一种杨树乙酰-乙酰载体蛋白硫脂酶基因RNAi载体及其应用

摘要

本发明涉及一种杨树乙酰-乙酰载体蛋白硫脂酶基因RNAi载体及其在沉默目的基因中的应用，所述载体是由PtFATB基因片段以正反两个方向插入植物表达载体中构建而成，所得载体通过农杆菌转化获得转基因植株。通过将转基因植株与野生型植株对比显示：转基因株系的PtFATB基因转录量比野生型植株PtFATB基因转录量降低60％以上；转基因株系叶片总脂肪酸与对照野生型植株相比较，叶部饱和脂肪酸(22:0)含量下降均在50％以上。

说明书

技术领域

本发明涉及一种杨树乙酰-乙酰载体蛋白硫脂酶基因RNAi载体，还涉及含有杨树乙酰-乙酰载体蛋白硫脂酶基因RNAi载体的宿主细胞以及该载体在沉默杨树FATB基因中的应用，属于植物基因工程技术领域。

背景技术

植物脂肪酸合成(fatty acid synthesis，FAS)的主要部位是叶绿体，一部分叶绿体合成的脂肪酸在叶绿体内参与内部的代谢，生成甘油磷脂等物质，此过程被称为原核途径(prokaryotic pathway)；另一部分叶绿体合成的脂肪酸运输到内质网中参与多种生物化学途径，这些过程叫做真核途径(euokaryoticpathway)。叶绿体向外运输脂肪酸的种类和数量受到乙酰-乙酰载体蛋白硫脂酶(FATs)控制，乙酰-乙酰载体蛋白硫脂酶(FATs)水解乙酰-乙酰载体蛋白(acyl-ACP)，从而产生脂肪酸和乙酰载体蛋白。在植物中发现存在着两类乙酰-乙酰载体蛋白硫脂酶(FATs)，分别为FATA和FATB，其中FATA在体外对油酸乙酰载体蛋白活性最高，对饱和脂肪酸乙酰载体蛋白活性低；FATB对饱和脂肪酸乙酰载体蛋白活性高，对油酸乙酰载体蛋白也有作用活性。在由于T-DNA插入使FatB失活的拟南芥突变体中，叶片中的甘油三酯中棕榈酸(16:0)含量比野生型减少了42％，在花中减少了56％，在根中减少了48％，在种子中减少了56％；并且硬脂酸(18:0)在叶片中含量也减少了50％，在种子中减少了30％；突变体在生长4星期时较之野生型鲜重减少了50％，小苗生长量只有野生型的二分之一，并且突变体的种子成活率也降低了，成活的小苗形态上也发生了改变，FATB在拟南芥中生理功能相当重要。

毛白杨乙酰-乙酰载体蛋白硫脂酶基因PtFATB已经克隆，但是PtFATB在杨树中研究还有待进行，由于脂肪酸尤其是不饱和脂肪酸在增加生物膜的流动性中发挥重要作用，其在生物膜中的含量与机体对低温逆境的抗性有极强的相关性，因此脂肪酸代谢相关基因的研究就显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种杨树乙酰-乙酰载体蛋白硫脂酶基因RNAi载体；同时，还包括含有该载体的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或者植物细胞。

本发明的目的还在于提供一种杨树乙酰-乙酰载体蛋白硫脂酶基因RNAi载体在沉默目的基因表达中的应用。

本发明的技术方案在于采用一种杨树乙酰-乙酰载体蛋白硫脂酶基因RNAi载体，该载体是由PtFATB基因片段以正反两个方向插入植物表达载体中构建而成，其中两个PtFATB基因片段之间包含一个AtFAD2基因的内含子，所述的PtFATB基因是毛白杨乙酰-乙酰载体蛋白硫脂酶基因中的一种，所述的AtFAD2基因是拟南芥油酸去饱和酶基因。

所述的植物表达载体为pBI121-1质粒；所述质粒载体包含植物筛选标记基因NPT-II。

所述的PtFATB基因片段，其中反向片段是pGEM-T-PtFATB质粒经EcoR I酶切获得的1kb的PtFATB基因片段；正向片段是pGEM-T-PtFATB质粒经Not I酶切获得的1.5kb的PtFATB基因片段。

本发明的技术方案还在于采用一种含有杨树乙酰-乙酰载体蛋白硫脂酶基因RNAi载体的宿主细胞，所述的宿主细胞包括大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或者植物细胞。

本发明的技术方案还在于采用一种杨树乙酰-乙酰载体蛋白硫脂酶基因RNAi载体在沉默目的基因表达中的应用，取含有杨树乙酰-乙酰载体蛋白硫脂酶基因RNAi载体的大肠杆菌细胞提取质粒，然后转化农杆菌细胞，通过农杆菌侵染杨树叶片，并最终获得转基因植株。检测结果显示，转基因株系的PtFATB基因转录量比野生型植株PtFATB基因转录量降低60％以上；转基因株系叶片总脂肪酸与对照野生型植株相比较，叶部饱和脂肪酸(22:0)含量下降均在50％以上。

当然，对于本发明所用到的基因，使用其他的酶切位点进行酶切，并用获得的基因片段所构建的RNAi载体，及其在沉默目的基因表达中的应用，均属于本发明的等同替换，也在本发明的保护范围之内。

本发明所构建的RNAi载体可以用于沉默PtFATB基因，该载体通过农杆菌转化，使载体上的RNAi结构整合到杨树基因组中，形成转基因植株，通过将转基因植株与野生型植株进行对比，结果显示，转基因株系的PtFATB基因转录量比野生型植株PtFATB基因转录量降低60％以上；在温室18-25℃，正常日光条件下生长180d后，转基因株系的株高只有对照野生型株高的50％；转基因株系叶片总脂肪酸与对照野生型植株相比较，叶部饱和脂肪酸(22:0)含量下降50％以上。

附图说明

图1为质粒pHurricane的物理图谱；

图2为质粒pGEM-T-PtFATB的物理图谱；

图3为质粒pBI121-1的物理图谱；

图4为中间载体pHurricane-PtFATB RNAi的酶切鉴定电泳图，1为100bp DNA Ladder，2为PtFATB基因cDNA PCR扩增后的电泳条带，3为pHurricane-PtFATB RNAi质粒经Not I单酶切后的电泳条带，4为pHurricane-PtFATB RNAi质粒经EcoR I单酶切后的电泳条带，5为pHurricane-PtFATBRNAi质粒经BamH I/Sac I双酶切后的电泳条带，6为pHurricane-PtFATBRNAi质粒的电泳条带，7为1kb DNA Ladder；

图5为质粒pHurricane-PtFATB RNAi的物理图谱；

图6为pBI121-PtFATB RNAi质粒的酶切电泳图，1为100bp DNALadder，2为PtFATB基因cDNA PCR扩增后的电泳条带，3.pBI121-PtFATBRNAi质粒经Not I单酶切后的电泳条带，4为pBI121-PtFATB RNAi质粒经EcoR I单酶切后的电泳条带，5为pBI121-PtFATB RNAi质粒经Sma I/Sac I双酶切后的电泳条带，6为pBI121-PtFATB RNAi质粒的电泳条带，7为1kbDNA Ladder；

图7为质粒pBI121-PtFATB RNAi的物理图谱；

图8为转基因植株DNA印迹杂交图，+为NPT-II基因729bp PCR产物(阳性对照)杂交带型，ck为对照植株(阴性对照)杂交带型；1和2为pBI121-PtFATB RNAi转基因植株杂交带型；

图9为转基因植株与对照植株PtFATB基因表达量Real-time PCR分析结果的条形图，1和2分别为转基因株系1、2，ck为野生型植株；

图10为转基因植株与对照植株生长高度统计图，1和2分别为转基因株系1、2，ck为野生型植株；

图11为转基因植株与对照植株叶片脂肪酸成分分析图，1和2分别为转基因株系1、2，ck为野生型植株。

具体实施方式

本发明所使用的实验材料来源如下：大肠杆菌菌株(Escherichia coli)DH5α购买自北京天为时代科技有限公司，农杆菌菌株GV3101购买自上海生物技术有限公司，质粒pHurricane(质粒图谱见图1)由澳大利亚堪培拉CSIRO植物工业研究中心柳青博士惠赠，质粒pGEM-T-PtFATB(质粒图谱见图2)的基因来源及质粒构建参见周洲等2007年于《遗传学报》上发表的论文“毛白杨乙酰-乙酰载体蛋白硫脂酶基因PtFATB的克隆与表达分析”，质粒pBI121-1(质粒图谱见图3)由本人在pBI121基础上经改良而命名，增加了更多的酶切位点，由本实验室保存。所使用的酶、试剂及试剂盒等均为市售产品。

实施例1

本实施例杨树乙酰-乙酰载体蛋白硫脂酶基因RNAi载体的构建方法包括以下步骤

(1)中间载体pHurricane-PtFATB的构建

酶切：将pGEM-T-PtFATB质粒用EcoR I单酶切，产生三个片段，回收1kb的PtFATB基因片段，此片段含有ATG起始密码子；同时用EcoR I单酶切pHurricane质粒，回收线性载体4.5kb大片段；

连接：用T4DNA连接酶进行连接，连接体系为pHurricane质粒大片段(0.3pmol)1.0μL+PtFATB 1kb大片段(0.3pmol)3.0μL+2×reactionbuffer 5.0μL+T4DNA连接酶1μL，4℃连接反应过夜；

转化：取连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含有氨苄青霉素(60mg/L)的LB平板上筛选含抗性质粒的菌斑；

验证：①PCR验证：对抗性筛选的菌斑提质粒进行PCR验证，验证所用引物序列为PF 5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’，正向引物是根据载体序列设计的，PR 5’-CATGGTCATAGCTGTTTCC-3’，反向引物是根据PtFATB基因1kb片段(即上述pGEM-T-PtFATB质粒经EcoR I单酶切获得的1kb片段)序列设计的，筛选出PtFATB基因1kb片段反向插入pHurricane质粒的菌斑；②酶切验证：对PCR能够扩增出1kb片段的质粒，用EcoR I单酶切和SmaI/SacI双酶切鉴定分析，挑选酶切条带正确的载体质粒，将其命名为pHurricane-PtFA TB；

(2)中间载体pHurricane-PtFATB RNAi的构建

酶切：将pGEM-T-PtFATB质粒用Not I单酶切，回收1.5kb的PtFATB基因片段；同时用Not I单酶切pHurricane-PtFATB质粒，回收线性载体5.5kb大片段；

连接：用T4DNA连接酶进行连接，连接体系为pHurrican e-PtFA TB质粒大片段(0.3pmol)1.0μL+PtFATB 1.5kb片段(0.3pmol)3.0μL+2×reaction buffer 5.0μL+T4DNA连接酶1μL，4℃连接反应过夜；

转化：取连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含有氨苄青霉素(60mg/L)的LB平板上筛选含抗性质粒的菌斑；

验证：①PCR验证：对抗性筛选的菌斑提质粒进行PCR验证，验证所用引物序列为PF 5’-GGAAACAGCTATGACCATG-3’，正向引物是根据载体序列设计的，PR 5’-GTTGAGCTGCTCTGCCTCTC-3’，反向引物是根据PtFATB基因cDNA序列设计的，筛选出PtFATB基因1.5kb片段正向插入pHurricane-PtFATB质粒的菌斑；②酶切验证：对PCR能够扩增出1.5kb片段的质粒，用Not I单酶切、EcoR I单酶切、BamHI/Sac I双酶切进行酶切鉴定分析(酶切后的电泳结果见图4)，挑选酶切条带正确的载体质粒，将其命名为pHurricane-PtFATB RNAi(质粒图谱见图5)；

(3)RNAi载体pBI121-PtFATB RNAi的构建

酶切：将pBI121-1质粒用Sma I/Sac I双酶切，回收pBI121-1质粒大片段，同时将中间载体pHurricane-PtFATB RNAi质粒用Sma I/Sac I双酶切，回收PtFATBRNAi结构片段(该片段包含1.2kb的AtFAD2基因内含子)；

连接：用T4DNA连接酶进行连接，连接体系为pBI121质粒大片段(0.3pmol)1.0μL+PtFATB RNAi结构片段(0.3pmol)3.0μL+2×reactionbuffer 5.0μL+T4DNA连接酶1μL，16℃连接反应过夜；

转化：取连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含有氨苄青霉素(60mg/L)的LB平板上筛选含有抗性质粒的菌斑；

验证：对抗性筛选出的菌斑提取质粒，并对所提取的质粒分别用Not I单酶切、EcoR I单酶切、Sma I/Sac I双酶切鉴定分析(酶切后的电泳结果见图6)，挑选酶切条带正确的载体质粒，将其命名为pBI121-PtFATB RNAi(质粒图谱见图7)。

实施例2

本实施例为pBI121-PtFATBRNAi载体的应用实例，具体步骤如下

(1)将pBI121-PtFATB RNAi质粒转化农杆菌，经验证后，使用含有pBI121-PtFATB RNAi质粒的农杆菌侵染银腺杨(P.alba×P.glandulossa)无性系84K的叶片，通过组织培养的方法获得PtFATB RNAi转基因抗性植株，PCR初步验证获得的转基因植株，将检测结果呈阳性的转基因植株移栽温室，使用DNA印迹杂交分析进一步验证(检测结果如图8所示)，结果显示PtFATBRNAi基因片段已经整合到银腺杨的基因组中。

(2)转基因植株FATB基因表达量分析

经Realtime PCR分析，pBI121-PtFATB-RNAi转基因系1和2中PtFATB基因转录量与野生型植株PtFATB基因转录量均值相比降低了60％和35％(如图9所示，其中X轴代表不同试验植株，Y轴代表基因相对表达量)。

(3)转基因植株生长及叶片脂肪酸组分分析

在温室18-25℃，正常日光条件下生长180d后，转基因株系的株高只有对照野生型株高的50％(如图10所示，其中X轴代表不同试验植株，Y轴代表各植株的生长高度)。

取转基因株系1和2植株顶端第3或第4片叶片，其宽度约3cm，提叶片总脂肪酸，并经甲酯化后气相色谱分析；与对照野生型植株相比较，转基因株系1和2叶片中的叶部饱和脂肪酸(22:0)含量下降均在50％以上(如图11所示，其中X轴代表不同试验植株，Y轴代表各植株的脂肪酸含量)。