS组脾淋巴细胞特异性CTL杀伤活性相比，*P＜0.05；E∶T在10∶1时，pcDNA3.1(+)/HPV6b L1(优化)组与pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(wt)、pcDNA3.1(+)和PBS组脾淋巴细胞特异性CTL杀伤活性相比，**P＜0.05；△P＜0.05；E∶T在20∶1时，pcDNA3.1(+)/HPV6b L1(优化)组与pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(wt)、pcDNA3.1(+)和PBS组脾淋巴细胞特异性CTL杀伤活性相比，***P＜0.05；△△P＜0.05。

具体实施方式

本发明人以HPV6b L1和CT MOMP多表位基因为基础，并经人源化密码子优化，制备了HPV6b L1/CT MOMP多表位嵌合DNA疫苗。经免疫试验证明了HPV6b L1/CT MOMP多表位嵌合DNA疫苗兼具免疫预防和治疗小鼠生殖道CT感染作用，且其对CT的免疫防治效果显著优于非嵌合的CT MOMP多表位疫苗。在此基础上，发明人完成了本发明。

具体而言，本发明人通过预测并筛选共有的含有多个CTL表位、Th表位和B细胞表位的氨基酸序列，并对该基因进行了人源密码子优化修饰，获得了CT MOMP多表位基因。同时，本发明人还对以HPV6b L1基因进行了人源密码子修饰。然后，通过分子生物学技术，制备了HPV6b L1/CT MOMP多表位嵌合DNA疫苗。

发明人进一步通过免疫小鼠检测了该DNA疫苗的免疫保护作用：通过ELISA方法检测免疫后小鼠血清IgG和阴道分泌物sIgA抗体滴度及其中和活性、脾淋巴细胞CTL特异性杀伤活性和细胞因子(IFN-γ)水平来评价表位疫苗的免疫效应及在小鼠生殖道感染CT模型中的免疫保护作用。结果显示，HPV6bL1/CT MOMP多表位嵌合DNA疫苗兼具免疫预防和治疗小鼠生殖道CT感染作用，且其对CT的免疫防治效果显著优于非嵌合的CT MOMP多表位疫苗。

本发明通过实验研究证实，所制备HPV6b L1/CT MOMP多表位嵌合DNA疫苗，能刺激机体产生较强的针对HPV6bL1和CT MOMP特异性细胞免疫和体液免疫效应，尤其是局部生殖道粘膜的保护性抗体，具有同时针对HPV6b L1和CT感染免疫效果和免疫预防和治疗作用，为采用一种疫苗防治多种性传播疾病的深入研究和应用奠定基础，具有重要的科研价值。

同时，本发明还通过HPV6b L1/CT MOMP多表位嵌合基因，增强CT MOMP多表位基因的免疫效应。研究结果证实，HPV6b L1/CT MOMP多表位嵌合基因，可诱导机体产生增强的CT特异性的体液免疫和细胞免疫，尤其是粘膜局部的sIgA的抗体反应，这些免疫效果显著优于非嵌合的CT MOMP多表位疫苗，从而增强免疫保护效应。

术语说明

本文中的术语“免疫活性”或“免疫原性”指由天然、重组或合成的疫苗诱导哺乳动物体内的特异性体液和/或细胞免疫应答的能力。本文所用的术语“核酸疫苗”“DNA疫苗”或“嵌合(核酸)疫苗”指可引发哺乳动物免疫应答的本发明的嵌合核酸序列。

本文中的术语“免疫应答”包括细胞性和/或体液性免疫应答，它们足以抑制或防止感染；或防止或抑制由人乳头瘤病毒和沙眼衣原体所导致的疾病。

本文中的术语“对象”或“个体”或“患者”指需要进行诊断或治疗的任何目标，尤其是哺乳动物对象，特别是人，其它对象包括牛、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马等。特别受关注的是那些易受或已受人乳头瘤病毒和/或沙眼衣原体感染的对象。

本文中的术语“核酸”和“核酸序列”指聚合形式的任意长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)。它包括(但不限于)单链、双链的DNA或RNA，基因组DNA和cDNA。

本文中的术语“有效量”或“免疫有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如非人灵长类等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。

嵌合核酸序列

本发明的嵌合核酸序列包含：(a)编码沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位蛋白(CT MOMP)的核酸序列；和(b)编码人乳头瘤病毒6b型L1蛋白(HPV6bL1)的核酸序列。

术语“沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位蛋白(CT MOMP)”是指含有多个MOMPCTL表位、Th表位和B细胞表位的氨基酸序列。所述多表位蛋白的获得可通过预测和筛选多种血清型别CT MOMP的共同表位基因，将同时含有多个HLA-A2特异性的CTL表位和Th及B细胞表位组成多表位基因。例如可应用网络资源数据库获取CT各血清型的MOMP基因和氨基酸序列，对各血清型别的CT MOMP氨基酸序列进行HLA-A*0201限制性T细胞表位(CTL)、Th表位和B细胞表位预测，选择分值高的优势表位连接成多表位基因，优选串联连接。所述的优势表位包括(但不限于)：HLA-A2限制性CTL表位(1-9aa，18-26aa，16-24aa，26-34aa，27-35aa，29-37aa，38-46aa、40-48aa)、Th表位(8-27aa)和B细胞表位(2-15aa)，其中包括h-2d型的CTL表位(18-26aa)。

术语“人乳头瘤病毒6b型L1蛋白(HPV6bL1)”是指人乳头瘤病毒6b型的主要衣壳蛋白L1，其编码序列在本领域中是已知的(例如可参见Zhang LF，Zhou J，Chen S等的HPV6b virus like particles are potent immunogens without adiuvant in man，HPV6bL1病毒样颗粒是无需辅剂的人用有效免疫原Vaccine.2000年1月，6；18(11-12)：1051-8.)。本领域普通技术人员应理解，这些已知的HPV6bL1编码序列可用于本发明的嵌合核酸序列中。

应理解，本发明的核酸序列还可包括在严格条件下与上述编码序列杂交且具有相同或类似活性的分子。术语“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50％，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更优选是95％以上时才发生杂交。例如，所述序列可为互补序列。

在本发明的一个优选实施方式中，对本发明CT MOMP编码序列或HPV6bL1编码序列进行人源密码子优化修饰，从而使得所得的基因可在表达系统中获得更高的表达。优选嵌合核酸序列中的一者或两者均为经过人源密码子优化修饰的核酸序列。所述的“人源密码子优化修饰”可采用本领域中已知的常规方法进行(例如可参照Pan W，Ravot E，Tolle R等的Vaccine candidate MSP-1from Plasmodium falciparum：a redesigned 4917 bp polynucleotide enables synthesis and isolation of full-length protein from Escherichia coli and mammalian cells.恶性疟原虫候选疫苗MSP-1：4917碱基多聚核苷酸优化后可在大肠杆菌和哺乳动物细胞合成并分离全长蛋白，Nucleic Acids Res.1999 Feb15；27(4)：1094-103)。较佳地，使得核酸序列中的GC含量提高5-40％，优选10-30％，更优选13-23％，但保持其编码的氨基酸不变。

本发明的核酸序列可直接连接，或通过连接序列连接。本文中术语“连接序列”是指位于编码沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位蛋白的核酸序列和编码人乳头瘤病毒6b型L1蛋白的核酸序列之间，起到连接作用的序列。连接序列的长度没有特别限制，通常为0-100个。连接肽的长度也可为0，此时表示基因序列直接相连。通常，连接序列不影响或不显著影响所连接序列的表达和所产生抗原的免疫效应。

在本发明的一个优选实施方式中，CT MOMP编码序列连接于HPV6bL1编码序列的羧基端或氨基端，优选羧基端。

载体及宿主细胞

在获得了编码本发明的嵌合核酸序列之后，可将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。

本发明中，术语“载体”与“重组载体”可互换使用，指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其它载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。本发明中可使用选自下组的载体：真核表达载体或原核表达载体，优选细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、或哺乳动物细胞病毒，更优选pcDNA3.1(+)、pSIREN-NEO、pET32a、pQE30、pGEX-4T-1或pPICZA。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞、动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。在本发明中，优选采用COS-7细胞、COS-1细胞、E.coli、GS115。

本发明的核酸疫苗由编码目的抗原的基因和质粒的表达载体组成，直接导入宿主细胞后并不与宿主染色体整合，而是通过细胞的转录系统表达蛋白抗原，诱导机体产生特异的细胞免疫和体液免疫。

组合物

本发明还提供了包含本发明的重组载体的各种组合物，包括药物组合物和疫苗组合物。该组合物可用于预防或治疗人乳头瘤病毒和沙眼衣原体相关疾病，所述疾病包括(但不限于)：人乳头瘤病毒感染、人乳头瘤病毒感染相关肿瘤、或沙眼衣原体感染，优选尖锐湿疣、咽喉乳头瘤、尿道炎、宫颈炎、沙眼。

包含本发明的重组载体的各种组合物可以包含按重组载体的实际用途所选用的缓冲剂；还可包含适用于预定用途的其它物质。本领域技术人员都善于选择的缓冲剂，本领域已知有多种缓冲剂适用于预定用途。在有些实例中，该组合物可含有药学上可接受的赋形剂，本领域已知有多种而无需在此详细讨论。药学上可接受的各种赋形剂在多种出版物已有详述，包括如“Remington′s Pharmaceutical Sciences”(《雷明顿药物科学》，第19版(1995)Mack Publishing Co.)。

可将药物组合物或疫苗组合物制备成各种剂型，如注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾、栓剂、透皮药物(如贴片等)、油膏、洗剂等。适用于口服或局部使用的药用级别的有机或无机载体和/或稀释剂，可用于配制包含治疗活性化合物的各种组合物。本领域已知的稀释剂包括水性介质、植物性和动物性油和脂肪。还可用稳定剂、润湿剂和乳化剂、改变渗透压的盐类或维持合适pH值的各种缓冲剂和皮肤渗透增强剂等作为辅助性材料。

当用作疫苗时，本发明的重组载体可采用各种方法进行配制。通常，按本领域熟知的各种方法，用合适的药用载体和/或运载体(vehicle)配制本发明的疫苗或药物。合适的载体是无菌盐水。为此也可使用其它水性和非水性等渗无菌注射液以及水性和非水性无菌悬浮液(已知都是本领域技术人员所熟知的药学上可接受的载体)。

另外，本发明的疫苗组合物的配制还可含有其它成分，包括如佐剂、稳定剂、pH调节剂、防腐剂等。这些成分是疫苗领域技术人员所熟知的。佐剂类包括(但不限制于)铝盐佐剂；皂苷佐剂；Ribi佐剂(Ribi ImmunoChem Research In.，Hamilton，MT)；Montanide ISA佐剂(Seppic，Paris，France)；Hunter′s TiterMax佐剂(CytRx Corp.，Norcross，GA)；Gerbu佐剂(Gerbu Biotechnik GmbH，Gaiberg，Germany)等。另外，在制剂中也可包含调节免疫应答的其它成分(IL-12、CpG寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)等)。

给药途径和剂量

当用作疫苗时，可用已知的方法将本发明的重组载体施用于对象。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。可以采用疫苗组合物的形式时，还可包括药学上可接受的载体。此外，这种组合物还可包括佐剂、矫味剂或稳定剂等。

给予本发明药物组合物或疫苗组合物的常规和药学上可接受的途径包括：鼻内、肌内、气管内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要可以组合给药途径，或按抗原肽或疾病情况进行调节。疫苗组合物可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。

应以“有效量”给予重组疫苗，即重组载体的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答，能有效促使保护宿主抵抗结核杆菌感染或结核病症状。

在各疫苗剂份中所选用的重组载体的量，是按可引发免疫保护性应答而无明显的副作用的量而定。通常，在感染宿主细胞后，各剂份的疫苗足以产生约1μg-10mg，较佳地为5μg-2mg，更佳地10μg-1mg蛋白质。以重组载体核酸为基础计算的疫苗有效剂量，通常包括给予约1μg-10mg嵌合核酸/kg体重，优选1μg-10mg嵌合核酸/kg体重，更优选1μg-10mg嵌合核酸/kg体重。可用包括观察对象中的抗体滴定度和其它反应的标准研究方法来确定具体疫苗的最佳用量可通过。监控疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量。在评估了血清中的抗体滴定度后，可能需要选用增强剂量免疫接种。施用佐剂和/或免疫刺激剂就可提高对本发明的蛋白质的免疫应答。

本发明的主要优点

本发明的主要优点在于：

(1)提供了一种HPV6b L1/CT MOMP多表位嵌合DNA疫苗，所述嵌合DNA疫苗能诱导机体产生有效的HPV6b L1和CT MOMP特异性的体液免疫和细胞免疫，同时对HPV和CT相关的疾病具有免疫预防和治疗作用；

(2)本发明的疫苗相对于CT MOMP多表位DNA疫苗而言，对CT具有有效的免疫效应，可用于CT相关疾病的更有效预防和治疗；

(3)本发明的疫苗制备工艺简单，费用低廉，使用方便安全，易于储存和运输，且能长期激活机体全面免疫反应，具有免疫过程简单、接种安全、效果明显、可重复性强等优点。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件(例如可参照如Sambrook等人，《分子克隆实验室指南》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)或Immunology MethodsManual，Ivan Lefkovits，CRC，1998)或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1.CT MOMP多表位基因的获得

应用网络资源数据库(Genebank，SwissProt)获取CT各血清型的MOMP基因和氨基酸序列；同时利用在线软件(SYFPEITHI，EXPASY)及生物软件DNAstar对各血清型别的CT MOMP氨基酸序列进行HLA-A*0201限制性T细胞表位(CTL)、Th表位和B细胞表位预测，选择分值高的优势表位。获得了含有较多表位，尤其是各血清型别共有的序列，共48个氨基酸，包括：

HLA-A2限制性CTL表位：

MOMP_1-9GDNENQSTV，MOMP_18-26SLDQSVVEL，

MOMP_16-24NMSLDQSVV，MOMP_26-34LYTWQASLA，

MOMP_27-35YTWQASLAL，MOMP_29-37WQASLALSY，

MOMP_38-46RLNMFTPYI，MOMP_40-48NMFTPYIGV；

Th表位：MOMP_8-27TVKTNSVPNMSLDQSVVELY；和

B细胞表位：MOMP_2-15DNENQSTVKTNSVP，

其中包括h-2d型的CTL表位：MOMP_18-26SLDQSVVEL。

获得SEQ ID NO：1(即未经人源化密码子优化的序列)的CT MOMP多表位目的基因。然后，经过人源密码子优化修饰(参照Pan W，Ravot E，Tolle R等，Nucleic Acids Res.1999年2月，15；27(4)：1094-103的方法)，获得CT MOMP多表位目的基因(SEQ ID NO：3，如图1所示)。由北京三博远志生物技术有限公司合成具有所述序列的含有多个CTL、Th表位和B细胞表位的CT MOMP多表位基因。

实施例2.HPV6b结构蛋白(L1)基因的修饰和获得及其免疫效果的比较

为增强HPV6bL1蛋白的表达量，对HPV6b结构蛋白(L1)基因(SEQ ID NO：4)进行修饰和设计，进行了真核密码子优化，选择第3位为G和C的同义密码子，将其GC含量由42.4％提高至65.1％，但保持其编码的氨基酸不变(SEQ ID NO：6，如图2所示)。

同时，进行了优化和未优化的HPV6b L1核酸免疫动物后细胞免疫和体液免疫免疫效应的比较。

提取尖锐湿疣组织标本DNA作为模板，设计合成PCR引物，两端引入酶切位点(HindⅢ和BamHⅠ)，扩增出HPV6bL1完整开放读码框，将PCR产物和载体pcDNA3.1(+)同时经HindⅢ、BamHⅠ双酶切后连接，构建重组质粒pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(wt)，经测序鉴定。

对HPV6bL1全长核苷酸进行人偏好密码子优化，同时排除了糖基化位点以及转录终止序列等，选择第3位为G和C的同义密码子，确保优化后的氨基酸与野生型完全一致。根据优化修饰的HPV6b L1碱基序列，分别设计12对引物，每对引物长度60～80bp且相邻引物重复18～20bp，并在第一条引物和最后一条引物分别添加HindⅢ、BamHⅠ酶切位点。参照Pan W等全基因合成方法(Pan W，Ravot E，Tolle R等的Vaccine candidate MSP-1from Plasmodium falciparum：a redesigned 4917 bp polynucleotide enables synthesis and isolation of full-length protein from Escherichia coli and mammalian cells.恶性疟原虫候选疫苗MSP-1：4917碱基多聚核苷酸优化后可在大肠杆菌和哺乳动物细胞合成并分离全长蛋白，Nucleic Acids Res.1999Feb 15；27(4)：1094-103)。合成HPV6bL1密码子优化的序列，用HindⅢ、BamHⅠ酶切后连接到载体pcDNA3.1(+)上，构建重组质粒pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(优化)，经测序鉴定。

选择6～8周龄雌性BALB/c小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)，随机分为4组，每组5只，分别为：PBS组、pcDNA3.1(+)组、pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(优化)组和pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(wt)组。分别于0、2、4周取100ul测试样品(1ug/ul)，对小鼠进行股四头肌注射免疫。末次免疫后两周，摘眼球取血，用ELISA方法检测血清IgG抗体；取脾脏制备脾细胞悬液，采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测CTL特异性杀伤活性。

结果显示，优化和未经优化的HPV6b L1核酸均可使得免疫小鼠产生血清特异性抗体，但优化后的HPV6b L1核酸免疫小鼠后血清特异性抗体IgG水平及脾淋巴细胞特异性CTL活性高于未优化的HPV6b L1核酸(结果参见图12、13)。

实施例3.HPV6b L1/CT MOMP多表位DNA疫苗的制备和鉴定

设计并合成PCR引物，两端分别引入酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ，以筛选并经人密码子优化的CT MOMP多表位基因为模板扩增PCR产物，将该PCR产物经BamHⅠ和XhoⅠ酶切后连接至重组质粒pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(优化)中，构建HPV6b L1羧基端含CT MOMP多表位基因的重组真核表达质粒，并通过酶切(如图3所示)和测序鉴定。连接后鉴定结果表明：已成功构建了HPV6b L1/CTMOMP多表位嵌合重组质粒。

进一步用所得真核质粒转染COS-7细胞，并用SDS-PAGE和蛋白质印迹法分析鉴定(图4、5)。结果显示：在分子量约为60kDa位置出现特异性条带。该结果表明：含HPV6b L1/CT MOMP多表位嵌合重组质粒在体外真核细胞内能有效表达。

实施例4.HPV6b L1/CT MOMP多表位DNA疫苗的免疫保护效应

选择6～8周龄雌性BALB/c小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)，随机分为4组，每组21只，分别为：PBS对照组、pcDNA3.1(+)组、CT MOMP多表位DNA疫苗免疫组和HPV6b L1/CT MOMP多表位DNA疫苗免疫组。

分别于0、2、4周取100ul测试样品(1ug/ul)，对小鼠进行股四头肌注射免疫。末次免疫后两周，每组取各7只小鼠通过摘眼球取血，用ELISA方法检测血清IgG抗体；同时取阴道分泌物检测sIgA抗体；并进行IgG和sIgA抗体的中和活性检测；取脾脏制备脾细胞悬液，采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测CTL特异性杀伤活性；同时取脾细胞悬液采用流式细胞术(型号FACSAria，购自美国BD公司)检测细胞因子IFN-γ、IL-4和IL-10。每组剩余小鼠，均用E血清型CT进行攻击，攻击后每天观察小鼠的活动情况和外阴炎症的严重程度，计分(外阴红0～3分，肿0～3分，分泌物0～3分)并拍照记录，同时每隔5天对所有小鼠取阴道宫颈拭子进行沙眼衣原体培养，并进行IFU计数。

(1)免疫小鼠血清特异性抗体IgG的测定结果(图6)：

采用间接ELISA方法，分别将纯化后的HPV6bL1蛋白和CT MOMP多表位蛋白包被聚乙烯微量反应板，封闭后，加入免疫小鼠1∶100稀释血清，37℃反应2h，洗板，分别加入1∶2000稀释的HRP-羊抗鼠IgG 100μl，37℃反应2h，洗板后邻苯二胺(OPD)显色，加入2mol/L H₂SO₄终止反应，酶标仪测A490值。每份血清标本均重复3孔检测，测定各组免疫小鼠血清特异性抗体IgG水平。结果如图6所示。

免疫后第6周，小鼠产生针对CT MOMP多表位蛋白特异性血清IgG。并且，HPV6bL1/CT MOMP多表位DNA疫苗免疫组IgG水平(0.793±0.073)与对照组CT MOMP重组质粒组(0.620±0.091)、pcDNA3.1(+)组(0.07±0.007)和PBS组(0.111±0.003)比较均有显著性差异(P＜0.05)。

与此同时，经免疫的小鼠也能产生针对HPV6bL1特异性的IgG抗体。并且，HPV6b L1/CT MOMP多表位DNA疫苗免疫组IgG水平(0.490±0.004)与对照组CT MOMP重组质粒组(0.065±0.014)、pcDNA3.1(+)组(0.036±0.003)和PBS组(0.021±0.004)比较均有显著性差异(P＜0.05)。

(2)免疫小鼠分泌物特异性抗体sIgA的测定：

采用间接ELISA方法，方法同上，结果如图7所示。

免疫后第6周，小鼠产生针对CT MOMP多表位蛋白特异性分泌物sIgA抗体，HPV6bL1/CT MOMP多表位DNA疫苗免疫组sIgA水平(0.468±0.0883)与对照组CT MOMP重组质粒组(0.305±0.046)、pcDNA3.1(+)组(0.061±0.018)和PBS组(0.044±0.025)比较均有显著性差异(P＜0.05)；

与此同时，经免疫的小鼠也能产生针对HPV6bL1特异性的sIgA抗体，HPV6bL1/CT MOMP多表位DNA疫苗免疫组IgG水平(0.368±0.078)与对照组CTMOMP重组质粒组(0.063±0.026)、pcDNA3.1(+)组(0.046±0.007)和PBS组(0.033±0.002)比较均有显著性差异(P＜0.05)。

(3)特异性IgG和sIgA抗体的中和活性检测：

将E血清型CT分别与稀释的血清(1∶50)和分泌物(1∶5)充分混合，37℃孵育1h后感染已长成致密单层的Hep-2细胞(购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)，48-72h培养后计数形成的包涵体数量。结果显示：DNA疫苗组血清IgG抗体和分泌物sIgA中和CT的能力均显著高于对照组(P＜0.05)。

结果证实，HPV6bL1/CT MOMP多表位DNA疫苗免疫可同时产生CT MOMP和HPV6bL1特异性的血清IgG抗体，以及分泌物特异性的sIgA抗体，产生的抗体均具有中和CT感染能力。并且，HPV6bL1可增强CT MOMP基因诱导机体产生IgG和sIgA抗体水平。

(4)免疫小鼠特异性CTL杀伤活性结果：

取脾脏制备脾细胞悬液调整浓度至2×10⁶个/ml，采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测CTL特异性杀伤活性。结果如图8和图9所示。

免疫后，HPV6bL1/CT MOMP多表位DNA疫苗免疫组小鼠效应细胞与靶细胞比(E∶T)为40∶1、20∶1和10∶1时，针对CT MOMP多表位和HPV6bL1特异性的CTL杀伤活性较CT MOMP多表位组重组质粒组，以及其它对照组的杀伤活性均有显著性差异(P＜0.05)(图8)；针对HPV6b L1的CTL特异性的杀伤活较各对照组也具有显著性差异(P＜0.05)(图9)。

结果证实了HPV6bL1/CT MOMP多表位DNA疫苗免疫后可同时诱导机体产生针对CT MOMP和HPV6bL1特异性的CTL杀伤活性，且HPV6bL1可增强CTMOMP多表位DNA疫苗的特异性杀伤活性。

(5)胞内细胞因子的检测结果：

采用染色流式细胞术分析各免疫组小鼠的胞内细胞因子IFN-γ、IL-4和IL-10产生水平。小鼠末次免疫后2周取脾细胞，用FITC-CD3、APC-IFN-γ对淋巴细胞进行染色，经流式细胞仪(型号FACSAria，购自美国BD公司)分析。

结果显示，嵌合质粒pcDNA3.1(+)/HPV6b L1/CT MOMP多表位组IFN-γ(4.3％±0.26％)双阳性细胞比率较pcDNA3.1(+)/CT MOMP多表位组(3.27％±0.21％)、pcDNA3.1(+)组(1.07％±0.21％)对PBS对照组(1.03％±0.15％)为高(P＜0.05)。而IL-4和IL-10的产生水平各组间均无统计学意义(P＞0.05)。(6)HPV6b L1/CT MOMP多表位DNA疫苗对小鼠生殖道CT感染的免疫保护作用：

PBS、pCDNA3.1(+)、pcDNA3.1(+)/CT MOMP多表位、pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/CT MOMP嵌合质粒疫苗等4组小鼠末次免疫2周后，用E血清型沙眼衣原体标准株(购自美国典型物保藏中心(ATCC：VR-348B))进行生殖道感染。

结果显示：PBS、pcDNA3.1(+)对照组小鼠均在感染后第5天外阴出现红、肿和分泌物的炎症，并分别维持了21和23天(图10)，而嵌合、重组DNA疫苗免疫组小鼠生殖道炎症出现时间比对照组分别延迟了3天，炎症的严重程度显著减轻，炎症持续时间也分别缩短为仅维持5天和8天(图11)。

结论：

应用制备的HPV6bL1/CT MOMP多表位DNA疫苗进行了一系列动物实验，

结果证实：

1.实验动物针对HPV6bL1/CT MOMP多表位DNA疫苗在血清和阴道分泌物中均产生了CT MOMP特异性的保护性抗体。该疫苗免疫后均能够诱导产生IFN-γ和CT特异性CTL杀伤活性，表明可产生较强的抗CT的细胞免疫效应。结果表明具有预防和治疗CT感染的作用。

2.实验动物针对HPV6b L1/CT MOMP多表位DNA疫苗在血清和阴道分泌物中均产生了HPV6b L1特异性的保护性抗体。该疫苗免疫后均能够诱导产生IFN-γ和HPV6bL1特异性CTL杀伤活性，表明可产生较强的抗HPV6b的细胞免疫效应。结果表明具有预防和治疗HPV6b感染的作用。

3.实验动物针对HPV6bL1/CT MOMP多表位DNA疫苗(尤其是较CTMOMP多表位DNA疫苗)产生了显著增强的血清IgG、分泌物sIgA和IFN-γ及特异性CTL杀伤活性。结果表明通过制备嵌合有HPV6b L1的疫苗可增强CTMOMP多表位DNA的免疫效应。

4.小鼠经HPV6b L1/CT MOMP多表位DNA疫苗接种对E型CT感染均具有较强的免疫预防和治疗作用。表明HPV6b L1/CT MOMP多表位DNA疫苗免疫对CT生殖道攻击具有良好的保护作用，发挥了疫苗的效果。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>温州医学院

<120>人乳头瘤病毒和沙眼衣原体嵌合核酸疫苗及其用途

<130>090791 CNCN

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>144

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(144)

<400>1

gga gat aac gaa aat caa agc acg gtc aaa acg aat tct gta cca aat    48

Gly Asp Asn Glu Asn Gln Ser Thr Val Lys Thr Asn Ser Val Pro Asn

1               5                   10                  15

atg agc ctg gat caa tct gtt gtt gaa ctt tac aca tgg caa gca agt    96

Met Ser Leu Asp Gln Ser Val Val Glu Leu Tyr Thr Trp Gln Ala Ser

            20                  25                  30

tta gct ctc tct tac aga ttg aat atg ttc act ccc tac att gga gtt    144

Leu Ala Leu Ser Tyr Arg Leu Asn Met Phe Thr Pro Tyr Ile Gly Val

        35                  40                  45

<210>2

<211>48

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

Gly Asp Asn Glu Asn Gln Ser Thr Val Lys Thr Asn Ser Val Pro Asn

1               5                   10                  15

Met Ser Leu Asp Gln Ser Val Val Glu Leu Tyr Thr Trp Gln Ala Ser

            20                  25                  30

Leu Ala Leu Ser Tyr Arg Leu Asn Met Phe Thr Pro Tyr Ile Gly Val

        35                  40                  45

<210>3

<211>144

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ggcgataatg aaaaccagag cacagtcaaa acgaactccg ttccaaatat gtcactcgac   60

cagtcagtgg tcgagctgta cacgtggcag gccagcctcg ccctctctta ccggttgaac  120

atgtttacac catatattgg agtc                                         144

<210>4

<211>1500

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1500)

<400>4

atg tgg cgg cct agc gac agc aca gta tat gtg cct cct cct aac cct    48

Met Trp Arg Pro Ser Asp Ser Thr Val Tyr Val Pro Pro Pro Asn Pro

1               5                   10                  15

gta tcc aaa gtt gtt gcc acg gat gct tat gtt act cgc acc aac ata    96

Val Ser Lys Val Val Ala Thr Asp Ala Tyr Val Thr Arg Thr Asn Ile

            20                  25                  30

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Phe Tyr His A1a Ser Ser Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr

        35                  40                  45

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Phe Ser Ile Lys Arg Ala Asn Lys Thr Val Val Pro Lys Val Ser Gly

    50                  55                  60

tat caa tac agg gta ttt aag gtg gtg tta cca gat cct aac aaa ttt    240

Tyr Gln Tyr Arg Val Phe Lys Val Val Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe

65                  70                  75                  80

gca ttg cct gac tcg tct ctt ttc gat ccc aca aca caa cgt tta gta    288

Ala Leu Pro Asp Ser Ser Leu Phe Asp Pro Thr Thr Gln Arg Leu Val

                85                  90                  95

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Trp Ala Cys Thr Gly Leu Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val

            100                 105                 110

ggt gta agt gga cat cct ttc cta aat aaa tat gat gat gtt gaa aat    384

Gly Val Ser Gly His Pro Phe Leu Asn Lys Tyr Asp Asp Val Glu Asn

        115                 120                 125

tca ggg agt ggt ggt aac cct gga cag gat aac agg gtt aat gta ggt    432

Ser Gly Ser Gly Gly Asn Pro Gly Gln Asp Asn Arg Val Asn Val Gly

    130                 135                 140

atg gat tat aaa caa aca caa tta tgc atg gtt gga tgt gcc ccc cct    480

Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Met Val Gly Cys Ala Pro Pro

145                 150                 155                 160

ttg ggc gag cat tgg ggt aaa ggt aaa cag tgt act aat aca cct gta    528

Leu Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Lys Gln Cys Thr Asn Thr Pro Val

                165                 170                 175

cag gct ggt gac tgc ccg ccc tta gaa ctt att acc agt gtt ata cag    576

Gln Ala Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Thr Ser Val Ile Gln

            180                 185                 190

gat ggc gat atg gtt gac aca ggc ttt ggt gct atg aat ttt gct gat    624

Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met Asn Phe Ala Asp

        195                 200                 205

ttg cag acc aat aaa tca gat gtt cct att gac ata tgt ggc act aca    672

Leu Gln Thr Asn Lys Ser Asp Val Pro Ile Asp Ile Cys Gly Thr Thr

    210                 215                 220

tgt aaa tat cca gat tat tta caa atg gct gca gac cca tat ggt gat    720

Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Gln Met Ala Ala Asp Pro Tyr Gly Asp

225                 230                 235                 240

aga tta ttt ttt ttt cta cgg aag gaa caa atg ttt gcc aga cat ttt    768

Arg Leu Phe Phe Phe Leu Arg Lys Glu Gln Met Phe Ala Arg His Phe

                245                 250                 255

ttt aac agg gct ggc gag gtg ggg gaa cct gtg cct gat aca ctt ata    816

Phe Asn Arg Ala Gly Glu Val Gly Glu Pro Val Pro Asp Thr Leu Ile

            260                 265                 270

att aag ggt agt gga aat cgc acg tct gta ggg agt agt ata tat gtt    864

Ile Lys Gly Ser Gly Asn Arg Thr Ser Val Gly Ser Ser Ile Tyr Val

        275                 280                 285

aac acc ccg agc ggc tct ttg gtg tcc tct gag gca caa ttg ttt aat    912

Asn Thr Pro Ser Gly Ser Leu Val Ser Ser Glu Ala Gln Leu Phe Asn

    290                 295                 300

aag cca tat tgg cta caa aaa gcc cag gga cat aac aat ggt att tgt    960

Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Lys Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile Cys

305                 310                 315                 320

tgg ggt aat caa ctg ttt gtt act gtg gta gat acc aca cgc agt acc    1008

Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr

                325                 330                 335

aac atg aca tta tgt gca tcc gta act aca tct tcc aca tac acc aat    1056

Asn Met Thr Leu Cys Ala Ser Val Thr Thr Ser Ser Thr Tyr Thr Asn

            340                 345                 350

tct gat tat aaa gag tac atg cgt cat gtg gaa gag tat gat tta caa    1104

Ser Asp Tyr Lys Glu Tyr Met Arg His Val Glu Glu Tyr Asp Leu Gln

        355                 360                 365

ttt att ttt caa tta tgt agc att aca ttg tct gct gaa gta atg gcc    1152

Phe Ile Phe Gln Leu Cys Ser Ile Thr Leu Ser Ala Glu Val Met Ala

    370                 375                 380

tat att cac aca atg aat ccc tct gtt ttg gaa gac tgg aac ttt ggg    1200

Tyr Ile His Thr Met Asn Pro Ser Val Leu Glu Asp Trp Asn Phe Gly

385                 390                 395                 400

tta tcg cct ccc cca aat ggt aca tta gaa gat acc tat agg tat gtg    1248

Leu Ser Pro Pro Pro Asn Gly Thr Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Tyr Val

                405                 410                 415

cag tca cag gcc att acc tgt caa aag ccc act cct gaa aag gaa aag    1296

Gln Ser Gln Ala Ile Thr Cys Gln Lys Pro Thr Pro Glu Lys Glu Lys

            420                 425                 430

cca gat ccc tat aag aac ctt agt ttt tgg gag gtt aat tta aaa gaa    1344

Pro Asp Pro Tyr Lys Asn Leu Ser Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys Glu

        435                 440                 445

aag ttt tct agt gaa ttg gat cag tat cct ttg gga cgc aag ttt ttg    1392

Lys Phe Ser Ser Glu Leu Asp Gln Tyr Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu

    450                 455                 460

tta caa agt gga tat agg gga cgg tcc tct att cgt aca ggt gtt aag    1440

Leu Gln Ser Gly Tyr Arg Gly Arg Ser Ser Ile Arg Thr Gly Val Lys

465                 470                 475                 480

cgc cct gct gtt tcc aaa gcc tct gct gcc cct aaa cgt aag cgc gcc    1488

Arg Pro Ala Val Ser Lys Ala Ser Ala Ala Pro Lys Arg Lys Arg Ala

                485                 490                 495

aaa act aaa agg                                                    1500

Lys Thr Lys Arg

            500

<210>5

<211>500

<212>PRT

<213>人工序列

<400>5

Met Trp Arg Pro Ser Asp Ser Thr Val Tyr Val Pro Pro Pro Asn Pro

1               5                   10                  15

Val Ser Lys Val Val Ala Thr Asp Ala Tyr Val Thr Arg Thr Asn Ile

            20                  25                  30

Phe Tyr His Ala Ser Ser Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr

        35                  40                  45

Phe Ser Ile Lys Arg Ala Asn Lys Thr Val Val Pro Lys Val Ser Gly

    50                  55                  60

Tyr Gln Tyr Arg Val Phe Lys Val Val Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe

65                  70                  75                  80

Ala Leu Pro Asp Ser Ser Leu Phe Asp Pro Thr Thr Gln Arg Leu Val

                85                  90                  95

Trp Ala Cys Thr Gly Leu Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val

            100                 105                 110

Gly Val Ser Gly His Pro Phe Leu Asn Lys Tyr Asp Asp Val Glu Asn

        115                 120                 125

Ser Gly Ser Gly Gly Asn Pro Gly Gln Asp Asn Arg Val Asn Val Gly

    130                 135                 140

Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Met Val Gly Cys Ala Pro Pro

145                 150                 155                 160

Leu Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Lys Gln Cys Thr Asn Thr Pro Val

                165                 170                 175

Gln Ala Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Thr Ser Val Ile Gln

            180                 185                 190

Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met Asn Phe Ala Asp

        195                 200                 205

Leu Gln Thr Asn Lys Ser Asp Val Pro Ile Asp Ile Cys Gly Thr Thr

    210                 215                 220

Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Gln Met Ala Ala Asp Pro Tyr Gly Asp

225                 230                 235                 240

Arg Leu Phe Phe Phe Leu Arg Lys Glu Gln Met Phe Ala Arg His Phe

                245                 250                 255

Phe Asn Arg Ala Gly Glu Val Gly Glu Pro Val Pro Asp Thr Leu Ile

            260                 265                 270

lle Lys Gly Ser Gly Asn Arg Thr Ser Val Gly Ser Ser Ile Tyr Val

        275                 280                 285

Asn Thr Pro Ser Gly Ser Leu Val Ser Ser Glu Ala Gln Leu Phe Asn

    290                 295                 300

Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Lys Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile Cys

305                 310                 315                 320

Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr

                325                 330                 335

Asn Met Thr Leu Cys Ala Ser Val Thr Thr Ser Ser Thr Tyr Thr Asn

            340                 345                 350

Ser Asp Tyr Lys Glu Tyr Met Arg His Val Glu Glu Tyr Asp Leu Gln

        355                 360                 365

Phe Ile Phe Gln Leu Cys Ser Ile Thr Leu Ser Ala Glu Val Met Ala

    370                 375                 380

Tyr Ile His Thr Met Asn Pro Ser Val Leu Glu Asp Trp Asn Phe Gly

385                 390                 395                 400

Leu Ser Pro Pro Pro Asn Gly Thr Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Tyr Val

                405                 410                 415

Gln Ser Gln Ala Ile Thr Cys Gln Lys Pro Thr Pro Glu Lys Glu Lys

            420                 425                 430

Pro Asp Pro Tyr Lys Asn Leu Ser Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys Glu

        435                 440                 445

Lys Phe Ser Ser Glu Leu Asp Gln Tyr Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu

    450                 455                 460

Leu Gln Ser Gly Tyr Arg Gly Arg Ser Ser Ile Arg Thr Gly Val Lys

465                 470                 475                 480

Arg Pro Ala Val Ser Lys Ala Ser Ala Ala Pro Lys Arg Lys Arg Ala

                485                 490                 495

Lys Thr Lys Arg

            500

<210>6

<211>1503

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

atgtggcgcc ccagcgacag caccgtgtac gtgccccccc ccaaccccgt gtccaaggtg     60

gtggccaccg acgcctacgt gacccgcacc aacatcttct accacgccag cagctccagg    120

ctgctggccg tgggccaccc ctacttcagc atcaagcgcg ccaacaagac cgtggtgccc    180

aaggtgtccg gctaccagta cagggtgttc aaggtggtgc tgcccgaccc caacaagttc    240

gccctgcccg actcctccct gttcgacccc accacccagc gcctggtgtg ggcctgcacc    300

ggcctggagg tgggcagggg ccagcccctg ggcgtgggcg tgagcggcca ccccttcctg    360

aacaagtacg acgacgtgga gaactccggg agcggcggca accccggcca ggacaacagg    420

gtgaacgtgg gcatggacta caagcagacc cagctgtgca tggtgggctg tgcccccccc    480

ctgggcgagc actggggcaa gggcaagcag tgtaccaaca cccccgtgca ggccggcgac    540

tgcccccccc tggagctgat caccagcgtg atccaggacg gcgacatggt ggacaccggc    600

ttcggcgcca tgaacttcgc cgacctgcag accaacaagt ccgacgtgcc catcgacatc    660

tgtggcacca cctgtaagta ccccgactac ctgcagatgg ccgccgaccc ctacggcgac    720

aggctgttct tcttcctgcg caaggagcag atgttcgcca ggcacttctt caacagggcc    780

ggcgaggtgg gggagcccgt gcccgacacc ctgatcatca agggcagcgg caaccgcacc    840

tccgtgggga gcagcatcta cgtgaacacc cccagcggct ccctggtgtc ctccgaggcc    900

cagctgttca acaagcccta ctggctgcag aaggcccagg gccacaacaa cggcatctgt    960

tggggcaacc agctgttcgt gaccgtggtg gacaccaccc gcagcaccaa catgaccctg   1020

tgtgcctccg tgaccacctc ctccacctac accaactccg actacaagga gtacatgcgc   1080

cacgtggagg agtacgacct gcagttcatc ttccagctgt gtagcatcac cctgtccgcc   1140

gaggtgatgg cctacatcca caccatgaac ccctccgtgc tggaggactg gaacttcggg   1200

ctgtcccccc cccccaacgg caccctggag gacacctaca ggtacgtgca gtcccaggcc   1260

atcacctgtc agaagcccac ccccgagaag gagaagcccg acccctacaa gaacctgagc   1320

ttctgggagg tgaacctgaa ggagaagttc tccagcgagc tggaccagta ccccctgggc   1380

cgcaagttcc tgctgcagag cggctacagg ggccgctcct ccatccgcac cggcgtgaag   1440

cgccccgccg tgtccaaggc ctccgccgcc cccaagcgca agcgcgccaa gaccaagagg   1500

taa                                                                 1503