猪瘟病毒TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR鉴别检测试剂盒及其生产方法

摘要

本发明设计一种猪瘟病毒TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR鉴别检测试剂盒及其生产方法。本发明针对该猪瘟病毒基因组5′端非编码区的137位存在一个A/G SNP位点设计了野毒株特异的MGB探针，并在两端保守区设计了一套通用引物，经过反转录酶浓度、DNA聚合酶浓度、上下游引物浓度和探针浓度的进一步优化，建立了CSFV TaqMan-MGB PCR鉴别检测方法。灵敏度试验结果显示，该方法与RT-nPCR符合率为94.3％，且灵敏度比RT-nPCR敏感10倍；特异性试验结果显示，17个CSFV质控株检测均为阳性，HCLV株和12个非CSFV病原检出率均为零，说明该方法具有很强的CSFV特异性。该方法仅能检测猪瘟病毒野毒株，而不能检测疫苗株和其它非猪瘟病毒株。从反应时间和试验成本等方面都体现了TaqMan-MGB PCR鉴别检测CSFV的优越性。

说明书

技术领域

本发明所涉及的猪瘟病毒TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR鉴别检测试剂盒及其生产方法，属于兽医微生物学领域动物病毒学技术。

背景技术

猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever virus，CSFV)引起的猪的高度致死性、接触性传染病，其特征是小血管壁的变性，导致内脏器官中的多发性出血、坏死和梗死(殷震，刘景华.动物病毒学.第二版.北京：科学出版社，1997，645-664)。根据OIE制定的《陆生动物卫生法典》2006年版，CSF被列为必须报告的疫病之一，在我国被列为“二类动物疫病”，经济损失严重。目前临床上CSF在流行特点、临床表现和病理变化等方面表现出非典型性的特征，同时存在着与其它病混合感染的状况。因此对其诊断非常困难(周绪斌，王新平，宣华，涂长春.鉴别牛病毒性腹泻粘膜病毒和CSFV复合PCR方法及其应用.中国兽医学报，2002，22(6)：173-179)，必须依赖实验室诊断才能确诊。由于CSFV在细胞内繁殖滴度较低，并且不产生肉眼可见的病变，致使从病原学角度的诊断技术研究很困难；且猪瘟病毒只有一个血清型，致使无法从血清学角度区别感染群和免疫群，目前CSF的各种不太成熟的试剂盒通常存在灵敏度较低、特异性差、耗时等问题。自2009年猪瘟已被国家纳入强制免疫动物疫病目录，对疫苗免疫猪和自然感染猪的鉴别诊断具有十分重要的意义(Van Oirschot，J.T.Vaccinology of classical swine fever：from lab to field.Veterinary ofMicrobiology.2003，96：367-384.)，但是目前尚没有成熟的方法或试剂盒能鉴别检测猪瘟兔化弱毒疫苗免疫群和野毒感染群。

目前常见的CSF病原学诊断技术主要有病毒分离法、免疫荧光技术、兔体交互免疫试验、ELISA抗原捕获法、RT-PCR技术和实验动物法等。猪瘟病毒分离技术(HaegemanA，Dewulf J，Vrancken R，Tignon M，Ribbens S，Koenen F.Characterisation of the discrepancybetween PCR and virus isolation in relation to classical swine fever virus detection.Journal ofVirological Methods.2006，136：44-50)：是猪瘟诊断的金标准，敏感，但检测周期长、费力、需实验设施，不适合全群普查；猪瘟免疫荧光技术：又可分为直接免疫荧光和间接免疫荧光，应用荧光标记的一抗或二抗对组织切片进行染色观察，以检测是否有CSFV感染。免疫荧光法是目前检测CSF病原的法定方法，但该法需要有经验的试验人员，该技术经验性较强，在制片特别是组织切片过程中难度大，耗时长。组织抹片的制作也可能由于选定的样品为非病灶区而漏检。因而该方法也受到一定程度的限制；实验动物法：用敏感仔猪进行接种试验或用兔体交互免疫试验进行病原的鉴定，此法可用来鉴别猪瘟兔化弱毒疫苗毒和野毒感染，但该法需在有条件的实验室进行，而且费时；抗原捕获ELISA法(Depner K，Paton DJ，Crucière C，De Mia GM，Müller A，Koenen F，Stark R，Liess B.Evaluation of theenzyme-linked immunosorbent assay for the rapid screening and detection of classical swinefever virus antigens in the blood of pigs.Revue Scientifique et Technique.1995，14(3)：677-689.)：利用双抗夹心法或竞争法捕获CSFV于酶标板上，然后利用辣根过氧化物酶标记的二抗进行显色，根据吸光值的高低来判断有无CSFV，目前这种试剂盒主要靠进口，价格昂贵，而且敏感度较低；RT-PCR技术(Handel K，Kehler H，Hills K，Pasick J.Comparisonof reverse transcriptase-polymerase chain reaction，virus isolation，and immunoperoxidase assaysfor detecting pigs infected with low，moderate，and high virulent strains of classical swine fevervirus.Journal of Veterinary Diagnostic Investigation.2004，16(2)：132-138.)：随着分子生物学的发展，越来越多的学者应用反转录PCR(RT-PCR)和反转录套式PCR(RT-Npcr)对CSFV成功进行了扩增。虽然该法具有操作简便，快速，特异性强等优点，但RT-nPCR要经过反转录、PCR、二次PCR反应和琼脂糖凝胶电泳，大量检测时易造成气溶胶污染，不利于实验室快速检测。

上述各种方法及其不太成熟的试剂盒通常存在灵敏度较低、特异性差、耗时、无法区分免疫群与感染群等诸多问题。因此开发猪瘟病毒TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR鉴别检测技术对于猪瘟病原的鉴别检测具有十分重要的意义。

本发明的目的是利用TaqMan-MGB荧光定量PCR技术，建立猪瘟病毒TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR快速鉴别检测技术，从而制备用于CSFV快速鉴别检测的试剂盒。

发明内容

一、本发明的主要技术原理

实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction，RQ-PCR)技术是20世纪90年代中期发展起来的一种新型核酸定量技术(Heid，C.A.，et al.，Real time quantitative PCR.[J].Genome Res，1996.6(10)：986-94.)，该技术是通过始点定量和荧光检测系统实时监测累积荧光强度而实现的，它可以采用绝对定量和相对定量两种方式实现定量检测。

实时荧光定量PCR(RQ-PCR)技术包括探针类和染料类两种(Wittwer，C.T.，et al.，Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification.Biotechniques，1997.22(1)：130-1，134-8)。探针类是利用与模板特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，以TaqManTM技术为代表，常用的荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX；染料类是应用一种能与双链DNA小沟结合的荧光染料，荧光信号强弱与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量，常用的是SYBR Green I染料。

实时荧光PCR技术常用TaqMan^TM技术(Heid，C.A.，et al.，Real time quantitative PCR.Genome Res，1996.6(10)：986-94.)，由美国Perkin Elmer公司研制，它在PCR扩增体系中加入一条20多bp的特异荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记上荧光发射基团(R)和淬灭基团(Q)，在PCR反应中设立标准模板系列对照反应管和阴性对照管，在PCR扩增的退火或延伸步骤中检测荧光信号的变化，得出实时荧光定量PCR(RQ-PCR)的动力学曲线图。探针完整时，两者发生荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)，R基团发射的荧光信号被Q基团淬灭；PCR扩增进行时，Taq酶发挥5′→3′外切酶活性，将探针降解，R基团与Q基团分离，Q基团淬灭作用随即消失，R基团释放荧光信号，被荧光监测系统接收，即每完成一次扩增，就有一个荧光信号累积，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步(Hiyoshi，M.and Hosoi S.，Assay of DNA denaturation bypolymerase chain reaction-driven fluorescent label incorporation and fluorescence resonanceenergy transfer.Anal Biochem，1994.221(2)：306-11；Holland，P.M.，et al.，Detection of specificpolymerase chain reaction product by utilizing the 5′-3′exonuclease activity of Thermusaquaticus DNA polymerase.Proc Natl Acad Sci U S A，1991.88(16)：7276-80.)。其工作原理见图1。

TaqMan MGB探针(TaqMan Minor Groove Binder probe)(Decaro，N.，et al.，A minorgroove binder probe real-time PCR assay for discrimination between type 2-based vaccines andfield strains of canine parvovirus.J Virol Methods，2006.136(1-2)：65-70)与普通TaqMan水解探针不同之处在于TaqMan MGB探针的3’端连接一个不发荧光的Q基团和一个特殊的小沟结合子(Minor Groove Binder)，这种特殊的设计赋予了MGB探针三大优势：一是显著提高Tm值，这样可以减少探针设计长度，对AT富含区的探针设计更为有利；二是可以降低背景荧光信号，提高信噪比，使实验结果更精确，分辨率更高；三是提高了探针与互补模板的结合特异性，即使一个碱基的不匹配都能精确分辨。该方法已经广泛用于等位基因鉴定、单核苷酸多态性分析、定点突变检测等。其工作原理见图2。

计算样品的CT值就可以确定样品的起始模板量。CT值是指样品管的荧光信号达到某一固定阈值的PCR反应循环数，阈值是由所选定作为基线的各个循环数的ΔRn值的平均数加上其标准差所得的数值决定。PCR循环在到达CT值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期，此时微小误差尚未放大，因此CT值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的CT值是恒定的。根据CT值与初始模板浓度的对数呈线性关系，利用标准品10倍梯度稀释绘制出标准曲线，见图3。利用各样品的CT值即可计算样品的起初模板量。

二、本发明的详细描述

1.MGB探针和引物的设计

对GenBank公布的猪瘟病毒(CSFV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和绵羊边界病病毒(BDV)全序列进行综合比对，发现在其5′端非编码区的137位存在一个A/G SNP位点，即猪瘟兔化弱毒疫苗病毒株在该位点为A，而其它野毒株和其他疫苗株该位点为G，利用Primer Express2.0软件，针对该位点设计了猪瘟病毒野毒株特异的MGB探针，并在两端保守区设计了一套通用引物，命名为：上游引物MGB-F、下游引物MGB-R、探针MGB-P，序列如下：

MGB-F：5’-CATGCCCACA GTAGGACTAG CAAA-3’

MGB-R：5’-GAACTACTGA CGACTGTCCT GTACTCA-3’

MGB-P：5’-FAM-CTAGCCGTAG TGGCGA-MGB-3’

其中：FAM为羧基荧光素；MGB为小沟结合子。

2.阳性对照的制备

阳性对照：采用猪瘟石门标准毒株(SM)特异克隆其非编码区约300bp的片段体外逆转录获得，浓度为(0.126～0.368μg/10μL)。制备方法如下：

(1)目的片段扩增

采用SNP-F：GACGGCCGAACTGGGCTA；SNP-R：ATTCAACTCCATGTGCCATGAA作为引物，按常规RT-PCR反应体系配成RT-PCR反应液，加入阳性SM RNA模板，用PCR扩增仪进行扩增，得到大量目的片段，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测和分离扩增产物，紫外显像可见一条分子量大小为307bp的特异条带(见序列6)，且无非特异性扩增条带，证明扩增成功，在亮带部位切下PCR凝胶产物保存备用。

(2)纯化目的片段

采用的Gel Extraction Kit试剂盒纯化上述PCR凝胶产物中的目的核酸片段，再用1.5％琼脂糖凝胶电泳对纯化的扩增产物进行粗略定量。

(3)连接与转化反应

按pGM-T Easy连接试剂盒说明，进行PCR纯化产物与T载体的连接反应，构建含目的片段质粒。将上述连接产物转化入TOP10感受态细胞，然后将转化的感受态细胞涂于加有40μL X-Gal(20mg/mL)和8μL IPTG(200μg/mL)的琼脂平板，37℃培养12～16h。

(4)克隆菌落的扩大培养与鉴定

培养后平板上长出蓝色和白色菌落，挑取饱满、表面清亮的单个白色菌落接种于含有氨苄抗性的5ml LB培养基中，每个菌落都记录编号，37℃、180r/min摇床培养12～16h。应用Plasmid Mini Kit I质料提取试剂盒对每个菌落的培养菌液进行质料的提取，并对质粒进行测序鉴定。

(5)体外转录

以鉴定后的阳性质料为模板，按Promega公司的Ribo MAX^TM Large Scale RNAProduction System-T7试剂盒说明进行标准阳性质粒的体外转录。

(6)转录后处理

1)加RQ1 RNase-Free DNase至终浓度为1μ/μg模板DNA，37℃放置15min。

2)用1倍体积的TE饱和苯酚(pH 4.5)∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1抽提，涡旋1min，12000r/min离心2min。

3)将上层水相转入一个新的离心管中，加1倍体积的氯仿∶异戊醇＝24∶1，涡旋1min，12000r/min离心2min。

4)将上层水相转入一个新的离心管中，加1倍体积的3M醋酸钠(pH5.2)和1倍体积的异丙醇或2.5倍体积的95％乙醇，混匀置于冰上2～5min，12000r/min离心10min。

5)轻轻弃去或吸出上清，用1ml的70％乙醇清洗离心管，真空环境下干燥离心管中的RNA，并用TE缓冲液重悬RNA，保存在-70℃。

(7)转录后鉴定与检验

经体外转录制备的RNA用1×TE缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.5，1mM EDTA)按1∶100到1∶300稀释，用紫外分光光度计测定OD₂₆₀/OD₂₈₀比值(OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.9～2.1之间说明所得的RNA纯度较高，比值若低于1.9可能有蛋白污染，若高于2.1则可能RNA已降解)及OD₂₆₀的值(1OD₂₆₀相当于大约40ug/ml RNA)，鉴定合格的即可用作阳性标准品原液。

将阳性标准品原液用DEPC水进行10倍梯度稀释，得到多个梯度的稀释液，各个梯度的稀释液用试剂盒CSFV TaqMan-MGB PCR检测试剂进行CT值标定，取CT值在15.0-20.0的稀释液作为试剂盒的强阳性对照，取CT值在35.0左右的稀释液作为试剂盒的弱阳性对照。

3.质控样本及阴性对照的信息

质控样本菌、毒株及细胞见表1，试验用猪瘟兔化弱毒疫苗信息见表2。

表1质控菌、毒株及细胞背景信息

表2试验用猪瘟兔化弱毒疫苗信息

4.阴性对照背景信息

采用无特异性病原(SPF)猪扁桃体或颌下淋巴结、肠系膜淋巴结，按1∶5倍体积加入磷酸盐缓冲液(PBS)液，于研钵或组织匀浆器中充分研磨，然后3000r/min离心10min，取上清液转入离心管中备用。4)用于阴性对照及质控样本RNA的制备。

(1)取1.5mL Eppendorf管，每管加入500μL Trizol，分别加入被检样品，一份样品换一个吸头，充分混匀，静置5min；再加入200μL氯仿，混匀器上振荡混匀5s(不能过于强烈，以免产生乳化层，也可以用手颠倒混匀)。于4℃、12000r/min离心15min。

(2)取1.5mL Eppendorf管，加入500μL异丙醇(4℃预冷)，做标记。取1)中的上清约500μL(注意不要吸出中间层)转移至相应的管中，颠倒混匀，4℃静置20min。

(3)于4℃、12000r/min离心15min，小心倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入600μL 75％乙醇，颠倒洗涤。

(4)4℃、12000g离心10min，小心倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体。

(5)4000r/min离心10s，将管壁残液甩到管底，用微量加样器小心吸干，一种样品换用一个吸头，室温干燥3～10min。

(6)加入25μL DEPC水轻轻混匀，溶解RNA，冰上保存备用。提取的RNA须在2h内进行PCR扩增；若需长期保存须放置-70℃冰箱。

5.试剂

Trizol裂解试剂(Trizol Regeant，200mL/瓶)、Super Script^TM III(200U/μL)反转录酶(Super Script^TM III Reverse Transcriptase)购自Invitrogen公司；

Taq HS DNA聚合酶(5U/μL)、10×PCR缓冲液(PCR Buffer，pH 8.3 Tris-HCl，100mM；KCl，500mM；MgCl₂，15mM)、dNTP混合液(dNTP Mixture，2.5mM/每种)购自宝生物工程(大连)有限公司；

MGB探针和引物由上海基康生物技术有限公司合成。

6.TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR反应体系的建立

以CSFV SM株病毒作为模板进行TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR，经过对SSIII^TM反转录酶、Taq HS DNA聚合酶(Taq HS DNA Polymerase)、上下游引物、探针和反应体系的逐步优化。最终选用的反应体系见表1。

表3 CSFV TaqMan-MGB PCR反应体系

仪器：荧光PCR检测仪(ABI7500荧光定量PCR仪，美国应用生物系统(ABI)公司产品)。

反应条件：50℃，20min；94℃，4min；88℃，8s；60℃，35s，40个循环。每个循环在60℃时采集一次MGB探针释放的荧光信号。

三、试剂盒生产组装及应用

1.试剂盒生产组装

(1)对照品及水

阳性和弱阳性对照：采用猪瘟石门标准毒株(SM)特异克隆其非编码区约300bp的片段体外逆转录获得特异RNA，含量分别为(阳性对照：0.126～0.368μg/10μL)和(弱阳性对照0.013～0.037μg/10μL)，300μL/管分装，各2管，-20℃冻存备用。制备方法见附件。

阴性对照：采用无特异性病原(SPF)猪的扁桃体或颌下淋巴结、肠系膜淋巴结，按1∶5倍体积加入0.1％焦磷酸二乙酯(DEPC)水，于组织匀浆器中充分研磨，然后3000r/min离心10min，取上清液转入离心管中，分装成200μL/管，共10管，-20℃冻存备用。

焦碳酸二乙酯(DEPC)水：20mL/瓶。

(2)试剂

Trizol裂解液：40mL/瓶，分装至棕色瓶中，4℃存放备用。

TaqMan-MGB PCR反应液：每个反应包括10×PCR Buffer 5μL、dNTP Mixture(2.5μMeach)1.6μL、MGB-F(10μM)3μL、MGB-R(10μM)3μL，共12.6μL。50个反应共计630μL，分装成2管(365μL/管，有50μL富余)。

反应酶：每个反应包括SSIII^TM反转录酶0.3μL、Taq HS DNA聚合酶0.5μL，共0.8μL。50个反应共计45μL(有5μL富余)，分装成1管。

探针溶液：用0.1％焦磷酸二乙酯(DEPC)水稀释成5μM，每个反应需1.6μL。50个反应共计90μL(有10μL富余)，分装成1管，-20℃冻存备用。

(3)试剂盒组装(以48头份计)

取上述阳性对照和弱阳性对照各2管，阴性对照10管，TaqMan-MGB PCR反应液2管、反应酶1管、探针溶液1管、Trizol 1瓶(40ml)，0.1％焦磷酸二乙酯(DEPC)水1瓶(20ml)，正放于试剂盒中；8联PCR反应管及管盖6排。

2试剂盒的相关试验

(1)特异性试验

采用本发明人按本发明提供的方法制备的20080801、20080802、20080803三个批号的CSFV TaqMan-MGB PCR鉴别检测试剂盒反应液，分别取质控样本200μL提取RNA，按优化后的体系和循环条件，进行TaqMan-MGB PCR反应，检测其特异性。同时采用5个不同厂家的6批次猪瘟兔化弱毒疫苗株作有效性检测。

检测结果显示，17个CSFV质控株检测均为阳性，HCLV株检测阴性，12个非CSFV病原检测均为阴性，PK15细胞对照检测阴性。证实该方法具有很好的特异性，且能鉴别猪瘟兔化弱毒疫苗株与其它CSFV株。

(2)灵敏度试验

200μL SM血毒提取RNA，紫外分光光度计(NanoND-1000)测定OD₂₆₀、OD₂₆₀/OD₂₈₀，换算成浓度为64ng/μL，10^-1到10^-10梯度稀释后，同时进行FQ-PCR和RT-nPCR反应(Tu C C，et al..Phylogenetic comparison of classical swine fever virus in China.VirusResearch.2001，(81)29-37)，检测其灵敏度。

表4 CSFV RT-nPCR和TaqMan-MGB PCR产物测序结果

注：“+”表示测序结果阳性；“-”表示测序结果阴性

由CT值可知10^-1～10^-8间的CT值与模板拷贝数的对数呈线性关系，相邻两个模板浓度间的CT值相差约3.3，与理论上计算的模板浓度相差10倍，CT值相差3.3相符，RT-nPCR检测10^-7，由此TaqMan-MGB PCR比常规RT-nPCR的灵敏度高出10倍。

(3)重复性试验

采用20080801、20080802、20080803共3批CSFV TaqMan-MGB PCR鉴别检测试剂盒试剂，对30个质控样本，采用MeDiPro Super System-32核酸提取仪，严格按照其操作说明进行RNA提取，溶于100μL 0.1％焦磷酸二乙酯(DEPC)水，37℃放置20min，待其充分溶解，每个反应取10μL，按优化好的反应体系和循环条件进行CSFV TaqMan-MGBPCR反应，每个样本做9个重复。检测结果参数统一设定为：3～15cycle基线(Baseline)，2000阈值(Threshold)。根据CT值计算试剂盒三批试剂批间、批内变异系数(CV)。

结果显示：20080801批试剂对30个质控样本的检测CT值变异系数为1.04％～5.88％；20080802批试剂对30个质控样本的检测CT值变异系数为1.06％～7.23％；20080803批试剂对30个质控样本的检测CT值变异系数为0.75％～9.93％，说明三批试剂具有很好的批内重复性；同时，20080801、20080802、20080803批试剂对30个质控样本的检测CT值变异系数为0.60％～5.71％，均小于10％，说明20080801、20080802、20080803这3批试剂具有很好的批间可重复性。

(4)稳定性试验

分别使用CSFV TaqMan-MGB PCR鉴别检测试剂盒的20080801、20080802、20080803批试剂对30个质控样本进行检测，每个月1次，每批试剂做3个重复，持续5个月，检测该CSFV TaqMan-MGB PCR鉴别检测试剂盒的稳定性。

结果显示，批号20080801、20080802、20080803的3批CSFV TaqMan-MGB PCR鉴别检测试剂盒对30个质控样本的5个月的CT值变化不大，说明该CSFV TaqMan-MGB PCR鉴别检测试剂盒在5个月内具有很好的稳定性。

(5)符合性试验

本研究采用CSFV RT-nPCR方法作为CSFV TaqMan-MGB PCR鉴别检测方法的符合参比，对122份临床样本RNA同时进行CSFV TaqMan-MGB PCR和CSFV RT-nPCR检测，结果CSFV TaqMan-MGB PCR与RT-nPCR符合率为94.3％。

(6)临床检测

对河北、湖南、北京、福建、山东、江西、四川7个省市的925份临床样本采用CSFVTaqMan-MGB PCR鉴别检测试剂盒进行CSFV检测，同时以RT-nPCR作为符合。对925份临床样本检测，MGB荧光定量PCR检出101份，阳性率为10.9％；RT-nPCR检出40份，阳性率为4.3％。符合率为92.8％(858/925)。说明两种方法符合率较高。

3.试剂盒的应用

(1)样品前处理及存放

1)血液样品

每个反应取200μL全血提取RNA。

2)组织脏器

取待检样品50～100mg于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加1mL 0.1％焦磷酸二乙酯(DEPC)水混匀，4℃，3000r/min离心15min，取200μL上清液转入无菌的1.5mLEppendorf管中，编号备用。

3)细胞培养物

每个反应取200μL细胞培养物提取RNA。

制备的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h，若需长期保存应置-70℃以下，但应避免反复冻融(冻融不超过3次)。

(2)待检样品RNA的制备

1)取1.5mL Eppendorf管，每管加入500μL Trizol，分别加入被检样品，一份样品换一个吸头，充分混匀，静置5min；再加入200μL氯仿，混匀器上振荡混匀5s(不能过于强烈，以免产生乳化层，也可以用手颠倒混匀)。于4℃、12000r/min离心15min。

2)取1.5mL Eppendorf管，加入500μL异丙醇(4℃预冷)，做标记。取1)中的上清约500μL(注意不要吸出中间层)转移至相应的管中，颠倒混匀，4℃静置20min。

3)于4℃、12000r/min离心15min，小心倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入600μL 75％乙醇，颠倒洗涤。

4)4℃、12000g离心10min，小心倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体。

5)4000r/min离心10s，将管壁残液甩到管底，用微量加样器小心吸干，一种样品换用一个吸头，室温干燥3～10min。

6)加入25μL DEPC水轻轻混匀，溶解RNA，冰上保存备用。提取的RNA须在2h内进行PCR扩增；若需长期保存须放置-70℃冰箱。

(3)扩增试剂准备

在反应混合物配制区进行。

从试剂盒中取出猪瘟病毒TaqMan-MGB PCR反应液、反应酶和探针溶液，在室温下融化后，2000r/min离心5s。设需PCR数为n，其中n为待检样品数×重复数、1管阳性对照、1管弱阳性对照及1管阴性对照之和，每个样本测试反应体系配制见表3。

表5反应体系配制表

(4)加样

在样本处理区进行。

在各设定的荧光RT-PCR管中分别加入上述待检样品RNA的制备中制备的10μL RNA溶液，补水至50μL盖紧管盖。

阳性对照和弱阳性对照管中分别加入10L阳性对照和弱阳性对照，补水至50μL。

(5)TaqMan-MGB PCR检测

在检测区进行。

将上述PCR管放入荧光PCR检测仪(ABI7500荧光定量PCR仪，美国应用生物系统(ABI)公司产品)内，记录样本摆放顺序。

循环条件设置：

第一阶段，反转录50℃/20min；

第二阶段，预变性94℃/4min；

第三阶段，88℃/8s，60℃/35s，40个循环，60℃采集荧光信号。

试验检测结束后，由检测仪上根据采集的动态荧光信号曲线和CT值综合判定结果。

(6)结果判定

1)结果分析条件设定

直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。

2)质控标准

阴性对照：无CT值并且无扩增曲线。

阳性对照：CT值应在15.0～20.0、弱阳性对照CT值应在35.0左右并出现典型的扩增曲线。否则，此次实验视为无效。

3)结果描述及判定

①阴性：无CT值并且无典型的扩增曲线，表示样品中无猪瘟病毒。

②阳性：CT值≤35，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在猪瘟病毒。

③可疑：CT值＞35且出现典型的扩增曲线的样本建议重做。重做结果出现CT值≤35和典型的扩增曲线者为阳性，否则为阴性。

附图说明：

图1TaqMan荧光定量PCR工作原理  在PCR反应退火过程中，探针(5′标记荧光基团，3′端标记淬灭基团)先于上下游引物和模板互补结合，引物在聚合酶作用下由5′→3′进行新生链合成，合成过程中探针被聚合酶5′→3′外切酶活性降解，3′端淬灭基团失去对5′荧光基团的淬灭作用，释放出特定波长的荧光信号，该信号被检测系统实时监测，从而实现对PCR扩增的全程监控。

图2TaqMan MGB探针工作原理  MGB探针的5′标记一个荧光报告基团，3’端连接一个不发荧光的淬灭基团和一个特殊的小沟结合子，这种特殊的设计使得MGB探针与模板的结合特异性更高，探针序列必须与模板序列完全互补匹配才能与之退火结合，引发聚合酶介导的探针降解，释放荧光，检测系统检测到信号；但如果有一个碱基不匹配，MGB探针就不能和模板互补结合，不能引发聚合酶介导的探针降解，不能释放荧光，检测系统检测不到荧光信号。

图3标准品10倍梯度稀释绘制出标准曲线  利用本发明制备的体外转录的RNA标准品，进行8个梯度的10倍系列稀释，按本发明的反应体系进行检测，由ABI7500软件作出标准曲线，横坐标为起始模板拷贝数的对数值，纵坐标为CT值，曲线斜率为-3.339，线性相关系数为0.998。

图4本发明的技术路线

图510倍梯度稀释的CSFV RNA RT-nPCR(A)和TaqMan-MGB PCR扩增(B)将本发明的体外转录的RNA标准品进行8个梯度的10倍系列稀释，同时进行RT-nPCR检测和荧光定量检测，A为RT-nPCR方法的检测结果，B为荧光定量的检测结果，图5-1中1～7泳道出现条带，说明该方法可以检测到10^-7梯度；而图5-2在10^-8梯度曲线还有荧光信号，说明本发明的荧光定量PCR方法能检测到10^-8梯度，证实本发明的荧光定量PCR方法检测灵敏度比RT-nPCR高一个数量级。

本发明的优点

根据GenBank公布的CSFV、BVDV和BDV(Barbara E，William S.D.，David J L，，DISEASE OF SWINE..I.S.U.Press.Vol.8Th.1999：AMES，IOWA U.S.A)全序列进行综合比对，发现在猪瘟病毒基因组5′端非编码区的137位存在一个A/G SNP位点，即猪瘟兔化弱毒疫苗株在该位点位A，而其它猪瘟毒株该位点为G，利用Primer Express2.0软件，针对该位点设计了野毒株特异的MGB探针，并在两端保守区设计了一套通用引物，经过反转录酶浓度、DNA聚合酶浓度、上下游引物浓度和探针浓度的进一步优化，建立了CSFVTaqMan-MGB PCR鉴别检测方法。灵敏度试验结果显示，该方法与RT-nPCR符合率为94.3％，且灵敏度比RT-nPCR敏感10倍；特异性试验结果显示，17个CSFV质控株检测均为阳性，HCLV株和12个非CSFV病原检出率均为零，说明该方法具有很强的CSFV特异性，且能鉴别HCLV和其他猪瘟毒株。从反应时间和试验成本等方面都体现了TaqMan-MGB PCR鉴别检测CSFV的优越性。

本发明的优点，可以归纳为：1)特异性好：TaqMan-MGB PCR定量技术通过MGB探针的单突变特异性对CSFV核酸的SNP位点行甄别，达到鉴别检测猪瘟野毒的目的，准确性高，同时靶序列由特异引物和探针双重控制，特异性好，假阳性低。而对疫苗毒不予检测，从而达到在野毒检测中排除疫苗免疫的干扰；2)灵敏度高：反应过程由荧光检测系统实时监控，荧光检测系统对荧光信号具有很灵敏的检测能力；3)线性关系好：由于荧光信号的强弱与模板扩增产物的对数呈线性关系，通过荧光信号的检测可以直接对样品初始模板浓度进行定量；4)操作简单：自动化程度高，TaqMan技术对模板的扩增和检测在闭管的情况下一步完成，不需要开盖，对环境污染机会少；5)没有后处理过程：不用杂交、电泳、拍照等过程。

序列表

<110>中国兽医药品监察所

<120>猪瘟病毒TaqMan-MGB荧光定量RT-CR鉴别检测试剂盒及其生产方法

<130>

<160>6

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对人工序列的描述：本发明所设计和使用的上游引物MGB-F。

<400>1

CATGCCCACA GTAGGACTAG CAAA       24

<210>2

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对人工序列的描述：本发明所设计和使用的下游引物MGB-R。

<400>2

GAACTACTGA CGACTGTCCT GTACTCA    27

<210>3

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对人工序列的描述：本发明所设计和使用的探针MGB-P。

<400>3

CTAGCCGTAG TGGCGA                16

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对人工序列的描述：本发明制备阳性对照所设计和用于的引物SNP-F。

<400>4

GACGGCCGAA CTGGGCTA                                                18

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对人工序列的描述：本发明制备阳性对照所设计和用于的引物SNP-R。

<400>5

ATTCAACTCC ATGTGCCATG AA                                           22

<210>6

<211>307

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对人工序列的描述：本发明阳性对照标准品目的基因片段序列。

<400>6

GACGGCCGAA CTGGGCTAGC CATGCCCATA GTAGGACTAG CAAACGGAGG GACTAGCCGT  60

AGTGGCGAGC TCCCTGGGTG GTCTAAGTCC TGAGTACAGG ACAGTCGTCA GTAGTTCGAC 120

GTGAGCAGAA GCCCACCTCG AGATGCTATG TGGACGAGGG CATGCCCAAG ACACACCTTA 180

ACCCTAGCGG GGGTCGCTAG GGTGAAATCA CACCACGTGA TGGGAGCACG ACCTGATAGG 240

GCGCTGCAGA GGCCCACTAT TAGGCTAGTA TAAAAATCTC TGCTGTTCAT GGCACATGGA 300

GTTGAAT                                                           307