乙肝病毒前S1抗原快速诊断试剂盒及其制备方法

摘要

本发明涉及一种乙肝病毒前S1抗原快速诊断试剂盒及其制备方法，其主要包括乙型肝炎前S1抗原检测试纸条，试纸条由样品垫、金标垫、反应膜和吸水层依次粘贴在衬卡上，然后装入卡盒中。其金标垫的制备是将胶体金标记的抗-HBs多克隆抗体载于玻璃纤维垫上；反应膜的制备是在玻璃纤维垫相连的检测载体硝酸纤维膜上包被抗-S1单克隆抗体制成检测线，同时包被重组乙肝表面抗原制成质控线。本发明当待检样本中含有前S1抗原，形成检测线和质控线两条紫红色线，判为阳性；反之则只有一条紫红色线，判为阴性。本发明用于检测人血清或血浆中的乙型肝炎病毒前S1抗原，具有操作简便、诊断快速、特异性强和灵敏度高的优点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种免疫诊断技术，具体地说是一种乙肝病毒前S1抗原快速诊断试剂盒及其制备方法。用于快速检测人血清或血浆中乙肝病毒前S1抗原。

背景技术

我们知道，乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一种世界性疾病，我国是乙型肝炎的高发国。40-60％的人群感染过HBV，9-10％的人群为HBV表面抗原(HBsAg)携带者，对这一亿多的HBsAg阳性者作为传染源的意义作出评估，才能比较公平地对待他们对社会活动的参与。

通过对HBV病毒颗粒结构进行分析发现，其外膜蛋白包括S、前S2和前S1三种成分。前S1蛋白主要存在于Dane颗粒和管型颗粒上，在病毒感染、装配、复制、侵入肝细胞过程和刺激机体产生免疫反应中起重要作用；临床研究也发现，前S1蛋白在HBV感染的最早期出现并与血清HBV-DNA、HBeAg及肝内HBcAg高度相关，其在病毒性乙型肝炎的临床诊断，指导治疗等方面有重要价值。

首先，乙肝病毒前S1抗原的检测是早期诊断乙型肝炎病毒感染的指标。因为前S1抗原出现在急性乙型肝炎感染的最早期，在转氨酶升高前即可查出，因而用于乙肝病毒感染的早期诊断，尤其是在体检和献血员中加查前S1抗原，在疾病的早期诊断和尽早切断传染原方面有重要意义。

其次，乙肝病毒前S1抗原是反映HBV感染和复制状况的指标。前S1抗原与HBV-DNA，HBeAg检测率高度符合，提示前S1抗原可作为HbeAg和HBV-DNA检测的补充和对照；HBeAb(+)慢性乙型肝炎(约占患者的30％左右)和HBV慢性无症状携带者中，前S1抗原(+)可表示病毒的复制，提示临床上只检测“乙肝五项”是不够的，补充前S1抗原的测定是十分重要的，可弥补因病毒变异和其它原因造成的HBeAg(-)的“误导”；病毒附着于肝细胞上，最重要的介导部位是前S1蛋白的氨基酸(AA)21-47片段，变异的病毒只要这一区段完好就有传染性。

再者，乙肝病毒前S1抗原的检测可用于预后及药物疗效的判断。急性乙型肝炎患者前S1抗原阴转越早，预后越好，是病毒清除的最早迹象，反之，前S1抗原持续阳性，将发展至慢性肝炎；因病毒基因变异的HBeAb(+)慢性乙型肝炎病人，较易进展为肝硬化，甚至肝癌，加强检测前S1抗原，是一种检测疾病预后的良好手段；前S1抗原可作为药物抗病毒疗效的指标，是对HBV-DNA和HBeAg指标的补充和加强。

随着对乙肝病毒前S1抗原蛋白特有性质的研究及其在乙肝发病机理、乙肝病毒感染和复制等方面研究的深入，发现了越来越多前S1抗原在HBV分子生物学上的重要意义。在与肝细胞受体结合、调节HBVcccDNA(covalentlyclosed circular DNA)，合成、转化病毒与细胞基因表达活性、调节机体免疫和对疫苗的免疫应答、导致肝炎以及在病毒装配和传染性等方面的重要作用越来越受到人们重视。大量的临床与实验室研究表明：应用前S1抗原检测试剂对乙肝病毒建立一种科学、灵敏、重复性好的血清学检测对临床诊断与指导治疗具有越来越重要的意义。

目前对乙肝病毒前S1抗原的检测方法主要为酶联免疫吸附法和化学发光法。二者对于乙肝病毒前S1抗原的检测虽然是比较准确和敏感的，但是也存在如下的缺点：(1)检测需要专门的仪器设备辅助如酶标仪和化学发光检测仪，不利于实行现场直接检测；(2)操作过程相对比较复杂，检测所需要的时间比较长，而且需要经过专业技术培训的技术人员操作。(3)一般不能实现单人份的检测。

为满足临床快速检测的需要，近年来发展了多种简便、快速的免疫学检测方法，胶体金法即为其中一种，胶体金技术是九十年代发展起来的快速诊断分析技术，近几年新发展的胶体金快速测定试纸条主要适用于急诊检验、小型化验室或家中自测，已成为21世纪检验医学一个重要的发展方向。胶体金免疫层析技术是应用胶体金标记技术，以胶体金作为示踪物，应用于抗原抗体反应的一种新型的免疫标记技术。层析过程中，金标记物与事先固相化于层析材料如硝酸纤维素膜上的抗原或抗体发生特异性的免疫反应而被截留，进一步富集，形成肉眼可见的紫红色条带，从而得到直观的实验效果，达到快速检测的目的。

由于我国乙型肝炎患者较多，而且目前正处于经济发展阶段，为了对乙型肝炎患者的病情作出正确而经济的分析，有必要加强对pre-S1抗原的基础及临床应用研究。前S1蛋白检测是一种科学、灵敏、重复性好的血清学检测。传统的乙肝检测手段逐渐在病毒感染的传染性、预后及疗效判断等方面的准确性与敏感性、可重复性表现出很多不足之处。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的不足，提供一种操作简便、诊断快速、特异性强和灵敏度高的乙型肝炎病毒前S1抗原快速诊断试剂盒及其制备方法。

本发明解决上述技术问题采用的技术方案是：一种乙肝病毒前S1抗原快速诊断试剂盒，其特征是：其卡盒中含有乙肝病毒前S1抗原检测试纸条，所述试纸条是由样品垫、金标垫、反应膜和吸水层依次粘贴在衬卡上，其中所述金标垫是由胶体金标记的抗-HBs多克隆抗体载于玻璃纤维垫上制成，所述反应膜是在硝酸纤维膜上包被抗-S1单克隆抗体制成检测线，同时包被重组乙肝表面抗原制成质控线。

本发明上述乙肝病毒前S1抗原快速诊断试剂盒的制备方法，其选择玻璃纤维做样品垫、吸水纸做吸水层、有粘附作用的纸卡做衬卡，其特征在于：还包括以下步骤：

(a)金标垫的制备其是将胶体金标记的抗-HBs多克隆抗体载于载体玻璃纤维垫上，在硅化处理后的玻璃容器中加入浓度为0.01％的氯金酸，加热至沸腾，搅动下按照体积比100∶2加入浓度为1％的柠檬酸三钠，继续煮沸25分钟，冷去后用超纯水恢复到原体积，制成直径为25nm左右的胶体金颗粒，用0.1M K₂CO₃溶液调节胶体金pH为7.0，将胶体金与抗-HBs多克隆抗体混合，调节比例使抗体的最终浓度为3-6μg/ml，室温震荡反应30分钟，然后加入5％PEG20000至终浓度为0.25％，混匀后室温静置5分钟，15000rpm离心30分钟后，弃去上清，加入与胶体金等体积的洗脱液充分溶解沉淀物，同样转速离心，弃去上清后，将沉淀用1/10初始胶体金体积的金标抗体保存液溶解，4℃保存待用，用其包被玻璃纤维，每毫升胶体金标记抗体铺约10-15平方厘米的玻璃纤维垫，冷冻真空干燥后，分别切成0.4-0.6cm²金标垫块；

(b)反应膜的制备其是在硝酸纤维膜上包被抗-S1单克隆抗体制成检测线，同时包被重组乙肝表面抗原制成质控线，选择0.01M pH7.5磷酸盐缓冲液作为包被液，检测线包被的抗-S1单克隆抗体浓度为0.8-1.2mg/ml，质控线包被的重组乙肝表面抗原的浓度为0.5-1.0mg/ml，先用包被液冲洗划膜仪管道，设定划膜仪移动速度和包被浓度，然后加入检测线抗体和对照线抗原，在硝酸纤维膜上划线，检测线位于膜中间位置，质控线在检测线上方，二者的宽度为0.7-1mm且质控线和检测线相距4-5mm，包被后膜置室温晾40分钟，封闭液中浸泡5分钟，室温晾40分钟，保存待用；

(c)试纸条的组装将所述样品垫切成长度30cm和宽度28mm，金标垫切成长度30cm和宽度10-15mm，反应膜切成长度30cm和宽度25mm，水层剪切成长度30cm和宽度27mm，然后依次将其贴在衬卡上，组成大板后，切割成长度8cm和宽度3mm的单个人份试纸条，最后装入卡盒内。

本发明应用层析式双抗体夹心法的原理，将胶体金标记的抗-HBs多克隆抗体载于玻璃纤维垫上制成金标垫；反应膜是在硝酸纤维膜上包被抗-S1单克隆抗体制成检测线，同时包被重组乙肝表面抗原制成质控线。当待检样本中含有前S1抗原，形成检测线和质控线两条紫红色线，判为阳性，反之则只有一条紫红色线，判为阴性。本发明的优点是：具有较高的特异性和灵敏度，检测迅速、方便、快捷，操作简便，无需专门的设施，很少出现假阴性和假阳性的问题，对于乙肝的临床诊断与指导治疗具有重要作用；制备方法简便、稳定、重复性好。试剂盒采用胶体金诊断分析技术，用于检测人血清或血浆中的乙型肝炎病毒前S1抗原，对指导和帮助乙肝的的早期诊断和临床治疗与预防有重要作用。胶体金法乙型肝炎病毒前S1抗原诊断试剂盒将以其快速、简单、经济等优点成为继酶免法后又一检测前S1的主要方法。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的描述：

图1是本发明的结构示意图。

图中1.样品垫，2.金标垫，3.反应膜，4.吸水层，5.衬卡。

具体实施方式

本发明试剂盒采用胶体金层析技术，检测血清中是否存在乙型肝炎前S1抗原。

由图1中可以看出，本发明一种乙肝病毒前S1抗原快速诊断试剂盒，其卡盒中含有乙肝病毒前S1抗原检测试纸条，所述试纸条是由样品垫1、金标垫2、反应膜3和吸水层4依次粘贴在衬卡5上，所述的样品垫1是由玻璃纤维制成，吸水层4是由吸水纸制成，衬卡5是由有粘附作用的纸卡制成，它们均为市售产品。

本发明的特点是所述金标垫2是由胶体金标记的抗-HBs多克隆抗体载于玻璃纤维垫上制成，所述反应膜3是在硝酸纤维膜上包被抗-S1单克隆抗体制成检测线，同时包被重组乙肝表面抗原制成质控线。

本发明上述乙肝病毒前S1抗原快速诊断试剂盒的制备方法，其选择玻璃纤维做样品垫、吸水纸做吸水层、有粘附作用的纸卡做衬卡，其还包括以下步骤：

(a)金标垫的制备其是将胶体金标记的抗-HBs多克隆抗体载于载体玻璃纤维垫上，在硅化处理后的玻璃容器中加入浓度为0.01％的氯金酸，加热至沸腾，搅动下按照体积比100∶2加入浓度为1％的柠檬酸三钠，继续煮沸25分钟，冷去后用超纯水恢复到原体积，制成直径为25nm左右的胶体金颗粒，用0.1M K₂CO₃溶液调节胶体金pH为7.0，将胶体金与抗-HBs多克隆抗体混合，调节比例使抗体的最终浓度为3-6μg/ml，室温震荡反应30分钟，然后加入5％PEG20000至终浓度为0.25％，混匀后室温静置5分钟，15000rpm离心30分钟后，弃去上清，加入与胶体金等体积的洗脱液充分溶解沉淀物，同样转速离心，弃去上清后，将沉淀用1/10初始胶体金体积的金标抗体保存液溶解，4℃保存待用，用其包被玻璃纤维，每毫升胶体金标记抗体铺约10-15平方厘米的玻璃纤维垫，冷冻真空干燥后，分别切成0.4-0.6cm²金标垫块；

(b)反应膜的制备其是在硝酸纤维膜上包被抗-S1单克隆抗体制成检测线，同时包被重组乙肝表面抗原制成质控线，选择0.01M pH7.5磷酸盐缓冲液作为包被液，检测线包被的抗-S1单克隆抗体浓度为0.8-1.2mg/ml，质控线包被的重组乙肝表面抗原的浓度为0.5-1.0mg/ml，先用包被液冲洗划膜仪管道，设定划膜仪移动速度和包被浓度，然后加入检测线抗体和对照线抗原，在硝酸纤维膜上划线，检测线位于膜中间位置，质控线在检测线上方，二者的宽度为0.7-1mm且质控线和检测线相距4-5mm，包被后膜置室温晾40分钟，封闭液中浸泡5分钟，室温晾40分钟，保存待用；

(c)试纸条的组装将所述样品垫切成长度30cm和宽度28mm，金标垫切成长度30cm和宽度10-15mm，反应膜切成长度30cm和宽度25mm，水层剪切成长度30cm和宽度27mm，然后依次将其贴在衬卡上，组成大板后，切割成长度8cm和宽度3mm的单个人份试纸条，最后装入卡盒内。

本发明具体制备中主要试剂的配方为：

本发明所述的洗脱液为：

Tris-HCl pH 9.3        0.05M

BSA                    10g/L

本发明所述的保存液为：

Tris-HCl pH 9.3        0.05M

蔗糖                   5g/L

BSA                    5g/L

甘氨酸                 1g/L

吐温20                 0.1ml/L

硫柳汞钠               0.5g/L

酪蛋白                 2g/L

本发明所述的包被液

Na₂HPO₄·12H₂O 2.68g

NaH₂PO₄·2H₂O 0.39g

加超纯水至1000ml

本发明所述的封闭液

BSA                    20g

NaN₃                   0.5g

0.01M pH7.5PB          1000ml

其它主要试剂的配置为：

A 1％氯金酸

    氯金酸    1g

    超纯水    100ml

B 1％柠檬酸三钠

    氯金酸    1g

    超纯水    100ml

C 10％NaCl

    NaCl      10g

    超纯水    100ml

D 0.1M K₂CO₃

    K₂CO₃        13.8g

    超纯水       1000ml

E 5％PEG20000

    PEG20000     5g

    超纯水       100ml

本发明选择超纯水烧制金子，制备的胶体金颜色纯正，胶体均匀，无沉淀。

本发明胶体金颗粒度的选择用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，通过改变氯金酸和柠檬酸三钠的比例可以得到不同大小的胶体金颗粒，将不同颗粒度的胶体金分别标记抗体，比较试纸条的灵敏度和特异性。灵敏度用灵敏度质控血清考核，各取3μl金标记抗体分别和50μl灵敏度质控血清稀释度混合，然后和包被好的检测线抗体反应，15分钟观察结果；特异性用15份特异性质控血清考核，各取3μl金标记抗体分别和50μl15份特异性质控血清混合，然后和包被好的检测线抗体反应，15分钟观察结果。

结果如下表所示：

综合分析观察结果，选用0.01％的氯金酸和1％柠檬酸三钠为100∶2为最适比例，直径为25nm左右。

本发明最适标记蛋白量的确定将待标记的抗体逐级稀释，各取100μl分别加入一系列装有1ml胶体金的试管，混匀5分钟后于上述管中分别加入0.1ml 10％NaCl，混匀，静止30分钟，观察结果，未加入抗体和加入量不足以稳定胶体金的试管，呈现由红到蓝的聚沉现象，而加入蛋白质达到最低稳定量的试管则保持红色不变。胶体金由红变蓝，证明抗体量不够，胶体稳定性差。最终确定胶体金最适蛋白质标记量为3-6μg/ml。

本发明最适标记pH的确定分别将胶体金pH值调成pH6.0，pH7.0，pH7.5进行标记，其他条件一致，考察标记物的稳定性和活性。稳定性指胶体稳定性，用标记时溶液是否有沉淀来考核；灵敏度用灵敏度质控血清考核。结果如下表所示：

由此可见，pH为7.0条件下标记效果较好。

本发明金标记抗体干燥条件的选择制得的金标记抗体，用封闭液溶解，铺在玻璃纤维上，在下述三种条件下干燥，组装成条，用灵敏度质控血清考核其灵敏度，特异性用15份特异性质控血清考核。结果如下表所示：

从上表可知冷冻真空干燥效果较好，所以生产以冷冻真空干燥作为干燥条件。

本发明金标记抗体量的确定金标记抗体离心沉淀后，用约1/3制金体积的封闭液吹散金标抗体，恢复胶体状态。用玻璃纤维均匀吸附，每毫升金铺约8平方厘米的玻璃垫。冷冻真空干燥后，分别切成0.2cm²、0.4cm²、0.6cm²、0.8cm²金标垫块，与上述包被配比，用灵敏度质控血清考核其灵敏度，特异性用15份特异性质控血清考核。结果如下表所示：

由此可见，0.4-0.6cm²模式最佳。

本发明层析膜的选择金标检测试纸所用硝酸纤维膜是该试剂成败的关键，膜的孔径和蛋白吸附性是一对矛盾，孔径越大，爬升速度越快，但吸附蛋白能力差，影响灵敏度；孔径越小，吸附蛋白能力强，但爬升速度慢。为此，我们进行了广泛的筛选，主要测定爬升速度和蛋白的吸附能力。爬升速度测定：将硝酸纤维膜剪成0.4cm×2.5cm的膜，平贴于不干胶板上，从一端加血清20μl，记录血清爬完膜全长所需时间。蛋白的吸附能力：将1mg/ml的PreS1单抗点在膜上，每点1μl，用封闭液封闭5分钟，与乙肝前S1的阳性血清室温反应10分钟，洗涤，再与金标记抗体反应，洗涤，观察金标斑点的深浅作为膜蛋白吸附性的相对指标。试验结果如下表所示：

综合分析观察结果，最终选择SARTORIUS 5u NC膜来做层析膜。

本发明包被浓度的选择将抗-S1单抗用0.01mol/L pH7.5的磷酸盐缓冲液分别稀释为1.5mg/ml、1.2mg/ml、0.8mg/ml、0.5mg/ml，用划膜仪均匀划于硝酸纤维膜，组装试纸条，在其他条件不变的情况下，比较结果，灵敏度用灵敏度质控血清考核，特异性用特异性质控血清考核。结果如下表所示：

可见，包被浓度在0.8-1.2mg/ml时，其灵敏度和特异性均较好，所以抗体包被浓度可确定为0.8-1.2mg/ml。

本发明采用的是柠檬酸三钠还原法制备金标垫。先将制备胶体金用的玻璃容器进行硅化处理，再加入1ml1％的氯金酸和99ml超纯水混匀，加热至沸腾，搅动下迅速加入2ml 1％柠檬酸三钠，继续煮沸25分钟，冷去后用超纯水恢复到原体积，即制成直径为25nm左右的胶体金颗粒，该颗粒度的胶体金用于标记抗体，制成的试纸条灵敏度高和特异性好。

用0.1M K₂CO₃溶液调节金溶胶pH7.0，将胶体金与抗-HBs多克隆抗体混合，调节比例使抗体的最终浓度为3-6μg/ml，室温震荡反应30分钟，然后加入5％PEG20000至终浓度为0.25％，混匀后室温静置5分钟，15000rpm离心30分钟后，弃去上清，加入与胶体金等体积的洗脱液充分溶解沉淀物，同样转速离心，弃去上清后加入1/10胶体金体积的保存液，吹散胶体金标记的抗-HBs多克隆抗体，恢复至胶体状态，4℃保存备用。

将乙肝前S1抗原包被在硝酸纤维膜上，滴加阳性血清2孔，阴性血清1孔分别2μl，反应5分钟后洗膜，然后加金标记的抗体2μl，反应5分钟，洗膜后观察阳性孔有红斑，而阴性孔无红斑，证明抗体标记成功。

用胶体金标记的多克隆抗体包被玻璃纤维，每毫升金铺约10-15平方厘米的玻璃纤维垫。冷冻真空干燥后，分别切成0.4-0.6cm²金标垫块。

本发明反应膜的制备其是在硝酸纤维膜上包被抗-S1单克隆抗体制成检测线，同时包被重组乙肝表面抗原制成质控线。检测线包被的是抗-S1单抗；质控线包被的是重组乙肝表面抗原。选择0.01M pH7.5磷酸盐缓冲液作为包被液，该包被液灵敏度高且特异性好，包被时重组乙肝表面抗原浓度为0.5-1.0mg/ml，抗-S1单克隆抗体浓度为0.8-1.2mg/ml。包被前仔细检查设备是否正常，先用包被液冲洗划膜仪管道，设定划膜仪移动速度和包被浓度，然后加入检测线抗体和对照线抗原，调试后在硝酸纤维膜上划线，检测线位于膜中间位置，质控线在检测线上方，二者的宽度为0.7-1mm且质控线和检测线相距4-5mm，包被后膜置室温晾40分钟，封闭液中浸泡5分钟，室温晾40分钟，保存待用。

本发明试纸条的组装将所述样品垫切成长度30cm和宽度28mm，金标垫切成长度30cm和宽度10-15mm，反应膜切成长度30cm和宽度25mm，水层剪切成长度30cm和宽度27mm，然后如图1所示依次将其贴在衬卡上，组成大板后，切割成长度8cm和宽度3mm单个人份试纸条，最后装入卡盒内。检测时取出试纸条平放，在加样孔内加待测样本约45μl，15-20分钟观察结果。当试纸条仅在质控线位置上出现一条紫红色条带，结果为阴性；当试纸条在检测线和质控线位置上各出现一条紫红色条带，结果为阳性；当试纸条在检测线和质控线位置上均未出现紫红色条带，则结果无效。

本发明快速检测乙型肝炎病毒前S1抗原试剂盒各项性能指标的考核：

表12-8℃保存试剂盒检测结果

由表1中检测结果可见：

A.特异性考核：检测阴性参考品符合率，15份特异性质控血清应均为阴性；同时检测阳性参考品符合率，15份阳性质控血清至多一份出现假阴性。

B.灵敏度考核：用灵敏度质控血清检测，要求1∶8以上稀释(包括1∶8)能够检出。

C.精密度考核：试纸条显色时间及显色强度应均匀一致。

表237℃放置6天试剂盒检测结果

由表2中检测结果可见：

D.稳定性考核：37℃放置6天试剂盒仍可通过公司内部质控品检测，各项质量指标和成品检定项目测定值均在质控标准范围内。

此外，在三家医疗机构的临床考核中，采用国家批准上市的主流产品，如上海阿尔法生物技术有限公司的乙型肝炎病毒前S1抗原诊断试剂盒(酶联免疫法)进行对比试验，结果都显示，按照此制造检定规程生产的快速检测乙型肝炎病毒前S1抗原试剂盒，其灵敏度、特异性、精密性、稳定性等各项质量指标均符合标准。