用于治疗和/或预防小反刍兽疫的siRNA片段及其应用

摘要

本发明提供一种用于治疗和/或预防小反刍兽疫的siRNA片段及其应用。所述siRNA片段及包含该siRNA片段的载体均对小反刍兽疫病毒(PPRV)感染的Vero细胞系具有保护作用，通过实时定量PCR和免疫印迹实验发现该siRNA片段及包含该siRNA片段的载体能使PPRV-L蛋白mRNA水平降低约20％-40％。因此，本发明的siRNA片段及包含该siRNA片段的载体可用于制备治疗和/或预防小反刍兽疫的药物，对基因治疗小反刍兽疫具有重要价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种siRNA片段及其应用，特别是涉及一种用于治疗和/或预防小反刍兽疫的siRNA片段及其应用。

背景技术

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA介导的序列特异性的基因沉默。1998年2月由华盛顿卡耐基研究院的Fire与马萨诸塞大学癌症中心的Mello首次在对秀丽新小杆线虫(Caenorhabditis elegan)的研究中提出这一概念，其与在植物中发现的共表达和在粗糙脉孢霉菌中发现的消除(quelling)现象都属于转录后基因沉默机制。这一机制已被证实在真菌、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等几乎所有真核生物细胞中都存在，甚至在大肠杆菌中也存在类似机制。在发现哺乳动物细胞中也存在这一机制后，RNAi作为一种快速、有效、特异的抑制基因表达的工具被广泛应用于基因功能的研究以及肿瘤和病毒性疾病的治疗研究中。

小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus，PPRV)是副粘病毒科麻疹病毒属成员，是一种有包膜的不分节段的单负链RNA病毒，其病毒粒子呈球形，基因组全长15948个核苷酸，依次包含N-P/C V-M-F-H-L共6个基因，分别编码核蛋白(N蛋白)、L蛋白辅助因子(P蛋白)、基本膜蛋白(M蛋白)、介导病毒包膜与宿主细胞膜融合的融合蛋白(F蛋白)、作为受体蛋白与细胞表面分子结合的具血凝素活性的蛋白(H蛋白)、病毒转录酶和复制酶的酶成分的蛋白(L蛋白)这六种主要结构蛋白，以及C、V两种非结构蛋白。所述L蛋白除了具有聚合酶活性外，还有甲基化、加帽和多腺苷酸化的活性，对于PPRV的复制是必需的，在病毒转录及复制过程中十分重要。

小反刍兽疫以发热、眼鼻分泌物、口炎、腹泻和肺炎为特征，主要引起小反刍动物，尤其是山羊及绵羊发病，患病率与病死率均较高。目前小反刍兽疫在许多国家爆发流行，成为威胁畜牧业安全的重要病原之一。虽然预防PPRV的疫苗有灭活苗和弱毒苗，然而疫苗的使用只能够提供部分保护，使机体不再出现临床症状，不能阻止再次感染，而且常规疫苗通常需要十四天左右才能对机体产生保护力。另外，弱毒苗毒株在自然状态下还有可能发生毒力返强现象，造成感染羊群的持续感染，使得一些常规的疫苗很难取得理想的效果。因此，迫切需要开发一种新型的能对所有PPRV病毒株提供更有效保护的抗病毒措施。

发明内容

因此，本发明的目的在于克服现有治疗与预防小反刍兽疫方法的上述缺点和不足，提供一种基于RNAi技术的抑制小反刍兽疫病毒基因表达，从而治疗和/或预防小反刍兽疫的特异性RNAi片段。

本发明的上述目的是采用以下技术方案来实现的：

一种用于治疗和/或预防小反刍兽疫的siRNA片段，其序列为任意一种下列序列：

L-462(SEQ ID NO.1)：

5’-GCACAUGCAUAGCUCUCAA-3’

3’-CGUGUACGUAUCGAGAGUU-5’；

L-5389(SEQ ID NO.2)：

5’-GCGUACAAGGAAGUUCUUA-3’

3’-CGCAUGUUCCUUCAAGAAU-5’。

上述siRNA片段可以通过化学合成、体外转录、siRNA表达载体或siRNA表达框架的方法来获得。在优选实施方案中，在所述siRNA片段的3’端进一步加上2-6个dT或2-6个U的修饰序列，可以减少siRNA在细胞内降解，增强其稳定性。

按照以下方法将合成的siRNA片段分别转染至Vero细胞系(非洲绿猴肾细胞)中：

1、Vero细胞的培养：用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基(GIBCO)，于37℃、5％CO₂条件下培养；

2、转染：采用脂质体Hiperfect(Qiagen)进行细胞转染，用1μg siRNA转染Vero细胞(6孔板)。

完成转染后24h，接种PPRV(MOI＝0.1)进行攻毒。

攻毒24h后，提取细胞总RNA反转录，以GAPDH基因作为内参，通过实时定量PCR(Real-time PCR)检测PPRV-L基因的mRNA水平，并通过免疫印迹(Western Blot)检测PPRV-L蛋白的表达水平。

本发明还提供一种用于治疗和/或预防小反刍兽疫的载体，其中包含一种或两种序列为任意一种上述序列的siRNA片段。所述载体优选为逆转录病毒载体(包括慢病毒载体)、腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV载体)以及质粒载体等，如pSuper载体、pSilencer载体、RNAi-Ready表达载体(ClonTech)等。这些载体能够在真核细胞，尤其是哺乳动物细胞中高效持续表达siRNA，本身或其产物不对机体产生其它刺激或影响机体正常生理功能，能够安全地用于机体。

本发明所设计的siRNA片段及其载体可应用于制备治疗和/或预防小反刍兽疫的药物。该药物为抑制小反刍兽疫病毒的药物。具体来说，该药物为抑制小反刍兽疫L蛋白表达的药物。

本发明根据siRNA设计的策略，从GenBank中查找PPRV基因组序列(GenBank登陆号：EU364809)，设计出多对siRNA片段，并通过转染Vero细胞系试验对这些siRNA片段进行活性筛选。筛选结果表明，本发明设计的2对siRNA片段能够降低Vero细胞中PPRV-L蛋白的表达，其中L-462使PPRV-L基因的mRNA水平降低约40％，L-5389使PPRV-L基因的mRNA水平降低约30％。用这两对siRNA插入载体并转染Vero细胞系的试验表明，包含L-462的载体使PPRV-L基因的mRNA水平降低约40％，包含L-5389的载体使PPRV-L基因的mRNA水平降低约20％。由于PPRV-L蛋白对于PPRV的复制是必需的，抑制PPRV-L蛋白的表达就抑制了PPRV在细胞中的生长与繁殖。本发明所设计的siRNA片段L-462或L-5389使PPRV-L蛋白表达量下降，可以应用于制备治疗和/或预防小反刍兽疫的药物。

综上所述，本发明基于RNAi技术，提供了一种抑制PPRV-L蛋白表达的特异性RNAi片段及包含该片段的载体，通过抑制PPRV复制必需的L蛋白基因表达，从而实现抑制PPRV的生长与繁殖，可应用于制备治疗和/或预防小反刍兽疫的药物。

附图说明

图1为本发明的siRNA对PPRV-L蛋白的mRNA水平影响结果示意图。

图2为本发明的siRNA对PPRV-L蛋白的表达水平影响结果示意图。

图3为本发明的重组质粒对PPRV-L蛋白的mRNA水平影响结果示意图。

图4为本发明的重组质粒对PPRV-L蛋白的表达水平影响结果示意图。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的范围。

以下实施例中所使用的技术，包括基因测序合成、细胞转染等分子生物学技术，以及细胞培养、检测技术等，除非特别说明，均为本领域的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂、细胞系等，除非是本说明书特别说明，均为本领域技术人员可以通过公共途径获得的。

实施例1：RNAi序列的设计

根据siRNA设计的策略：1)从靶基因起始密码子AUG下游50～100个核苷酸开始搜寻理想的siRNA片段，越靠近靶基因的3’端，其基因沉默效果可能越好；2)siRNA片段最好为AA(Nn)UU(N代表任意碱基，n为碱基数目，在19～29nt之间)，NA(Nn)UU和NA(Nn)NN序列也可以。3)具有均衡碱基含量(即G/C含量在30％～70％)。依据PPRV西藏分离株基因组序列(GenBank登陆号：EU364809)，设计出3对siRNA片段，其序列分别为：

L-462(SEQ ID NO.1)：

5’-GCACAUGCAUAGCUCUCAA-3’

3’-CGUGUACGUAUCGAGAGUU-5’；

L-5389(SEQ ID NO.2)：

5’-GCGUACAAGGAAGUUCUUA-3’

3’-CGCAUGUUCCUUCAAGAAU-5’；

L-1382(SEQ ID NO.3)：

5’-CCAUGUAUCUCAAAGACAA-3’

3’-GGUACAUAGAGUUUCUAUU-5’。

上述siRNA片段长度均为21nt，负链及其任意一个位置的突变体与已知人类基因和基因表达片段无同源性。

在所述siRNA片段的3’端进一步加上2-6个dT或2-6个U修饰序列，以减少siRNA在细胞内降解，增强其稳定性。

另外，使用的阴性对照及GAPDH内参序列分别为：

阴性对照(SEQ ID NO.4)：

5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’

3’-TTAAGAGGCUUGCACAGUGCA-5’

GAPDH内参(SEQ ID NO.5)：

5’-GUAUGACAACAGCCUCAAGTT-3’

3’-TTCAUACUGUUGUCGGAGUUC-5’

上述siRNA片段均委托上海吉玛生物制药技术有限公司合成。

实施例2：siRNA转染Vero细胞系，并进行PPRV感染

实验材料：Vero细胞、PPRV野生分离株(MOI＝0.1)、PPRV多克隆抗体。

1、转染：Vero细胞用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基(GIBCO)，于37℃、5％CO₂条件下培养。采用脂质体Hiperfect(美国Qiagen公司生产)进行细胞转染，操作方法可完全根据厂家说明。转染时，用1μg siRNA转染Vero细胞(6孔板)。

2、PPRV感染：转染24h后，每个培养板加入PPRV细胞毒(MOI＝0.1)，37℃孵育45min，补足培养基至培养体积，继续于37℃、5％CO₂条件下培养24h。

实施例3：干扰效果的检测

I.实时定量PCR分析：

1.提取总RNA

使用Trizol试剂(Invitrogen)提取细胞总RNA，步骤参考Invitrogen公司说明书。

提取的细胞总RNA经鼠源反转录酶M-MLV(美国Promega公司生产)，以随机六聚体引物反转录为cDNA，步骤参考Promega公司说明书。

2.实时定量PCR实验

1)引物与探针设计

以狒狒(Papio anubis)GAPDH基因作为实时定量PCR反应的阳性对照，分别设计引物和探针序列，如表1所示。

表1GAPDH基因和PPRV-L基因引物和探针序列

2)试剂与仪器

试剂：铁克曼(TaqMan)实时定量PCR通用试剂(上海吉玛生物技术有限公司)；

仪器：FTC-2000A实时定量PCR仪(枫岭，中国)。

3)逆转录出cDNA

PCR管中混合以下试剂：

Oligo-dT    4μl

RNA         20μl

70℃保温10min，迅速在冰上冷却2min以上，瞬时离心，加入以下试剂：

5×M-MLV Buffer 8μl

dNTP(0.25mM)    4μl

RNasin          2μl

M-MLV           2μl

42℃保温2小时后，再于70℃保温15分钟，而后冰上冷却，得到cDNA。

4)PCR反应体系：如表2所示。

表2PCR反应体系

 成分  终浓度  体积 2×实时定量PCR Master Mix  1×  10μl F引物(10μM)  0.2μM  0.4μl R引物(10μM)  0.2μM  0.4μl 探针(10μM)  0.1μM  0.2μl cDNA模板  -  2μl Taq DNA聚合酶(5U/μl)  0.5U/μl  0.2μl dd H₂O  达20μl

实时定量PCR反应条件：95℃，5min变性；40个循环：95℃，15秒；55℃，30秒；72℃，30秒。

5)实验结果：

图1为本发明的实时定量PCR检测PPRV-L蛋白mRNA水平结果示意图，其中对照为未经siRNA处理的细胞样品，其它处理与样品均一致。

C_T值代表每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所进行的循环数，取各种样品的C_T值的平均值，计算ΔC_T，ΔΔC_T和2^-ΔΔC_T，具体数据处理结果如表3所示。

表3数据处理结果

  样品名称  ΔC_T  2^-ΔΔC_T  t检验  L-462  6.06±0.18  0.63(0.51～0.79)  P＜0.05

  样品名称  ΔC_T  2^-ΔΔC_T  t检验  L-1382  4.55±0.20  1.81(1.44～2.25)  P＜0.05  L-5389  5.89±0.18  0.71(0.57～0.88)  P＜0.05  对照  5.40±0.25  1.00(0.79～1.28)  /

ΔC_T指同一样品中，待检基因与内参基因GAPDH的平均C_T值的差值，即ΔC_T＝C_{T待测基因}-C_{T内参基因}。ΔΔC_T指其余样品的ΔC_T值和对照组相应基因的ΔC_T值之差，即ΔΔC_T＝(C_{T待测基因}-C_{T内参基因})_实验组-(C_{T待测基因}-C_{T内参基因})_对照组。2^-ΔΔC_T是按照ΔΔC_T计算的，括号内为其置信区间。

以2^-ΔΔC_T值表示实验组待测基因的表达相对于对照组的变化倍数，L-462与对照组的差异为：1.00-0.63＝0.37＝37％；L-5389与对照组的差异为：1.00-0.71＝0.29＝29％。可见，与对照组相比，L-462及L-5389的相对表达量约为30-40％，即L-462及L-5389相对野生型组表达量的差异百分比达到约30-40％。

经过三次重复实验进行T检验，标准差小于0.05，为显著性差异。II.免疫印迹检验

1.蛋白质的提取

使用WIP组织细胞裂解液(北京赛驰生物科技有限公司)提取蛋白质，步骤参照说明书。

2.蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳

1)配制聚丙烯酰胺凝胶，分离胶浓度12％，基层胶浓度5％，各组分如表4所示。

表4聚丙烯酰胺分离胶的配制

  试剂成分  分离胶12％(ml)  试剂成分 基层胶5％(ml)  Acry∶Bis(30∶0.8)  6.00  Acry∶Bis(30∶0.8)  1.30  4×Tris·Cl/SDS，pH8.8  3.75  4×Tris·Cl/SDS，pH6.8  2.50  H₂O  5.25  H₂O  6.10  10％过硫酸铵  0.05  10％过硫酸铵  0.05  TEMED  0.01  TEMED  0.01

2)在微量离心管中，用2×SDS加样缓冲液按1∶1(v/v)稀释待测蛋白质样品，于100℃煮沸5min。样品每孔上样40μl，蛋白质分子量标准物(Marker)上样20μl。

3)使用1×SDS电泳缓冲液，120V电压电泳2小时。

4)将凝胶板取出，移出凝胶，标记凝胶以便识别加样次序。

3.蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素滤膜

1)依据凝胶大小，切6张滤纸和1张硝酸纤维素滤膜。把硝酸纤维素滤膜漂浮于一盘去离子水的水面上浸泡5分钟以上以驱除留于滤膜上的气泡。在一浅托盘中加入少量转移缓冲液，把6张滤纸浸泡于其中。

转移缓冲液：190mmol/L甘氨酸，25mmol/L Tris碱，20％甲醇。

2)按如下顺序安装转移装置：

底部电极(阴极)→一张海绵垫片→3张用转移缓冲液浸泡过的滤纸→凝胶→硝酸纤维素滤膜→3张用转移缓冲液浸泡过的滤纸→电极(阳极)。

3)依据凝胶面积按300mA接通电流，电转移2小时结束。电转移过程中保持低温。

4.对固定于硝酸纤维素滤膜上的蛋白质进行染色

1)待硝酸纤维素滤膜干燥，将其漂浮于一盘去离子水的水面上，通过毛细作用使滤膜自下而上湿润。然后把滤膜浸泡于水中，浸泡5分钟以上以驱除留于其上的气泡。

2)把滤膜转移到含有丽春红S使用液的托盘中染色5-10分钟，其间轻轻摇动染液。

混合下列成分，配成丽春红S贮存液(10×)：

丽春红S 2g

三氯乙酸30g

磺基水杨酸30g

加水至100ml

用1份上述贮存液加9份去离子水即配成丽春红S使用液，使用后即废弃。

3)蛋白带出现后，于室温下用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，其间换水数次。

4)用铅笔标出作为分子量标准的参照蛋白的位置。

5.封闭硝酸纤维滤膜的免疫球蛋白结合位点

1)把硝酸纤维素滤膜放入可以加热封接的塑料袋中，根据滤膜面积以0.1ml/cm²的量加入封闭液(8％脱脂牛奶)，排除气泡，密闭袋口，平放在平缓摇动的摇床平台上于室温下温育1小时。

2)剪开塑料袋，弃去封闭液，立即加入抗靶蛋白抗体溶液与滤膜一同温育。

6.抗体和靶蛋白的结合

加入一抗：

1)在装有用上述方法处理过的硝酸纤维素滤膜的塑料袋中，按0.1ml/cm²的量加入封闭液和适量的第一抗体(PPRV多克隆抗体，20μl/5ml)。

2)排除气泡后密封袋口，将滤膜平放在平缓摇动的摇床平台上，于37℃下温育1～2小时。

3)剪开塑料袋，废弃封闭液和抗体，用25ml PBS漂洗滤膜3次，每次10分钟。

4)按下面介绍的方法，立即用二级免疫试剂与滤膜一同温育。

加入二抗：

1)经PBS最后一次洗涤后，把硝酸纤维素滤膜转移到装有PBS溶液的托盘中，于室温下平缓摇动温育10分钟。

2)把滤膜转移至一个可以加热封接的塑料袋中，按滤膜面积加入0.1ml/cm²封闭液。

3)加入酶联二级试剂(HRP-羊抗兔IgG，20μl/5ml)，封口。

4)于37℃下平缓摇动，将滤膜与酶联二级试剂一同温育40min。

5)把滤膜转移至TBST溶液。于室温下平缓摇动，温育10分钟。重复3次，每次更换新的TBST溶液。

7.ECL化学发光底物检测

0.5ml缓冲液A+0.5ml缓冲液B，加入到NC膜上，孵育5min，而后X光片反应0.5min，显影液处理0.5min，定影液处理0.5min，拍照。图2为免疫印迹检测PPRV-L蛋白表达水平结果示意图，其中对照为未使用siRNA处理的细胞样品，对该样品其它处理与样品L-462、L-1382、L-5389均一致。

由图可知，L-462和L-5389的条带明显淡于对照，L-1382的条带明显比较深，此图可以定性地作为实时定量RT-PCR的参考。

实施例4：将siRNA导入载体

I.寡核苷酸设计

选用干扰效果明显的L-462和L-5389序列，设计与实施例1中siRNA序列设计相似，在原siRNA序列(转换为DNA序列)的基础上进行设计，在其第一链5’端加入BglII酶切位点，第二链5’端加入HindIII酶切位点，得到两段互补的寡核苷酸片段，其序列为：

L-462：

5’-GATCCCCGCACATGCATAGCTCTCAATTCAAGAGATTGAGAGCTATGCATGTGCTTTTTA-3’

3’-GGGCGTGTACGTATCGAGAGTTAAGTTCTCTAACTCTCGATACGTACACGAAAAATTCGA-5’

L-5389：

5’GATCCCCGCGTACAAGGAAGTTCTTATTCAAGAGATAAGAACTTCCTTGTACGCTTTTTA-3’

3’GGGCGCATGTTCCTTCAAGAATAAGTTCTCTATTCTTGAAGGAACATGCGAAAAATTCGA-5’

上述寡核苷酸片段均委托Invitrogen公司合成。

II.载体的构建

将pBabe-Puro载体上的H1-RNA启动子克隆到无启动子的穿梭载体pSuper载体中(Oligoengine)，得到的新的穿梭载体命名为pBabe-Super，该载体可在重组腺病毒中启动siRNA的表达。

上述合成的核苷酸退火并连接到pBabe-Super的BglII和HindIII位点，得到构建好的质粒，命名为pBabe-L-462和pBabe-L-5389，经EcoRI酶切鉴定、测序鉴定正确。

实施例5：重组质粒干扰效果的检测

I.用重组质粒转染Vero细胞，并感染PPRV，具体方法参见实施例2。

II.实时定量PCR分析，具体方法参见实施例3。

结果如图3所示。图3为实时定量PCR分析本发明的重组质粒对PPRV-L蛋白的mRNA水平影响结果示意图。其中对照为未导入siRNA处理的细胞样品，其它处理与样品均一致。具体实验数据处理结果如表5所示。

表5数据处理结果

  样品名称  ΔC_T  2^-ΔΔC_T  t检验  pBabe-L-462  6.05±0.17  0.59(0.50～0.69)  P＜0.05  pBabe-L-5389  5.59±0.13  0.81(0.70～0.93)  P＜0.05  对照  5.28±0.15  1.00(0.86～1.16)  /

以2^-ΔΔC_T值表示实验组待测基因的表达相对于对照组的变化倍数，pBabe-L-462与对照组的差异为：1.00-0.59＝0.41＝41％；pBabe-L-5389与对照组的差异为：1.00-0.81＝0.19＝19％。可见，与对照相比，pBabe-L-462及pBabe-L-5389的相对表达量约为19-41％，即质粒pBabe-L462和pBabe-L5389相对于对照组表达量的差异百分比达到约19-41％。

经过三次重复实验进行T检验，标准差小于0.05，为显著性差异。

III.免疫印迹检验，具体方法参见实施例3

结果如图4所示。图4为免疫印迹检测本发明的重组质粒对PPRV-L蛋白表达水平结果示意图，其中对照为未导入siRNA处理的细胞样品，其它处理与样品均一致。由图可知，重组质粒pBabe-L-462和pBabe-L-5389的L蛋白表达量少于对照组M蛋白的表达量，表明这两种重组质粒对PRRSV的M基因转录蛋白表达具有抑制效果。此图可以定性地作为实时定量RT-PCR的参考。

序列表

<110>中国科学院动物研究所

<120>用于治疗和/或预防小反刍兽疫的siRNA片段及其应用

<130>DIC08110095

<160>11

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>1

gcacaugcau agcucucaa    19

<210>2

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>2

gcguacaagg aaguucuua    19

<210>3

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>3

ccauguaucu caaagacaa       19

<210>4

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>4

uucuccgaac gugucacgu       19

<210>5

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<400>5

guaugacaac agccucaag       19

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

cctcaagatc gtcagcaatg c    21

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

cacgatacca aagttgtcat gga      23

<210>8

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

cctgcaccac caactgctta gcacc    25

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

attttaggga gagcctgct           19

<210>10

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

ttggccttta atcctatcat aat    23

<210>11

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

cctatccgag atatagtaac ttc    23