医用钛合金植入物表面生长因子缓释系统的构建方法

摘要

医用钛合金植入物表面生长因子缓释系统的构建方法，首先在医用低弹β钛合金表面制备微沟嵴；将明胶溶于去离子水中再加入2-亚胺氢氯化硫醇经透析、干燥得巯基化明胶；取巯基化明胶溶于双蒸水超声均化制成B液，在液体石蜡中加入乳化剂，然后将B液滴入加有乳化剂的液体石蜡中，异丙醇和乙醚清洗再加入戊二醛后固化，乙醚对固化后的物质洗脱干燥过筛，

说明书

技术领域

本发明涉及一种医用骨诱导金属植入材料的制备方法，具体涉及一种医用钛合金植入物表面生长因子缓释系统的构建方法。

背景技术

良好的具有骨诱导能力的生物活性表面一直是困扰金属材料植入物的一个难题。目前金属材料表面活性改性有多种方法，但迄今为止，应用于临床的还仅限于多孔表面和磷酸钙涂层，离理想的生物活性表面仍有很大差距。为了使金属植入材料具有良好的生物活性表面，发明人进行了一系列的研究。在早期的研究中，先用RGD修饰材料微孔表面，再将载药微球复合到RGD的方法构建材料表面的生长因子缓释系统。然而一方面钛珠烧结的工艺尚有缺陷，烧结强度达不到要求，另一方面RGD作为多肽，与无机金属材料表面的结合强度始终难以保证。因此，寻找一种更有效，更牢固的结合就成为新的难题。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点，提供了能够提高微球缓释系统的稳定性，在医用钛合金植入物表面制备稳定的缓释型生长因子生物涂层，使内固定材料在保持优良力学特性的同时具有良好的骨诱导、骨整合能力，以降低植入后假体松动等并发症发生的医用钛合金植入物表面生长因子缓释系统的构建方法。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：1)医用钛合金植入物表面微沟嵴形态的制备：采用固态激光打标机在医用低弹β钛合金表面制备微沟嵴；2)庆大霉素巯基化明胶控释微球的制备2.1巯基化明胶的制备取1g明胶溶于100mL去离子水中，然后再加入20mg的2-亚胺氢氯化硫醇，在室温下反应15h，然后将反应残余的2-亚胺氢氯化硫醇用盐酸溶液透析除去，真空干燥后于-80℃保存得巯基化明胶；2.2巯基化明胶微球的制备取巯基化明胶溶于50℃双蒸水中配成质量浓度为20％-30％的A液，50℃下超声均化，将20ml液体石蜡预热至40℃并加入0.8ml的乳化剂span-80，然后按1∶5的体积比将A液以30滴/min匀速滴入加有乳化剂的液体石蜡中，边滴边搅拌得混悬液并将其迅速转移至0～4℃的水浴中，然后加入异丙醇脱水继续搅拌数分钟，分别用异丙醇和乙醚清洗数次，洗掉乳化剂和石蜡后再加入20ml质量浓度为5％的戊二醛置于4℃冰箱中固化24h，采用乙醚对固化后的物质洗脱，洗掉残留的戊二醛，室温下真空干燥过筛，分装，⁶⁰Co照射灭菌后密封避光低温保存得巯基化明胶微球；2.3生长因子巯基化明胶微球的制备取空白巯基化明胶微球，浸泡于4mol/L的rhBMP2盐酸胍饱和溶液24h，真空冻干后得加载生长因子的巯基化明胶微球；3)生长因子巯基化明胶控释微球与植入材料表面复合3.1植入材料表面的涂层修饰将经过步骤1处理后的医用低弹β钛合金植入材料先经超声清洗，然后将其浸入多巴胺溶液中，调节至典型的海洋环境，空气暴露，多巴胺自发沉积在钛合金表面生成一层粘附的聚合物薄膜；3.2微球与植入材料的复合将生长因子巯基化明胶微球配制成0.2mg/ml的溶液，然后将已经用多巴胺涂层表面修饰的植入材料放置于生长因子巯基化明胶微球溶液中，抽真空放置30min，取出得到医用钛合金植入物表面生长因子缓释系统。

所述的固态激光打标机为F-DPC-50A型固态激光打标机，激光功率50W(max)，激光波长1064um，焦距175cm，扫描速度2000mm/s，扫描频率5.5kHz。

所述的微沟嵴表面沟槽宽度为细胞级别50μm，深度为20μm。

所述的典型的海洋环境为每2mg多巴胺加入1毫升10mmol/L的tris缓冲液，pH＝8.5。

本发明在原有的医用低弹β钛合金钛合金植入物表面抗生素缓释系统基础上，创新性的引入了海洋仿生的多聚多巴胺涂层。有研究报导渗透压信号的刺激可以使多巴胺发生空间构象变化从而对物体产生强力粘附。这一涂层在机械打磨、超声等强物理作用下也是相当稳定的。庆大霉素巯基化明胶微球通过与金属表面的多聚多巴胺涂层的共价结合，使微球牢固地结合于金属材料表面。此方法与RGD修饰方法相比，涂层制备工艺更加简单，粘附更加强力可靠。利用该多聚多巴胺涂层对金属微形态表面修饰，既满足了对金属表面的强力粘附，又可以与巯基化明胶微球发生共价结合，从理论上完全可以达到微球-涂层-金属表面的稳定结合。

附图说明

图1A为规则微沟嵴表面放大图，图1B为不规则磨砂表面放大图；图2是成骨细胞生长图；其中图2A为规则微沟嵴表面成骨细胞伪足伸展多，细胞形态好；图2B为磨砂表面成骨细胞伪足数量较少细胞形态不好；图3是巯基化明胶的化学反应图；图4是植入材料表面的涂层修饰图；图5是微球与植入材料复合过程图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步详细说明。但本发明并不局限于以下实施例。

经过前期研究，微沟嵴表面比光滑表面和不规则磨砂表面都更适合成骨细胞的粘附和生长(见图1，2)，且其制备工艺简单，质量容易控制，更适合工业化生产，相关研究结果已经发表(Jun Fu，Zheng Guo，Yunyu Hu，Yongquan Zhang，Yulin Hao，Shujun Li.Effect ofsurface micro-topography of titanium material on the behaviors of rabbit osteoblast in vitro.Applied Surface Science.2008；255：286-289)。因此，本申请采用微沟嵴表面替代先前的钛珠烧结表面，以克服烧结强度不足，烧结工艺复杂等难题。

在自然界中，藤壶、贻贝等生物能通过足丝盘分泌出一种特殊的粘性很强的蛋白质，即藤壶粘合蛋白，与岩石、船体等固体表面牢固结合。对多种不同来源的藤壶粘合蛋白进行分析发现，这些蛋白无一例外均含有高组分的酪氨酸残基，在粘合反应中，酪氨酸在酪氨酸酶的作用下生成多巴胺，进而在氧化条件下聚合为多聚多巴胺，从而形成牢固粘合。在该机制被阐明之后，Lee等发现使用多巴胺作为原料可以在弱碱性氧化(10mmol/L Tris-HCl，pH 8.5，空气暴露)条件下在多种材料表面形成多聚多巴胺涂层，并且该涂层极为稳定，甚至能经受机械打磨、超声和强酸的破坏作用。在此基础之上，还有一个重要特性就是可通过与含有巯基和氨基的有机物进行麦克加成反应或希夫碱反应加入新涂层，这使得该涂层可以作为材料表面的改性的桥梁，连接多种药物。

在经过反复的摸索和实验后，本申请最终找到了一种更佳的解决方案，即用多聚多巴胺涂层修饰金属材料微沟嵴表面，然后再用载药的巯基化明胶进行连接。

其制备过程如下：1)医用钛合金植入物表面微沟嵴形态的制备：采用固态激光打标机在医用低弹β钛合金表面制备表面沟槽宽度为细胞级别50μm，深度为20μm的微沟嵴；所制备的规则微沟嵴表面应有利于微球的嵌入，同时满足新骨长入对微沟槽的要求，所采用的固态激光打标机为F-DPC-50A型固态激光打标机，激光功率50W(max)，激光波长1064um，焦距175cm，扫描速度2000mm/s，扫描频率5.5kHz；2)巯基化明胶控释微球的制备2.1巯基化明胶的制备参照Sushma Kommareddy和Mansoor Amiji的巯基化明胶制备方法(Preparation andEvaluation of Thiol-Modified Gelatin Nanoparticles for Intracellular DNA Delivery in Response toGlutathione.Bioconjugate Chem.2005，16，1423-1432)。通过引入巯基部分与明胶的氨基进行共价反应得到巯基化明胶(化学反应见图3)。具体过程如下：取1g明胶溶于100mL去离子水中，然后再加入20mg的2-亚胺氢氯化硫醇，在室温下反应15h，然后将反应残余的2-亚胺氢氯化硫醇用盐酸溶液透析除去，真空干燥后于-80℃保存得巯基化明胶；明胶巯基化的程度可以通过比色法来计算。将巯基化明胶和普通明胶分别溶于等量的含lmmol/L依地酸(EDTA)0.1mol/L磷酸盐的缓冲液(PH＝8.0)中，然后取500μL该溶液与100μL埃尔曼试剂(ELLman’s reagent)和5mL的缓冲液混合，室温下即可发生比色反应，反应15min后，在412nm波长测吸光值。然后根据半胱氨酸标准曲线推算出每克明胶中含多少mmol巯基。

2.2巯基化明胶微球的制备参照Fujimoto S的乳化冷凝法(Effects of intra-aterally biodegradable microsphere containingMitomycin C.Cancer，1985；55：522)并加以改进；具体过程如下：取巯基化明胶溶于50℃双蒸水中配成质量浓度为20％-30％的A液，将20ml液体石蜡预热至40℃并加入0.8ml的乳化剂span-80，然后按1∶5的体积比将A液以30滴/min匀速滴入加有乳化剂的液体石蜡中，边滴边搅拌得混悬液并将其迅速转移至0～4℃的水浴中，然后加入异丙醇脱水继续搅拌数分钟，分别用异丙醇和乙醚清洗数次，洗掉乳化剂和石蜡后再加入20ml质量浓度为5％的戊二醛置于4℃冰箱中固化24h，采用乙醚对固化后的物质洗脱，洗掉残留的戊二醛，室温下真空干燥过筛，分装，⁶⁰Co照射灭菌后密封避光低温保存得巯基化明胶微球；2.3生长因子巯基化明胶微球的制备称取适量( )空白巯基化明胶微球，浸泡于4mol/L的rhBMP2盐酸胍饱和溶液24h，真空冻干后得加载生长因子的巯基化明胶微球。

3)生长因子基化明胶控释微球与植入材料表面复合3.1植入材料表面的涂层修饰(见图4)将经过步骤1处理后的医用低弹β钛合金植入材料先经超声清洗，然后将其浸入多巴胺溶液中，调节至典型的海洋环境(每2mg多巴胺加入1毫升10mmol/L的tris，pH＝8.5)，空气暴露，多巴胺自发沉积在钛合金表面生成一层粘附的聚合物薄膜；涂层的厚度与反应时间有函数关系，如反应24h，涂层厚度可以达到50nm，涂层厚度可用原子力显微镜测定。

3.2微球与植入材料的复合(见图5)将生长因子巯基化明胶微球配制成0.2mg/ml的溶液，然后将已经用多巴胺涂层表面修饰的植入材料放置于生长因子庆大霉素明胶微球溶液中，抽真空放置30min，取出得到医用钛合金植入物表面生长因子缓释系统。通过测定混合液中巯基化明胶微球的剩余量，得出明胶微球与植入材料表面的结合量。最终得到医用钛合金植入物表面生长缓释系统。