D101大孔吸附树脂富集纯化竹节参总皂苷工艺

摘要

本发明提供了D101大孔吸附树脂富集纯化竹节参总皂苷工艺。其工艺包括：将竹节参总皂苷提取液浓缩至25.93mg/ml；95％乙醇湿法装柱，柱直径15mm，高220mm，蒸馏水平衡柱体积至33.5ml；将25.93mg/ml的竹节参总皂苷溶液35ml以1.85倍柱体积/小时的速度上柱吸附，静止吸附1小时后重吸附1次；蒸馏水洗脱，洗至柱子流出液无紫环反应；用17.11倍柱体积的50％乙醇洗脱柱子，回收洗脱液，将回收的洗脱液浓缩蒸干得竹节参总皂苷产物。经测定竹节参总皂苷纯度达到98.02％，回收率达到96.5％以上。实验表明，不同浓度的经过纯化的竹节参总皂苷体外抗氧化作用均明显高于未纯化的竹节参总皂苷。说明竹节参总皂苷的富集纯化有助于增强其抗氧化活性作用。

说明书

技术领域

本发明涉及功能食品加工工艺领域，特别涉及D101大孔吸附树脂富集纯化竹节参总皂苷工艺。

背景技术

竹节参为五加科人参属植物，以其干燥根茎入药，又称竹节三七，竹节人参，白三七等。竹节参兼具我国北药人参和南药三七的功用，是中国药典收载品种，具有滋补强壮、散瘀止痛、止血祛痰等功效。药理研究表明，竹节参所含的皂苷类活性物质对中枢神经系统、免疫系统和心血管系统具有广泛且稳固的药理作用[左锐，袁丁.竹节参化学成分和药理活性的研究进展[J].时珍国医国药2005，16(9)：838-841]。因此，竹节参总皂苷的提取和纯化是开发竹节参产品的关键步骤。

采用化学方法富集纯化竹节参总皂苷存在有机试剂残留、环境污染、成本高等问题。目前还没有关于D101型大孔吸附树脂富集纯化竹节参总皂苷的报道。本发明探索优化了D101型大孔吸附树脂富集纯化竹节参总皂苷的工艺条件，为竹节参功能食品的开发奠定基础。

发明内容

本发明所解决的技术问题：通过D101型大孔吸附树脂富集纯化竹节参总皂苷，提高了竹节参总皂苷纯度和较高的回收率。

本发明的具体技术方案如下：

一种D101大孔吸附树脂富集纯化竹节参总皂苷工艺，其步骤包括：

1)、干燥的竹节参切片，置于回流提取瓶中，加入70％的乙醇按料液比1∶12混合浸泡12小时，加热回流提取2次，每次不少于2小时；提取液过滤，合并，减压浓缩至竹节参总皂苷水溶液浓度为25.9mg/ml，备用；

2)、95％乙醇湿法装柱，柱直径15mm，高220mm，蒸馏水平衡柱体积至33.5ml；

3)、将步骤1)得到的竹节参总皂苷水溶液35ml，相当1.04倍柱体积，以1.85倍柱体积/小时的速度上柱吸附，静止吸附1小时后重吸附1次；

4)、蒸馏水洗脱，洗至柱子流出液无紫环反应(molish反应)；

5)、用17.11倍柱体积的50％乙醇洗脱柱子，洗脱流速1.25倍柱体积/小时，回收洗脱液；

6)、将步骤5)中回收的洗脱液浓缩蒸干得竹节参总皂苷产物，经测定纯度达到98.02％，回收率达到96.5％以上。

本发明中乙醇％浓度指100毫升乙醇水溶液中所含乙醇的毫升数。

附图说明

图1以自动部份收集器的试管号为横坐标，各管皂苷浓度为纵坐标绘制的洗脱曲线

图2竹节参总皂苷纯化前后清除超氧自由基的对比曲线

由图1洗脱曲线可见最佳洗脱剂为50％乙醇。

由图2可知，竹节参总皂苷的抑制率随总皂苷的浓度增加而增强，不同浓度的经过纯化的竹节参总皂苷体外抗氧化作用均明显高于未纯化的竹节参总皂苷。说明竹节参总皂苷的富集纯化有助于增强其抗氧化活性作用。

具体实施方式

下面通过实例进一步说明本发明的技术内容和效果。

实施例1

竹节参皂苷提取物的制备

准确称取3.0g干燥的竹节参切片，置圆底瓶中，加入70％的乙醇按料液比1∶12混合浸泡12小时，加热回流提取二次，每次2小时；提取液过滤，合并，减压浓缩；得到皂苷浓度25.9mg/ml的浓缩液。作为供试验液。

实施例2

洗脱剂的选择

步骤1、新树脂用蒸馏水清洗树脂的机械杂质，抽滤去水，然后95％乙醇浸泡24小时，备用。

步骤2、称取D101型大孔吸附树脂后，用95％乙醇湿法装柱，柱直径15mm，高220mm，蒸馏水平衡柱体积至33.5ml；

步骤3、精密吸取实施例1得到的皂苷浓度25.9mg/ml的浓缩液2.24倍柱体积上柱，预吸附1小时，流出液重吸附1次，收集流出液2.24倍柱体积，流速2.33柱体积/小时；

步骤4、用蒸馏水洗脱，洗至柱子流出液无紫环反应；

步骤5、用30％乙醇、50％乙醇、60％乙醇、75％乙醇，95％乙醇各3倍柱体积梯度洗脱，每16.7ml收集一管；

步骤6、测定各管洗脱液中皂苷的浓度。

以自动部份收集器的试管号为横坐标，各管皂苷浓度为纵坐标绘制洗脱曲线。洗脱曲线见图1。其中1～6号管浓度为30％乙醇，7～12号管浓度为50％乙醇，13～18号管浓度为60％乙醇，19～24号管浓度为70％的乙醇，25号管以后浓度为90％乙醇。由洗脱曲线可见最佳洗脱剂为50％乙醇。

实施例3

D101大孔吸附树脂富集纯化竹节参总皂苷

称取D101型大孔吸附树脂按实施例2的方法预处理后，用95％乙醇湿法装柱，柱直径15mm，高400mm，蒸馏水平衡柱体积至33.5ml；精密吸取实施例1得到的皂苷浓度25.9mg/ml的浓缩液2.56倍柱体积上柱，以1.97倍柱体积/小时的流速上柱吸附，静止吸附1小时后重吸附1次；先用蒸馏水洗脱，洗至柱子流出液无紫环反应；再用17.08柱体积50％乙醇，1.81柱体积/小时的流速洗脱，洗脱液浓缩蒸干得竹节参总皂苷产物，测定竹节参总皂苷纯度97.05％，回收率91.01％。

实施例4

D101大孔吸附树脂富集纯化竹节参总皂苷

称取D101型大孔吸附树脂按实施例2的方法预处理后，用95％乙醇湿法装柱，柱直径15mm，高400mm，蒸馏水平衡柱体积至33.5ml；精密吸取实施例1得到的皂苷浓度25.9mg/ml的浓缩液52.78倍柱体积上柱，以1.97倍柱体积/小时的流速上柱吸附，静止吸附1小时后重吸附1次；先用蒸馏水洗脱，洗至柱子流出液无紫环反应；再用18.41倍柱体积的50％乙醇，1.33倍柱体积/小时的流速洗脱，洗脱液浓缩蒸干得竹节参总皂苷，测定竹节参总皂苷纯度98.02％，回收率96.5％。

实施例5

D101大孔吸附树脂富集纯化竹节参总皂苷

称取D101型大孔吸附树脂按实施例2的方法预处理后，用95％乙醇湿法装柱，柱直径15mm，高400mm，蒸馏水平衡柱体积至33.5ml；精密吸取实施例1得到的皂苷浓度25.9mg/ml的浓缩液1.04倍柱体积上柱，以1.97倍柱体积/小时的流速上柱吸附，静止吸附1小时后重吸附1次；先用蒸馏水洗脱，洗至柱子流出液无紫环反应；再用17.11倍柱体积的50％乙醇，以1.25倍柱体积/小时的流速洗脱，洗脱液浓缩蒸干得竹节参总皂苷产物，测定竹节参总皂苷纯度98.18％，回收率97.10％。

实施例6

竹节参总皂苷体外抗氧化试验

采用邻苯三酚自氧化法测定[程超，朱玉昌，莫开菊，汪兴平.零余子皂甙的抗氧化特性研究[J].食品科学2007，28(10)：83-86]。

步骤1、分别准确称取纯化前后竹节参总皂苷，配制蒸馏水溶液，浓度分别为10mg/ml、30mg/ml、50mg/ml、70mg/ml、90mg/ml，作为样品液备用；

步骤2、吸取4.5mlpH8.250mmol/mlTris-HCI缓冲液，4.2ml蒸馏水，混合后在25℃水浴中保温20分钟，取出后立即分别加入中样品液1ml；再分别加入25℃预热过的3mmol/L邻苯三酚0.3ml(以10mmol/L HCl配制)，并以10mmol/L HCl溶液代替邻苯三酚HCl溶液作空白对照；

步骤3、将上述反应液迅速摇匀后倒入比色杯，于325nm波长下，每隔30秒测定吸光度，计算线形范围内每分钟吸光度的增加值；

步骤4、分别计算纯化前后竹节参总皂苷抑制率。

抑制率(％)＝(ΔA0-ΔA)/ΔA0×100％

式中，ΔA0邻苯三酚的自氧化速率；ΔA为加入皂苷溶液后邻苯三酚的自氧化速率，单位均为吸光度每分钟的增值。

结果如图2所示。由图2可知，竹节参总皂苷的抑制率随总皂苷的浓度增加而增强，不同浓度的经过纯化的竹节参总皂苷体外抗氧化作用均明显高于未纯化的竹节参总皂苷。说明竹节参总皂苷的富集纯化有助于增强其抗氧化活性作用。