基于阴离子表面活性剂形成的双水相体系及其制备方法

摘要

该发明提供了一种基于阴离子表面活性剂形成的双水相体系及其制备工艺和用途。其由阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠、离子液体1-丁基-3甲基咪唑四氟硼酸盐和水构成。体系中使用的表面活性剂的质量分数小、成相时间短、含水量高、体系简单、条件温和，离子液体和表面活性剂均可回收重复使用、具有低耗高效等特点，在萃取分离工程中是一种较为环保的新型萃取体系。尤其是对于生物物质的萃取分离具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于胶体与界面化学、分析化学、生物化学相互交叉的前沿领域，尤其涉及一种新的绿色溶剂1-丁基-3甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体和阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠与水形成的新的双水相萃取体系及其制备方法。

背景技术

双水相萃取技术是近年来出现的一种新型分离技术，是利用组分在两水相间分配的差异而进行组分的分离提纯的技术。该技术由于操作简便、能耗低、分离效率高、不会导致被分离物质的破坏和失活、易于工程放大和连续操作等，被广泛应用于生物化学、细胞生物学、生物化工、食品和医药等领域，特别适用于生物物质及天然资源中有效成分的分离和提纯，尤其是近年来它对蛋白质、酶、核酸等生物活性物质的分离纯化受到广泛重视，因为大部分生物制品的原液是低浓度和有生物活性的，需要在低温或室温条件下进行富集、分离，而常规的萃取技术在这些领域中的应用受到一定限制。被认为是生物下游工程中一种极有前途的初级分离单元操作。双水相萃取技术就是在基于液-液萃取理论的同时又考虑到保持生物活性而开发的一种新型的萃取分离技术，因此寻求新型双水相体系仍为双水相萃取技术的主要发展方向之一。

新型双水相体系的开发主要集中在廉价及易于回收或操作简便的系统。近年来在生物物质分离过程中得到应用的双水相系统有：聚合物-聚合物、聚合物-无机盐和表面活性剂双水相系统。由表面活性剂形成的双水相系统中由于表面活性剂形成的胶束为生物分子提供了封闭的空间，并且由于体系中表面活性剂的质量分数小，其中的生物活性物质不易发生聚集沉淀而失活，具有分离条件温和、操作简单等特点。因此，用于生物活性物质的分离已引起理论界及应用领域工作者的广泛关注。

2003年Rogers首次提出了离子液体双水相的概念，并证明这种双水相体系将有可能在离子液体的制备、回收以及生物物质的萃取分离上有重大应用。因为离子液体双水相体系综合了离子液体和双水相体系的优点，开辟了新的萃取分离体系，这不仅拓宽了离子液体的应用范围，而且为寻找一种更为高效、绿色的生物分离技术提供了依据。

公开号CN 101016176A(申请号200610134738.2)的中国专利文献公开了一种双水相体系，特别涉及一种离子液体一无机盐一水双水相体系，是为了解决亲水性离子液体的回收，将无机盐和水加入离子液体中，振荡，形成上相富含离子液体，下相富含无机盐和水的双水相体系，其中无机盐、水和离子液体按重量百分比配比是：无机盐10-18％、水60-71％，离子液体14-26％。所述的双水相体系用于回收亲水性离子液体。公开号CN 1751766A(申请号200410078283.8)的中国专利文献涉及一种离子液体-糖双水相体系，是向一定浓度的糖的水溶液中逐滴滴加离子液体，置于一定温度下的水浴中，震荡，会出现混浊现象，静置分层，出现双水相体系。公开号CN 101502722A(申请号200810208083.8)的中国专利文献公开了一种萃取食品中残留抗生素的离子液体双水相体系，包括40％-56％(w/v)的无机磷酸盐、1％-20％(W/V)的离子液体和待测样品溶液。

上述各类用于生物制品萃取分离的双水相体系各有千秋，但随着基因工程、蛋白质工程、细胞培养工程、代谢工程等高新生物技术研究工作的广泛展开，各种生化新产品不断涌现，由于大部分的生物产品原液是具有低浓度和生物活性的，对分离条件以及环境要求极其苛刻，因此对一些特殊生化新产品的萃取分离给新型分离体系的开发提出了新的挑战。

发明内容：

针对现有双水相体系的现状，本发明的目的是提供一种阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠+绿色溶剂1-丁基-3甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体+水形成的双水相及其制备方法。也提供了该双水相在提取和纯化生物活性物质(如甜椒色素)中的应用。

本发明的技术方案是这样实现的：基于阴离子表面活性剂形成的双水相体系，由阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠、离子液体1-丁基-3甲基咪唑四氟硼酸盐和水构成。

前述的双水相体系，优选的方案是，体系中各组分的质量百分含量为：阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠1.0-9.7％，离子液体1-丁基-3甲基咪唑四氟硼酸盐9.7-39.5％，水59.3-80.6％。更为优选的是，体系中各组分的质量百分含量为：阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠1.0％，离子液体1-丁基-3甲基咪唑四氟硼酸盐39.0％，水60.0％。另一种更有选的方案是，体系中各组分的质量百分含量为：阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠9.7％，离子液体1-丁基-3甲基咪唑四氟硼酸盐9.7％，水80.6％。

本发明所用1-丁基-3甲基咪唑四氟硼酸盐的化学结构如下：

前述双水相体系的制备方法，是利用三元相图和杠杆规则，将三角形的三个顶点分别定为水、离子液体和十二烷基苯磺酸钠，在离子液体/十二烷基苯磺酸钠的一边，用10ml试管配制离子液体和表面活性剂质量比分别为1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2和9∶1的混合物1g，不断搅拌下向其中逐滴滴加二次蒸馏水，用目测法根据溶液清浊变化，绘制粗略的三元相图；然后在近似双水相区域内配制50份样品，震荡、搅拌，置于室温的水浴(也可置于10～30℃水浴)中，恒温放置24h以上，观察样品的外观和分相情况，以判断形成的双水相区域并绘制准确的三元相图，得到基于阴离子表面活性剂形成的双水相体系；双水相体系形成的判断标准为同时满足：a、两相内无浑浊或沉淀；b、两相间存在清晰的界面。所述形成双水相时加入水的质量约为总质量的59％，双水相消失时约为80％。

前述双水相体系的制备方法，另一技术路径是，利用三元相图和杠杆规则，向分别装有0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和0.9g阴离子表面活性剂的10ml试管中分别加入0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2和0.1g的二次蒸馏水，不断搅拌下向其中逐滴滴加离子液体，用目测法根据溶液清浊变化，粗略绘制三元相图；然后在近似双水相区域内配制50份样品，震荡、搅拌，置于室温的水浴(也可置于10～30℃水浴)中，恒温放置24h以上，观察样品的外观和分相情况，以判断形成的双水相区域并绘制准确的三元相图，得到基于阴离子表面活性剂形成的双水相体系；双水相体系形成的判断标准为同时满足：a、两相内无浑浊或沉淀；b、两相间存在清晰的界面。出现双水相时的离子液体的质量约为总质量的10％，双水相消失时约为39％。

本发明体系不受滴加顺序的限制。对压力和物理场(磁场、超声波等)无限制。温度高于48℃即可变为均相溶液。因此该双水相体系适用于在48℃以下使用(最佳清晰界面的温度范围为2℃-48℃)。

本发明以最普通的阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠(在使用前应进行纯化：将十二烷基苯磺酸钠溶入苯和无水乙醇的混合溶剂中，加热回流4小时，然后进行重结晶。反复进行三次，产品经真空干燥后得纯品)、咪唑性离子液体和水为基本材料，用浊度滴定法制备双水相新体系。

本发明制备了由绿色溶剂1-丁基-3甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体和阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠与水形成的新的双水相萃取体系。表面活性剂的质量分数小、成相时间短、含水量高、离子液体和表面活性剂均可重复使用、具有低耗高效等特点，在萃取分离工程中是一种较为环保的新型萃取体系。这类体系对于低温下分离生物制品是非常有利的，因此该系列双水相体系的发现对于扩大室温离子液体的应用有重要意义。该体系可以综合离子液体、表面活性剂双水相体系的诸多优点，为生物活性物质的分离和萃取提供一种新型的绿色化介质体系，丰富双水相萃取技术内容。在新的双水相体系中，由于表面活性剂形成的胶束为生物分子提供了封闭的空间，在分离萃取过程中其中的生物活性物质不易发生聚集沉淀而失活，具有分离条件温和、操作简单等特点。

本发明所具有的优点还表现在：

1.使用最普通、表面活性高、成本低的商用阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠和绿色溶剂1-丁基-3甲基咪唑四氟硼酸盐配置绿色化双水相体系。其优点在于新体系能结合离子液体双水相和表面活性剂双水相的诸多优点，为生物活性物质的分离和提纯提供了一类新的双水相系统。在新的双水相体系中，由于表面活性剂形成的胶束为生物分子提供了封闭的空间，在分离萃取过程中其中的生物活性物质不易发生聚集沉淀而失活，具有分离条件温和、操作简单等特点。

2.离子液体+表面活性剂+水组成的双水相，表面活性剂的质量分数小、成相时间短、含水量高、离子液体和表面活性剂均可重复使用、具有低耗高效等特点，在萃取分离工程中是一种较为环保的新型萃取体系。

3.上述十二烷基苯磺酸钠+离子液体+水组成的双水相体系用于辣椒色素的萃取分离时，将在纯离子液体中几乎不溶的油溶性的辣椒色素，加入到下相为富离子液体相，上相为富表面活性剂的两相体系中后，辣椒色素94％全部萃取到下相，效果明显。而当把色素加到纯净的离子液体后几乎不溶，加入到表面活性剂溶液中后成为透明的红色溶液。该体系下相为富离子液体相，上相为富表面活性剂的两相体系中后。因此，本发明的双水相新体系为从天然植物中萃取辣椒色素提供了一个理想的萃取分离体系。

4.上述十二烷基苯磺酸钠+离子液体+水组成的双水相体系，温度越低双水相界面越清晰，出现最佳清晰界面的温度范围为2℃-48℃。

具体实施方式

下面结合实施例、实验例对本发明内容作进一步详述，但保护范围不仅限于此。

本发明的所用原料和试剂皆可从市场购买，所用1-丁基-3甲基咪唑四氟硼酸盐河南利华制药有限公司购买，纯度为99.9％，型号是174501-6-56。也可通过将市售N-甲基咪唑(临海市凯乐化工厂)和1-溴丁烷在氮气保护下反应生成1-丁基-3-甲基溴化盐[bmim]Br，产品经纯化和四氟硼酸钠直接反应生成1-丁基-3甲基咪唑四氟硼酸盐，产品用蒸馏水多次萃取，最后用旋转蒸发仪将水分除去，得到1-丁基-3甲基咪唑四氟硼酸盐纯品。实施例所使用的十二烷基苯磺酸钠为天津市富晨化学试剂公司产品，型号是3555-2003。

实施例  制备基于阴离子表面活性剂形成的双水相体系。

本发明基于阴离子表面活性剂形成的双水相体系所使用的制备方法，可以有两种方法：

方法一：根据杠杆规则，将三角形的三个顶点分别定为水、离子液体和十二烷基苯磺酸钠。在离子液体/十二烷基苯磺酸钠的一边，分别称取离子液体和表面活性剂质量比分别为1∶9，2∶8，3∶7，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3，8∶2和9∶1等不同比例的混合物1g，加入到10ml试管内，用涡轮搅拌器不断搅拌下向其中逐滴滴加二次蒸馏水，根据溶液清浊变化，观察样品的外观和分相情况，绘制粗略的三元相图。然后在近似双水相区域内精确配制50份含不同质量的1-丁基-3甲基咪唑四氟硼酸盐+十二烷基苯磺酸钠+水的样品，震荡、搅拌，置于室温(或10～30℃)的水浴中，恒温放置24h以上，根据分成两相的体系，精确判断形成的双水相区域。双水相形成的判断标准为：(1)两相内无浑浊或沉淀；(2)两相间存在清晰的界面。然后绘制准确的三元相图。在三元相图内绘出双水相区域。

方法二：将分别称取的质量分别为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8和0.9g的十二烷基苯磺酸钠装入10ml试管，然后分别加入0.9，0.8，0.7，0.6，0.5，0.4，0.3，0.2和0.1g的二次蒸馏水，涡轮搅拌器不断搅拌下向其中逐滴滴加上述1-丁基-3甲基咪唑四氟硼酸盐，用目测法根据溶液清浊变化，粗略绘制三元相图。然后根据方法一中描述的过程，在近似双水相区域内精确配制50份1-丁基-3甲基咪唑四氟硼酸盐+十二烷基苯磺酸钠+水的样品，震荡、搅拌，置于室温(或10～30℃)的水浴中，恒温放置24h以上，观察样品的外观和分相情况，以精确判断形成的双水相区域。

其中：方法一中形成双水相时加入水的质量约为总质量的59％，双水相消失时约为80％。方法二中出现双水相时的离子液体的质量约为总质量的10％，双水相消失时约为39％。

表1为根据三元相图得到的实施例1-14形成双水相区域的各组分质量百分数W％(g/g)。由此可知，本发明基于阴离子表面活性剂形成的双水相体系，由阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠、离子液体1-丁基-3甲基咪唑四氟硼酸盐和水构成。经过筛选，体系中各组分的质量百分含量为：阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠1.0-9.7％，离子液体1-丁基-3甲基咪唑四氟硼酸盐9.7-39.5％，水59.3-80.6％。

表1 形成双水相的各组分质量百分数W％(g/g)。

  实施例  阴离子表面活性剂  离子液体  水  1  2  1.0  2.0  39.0  25.5  60.0  72.5  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14  3.0  3.6  4.4  5.1  6.5  8.0  9.7  7.3  7.9  5.2  4.8  1.2  21.0  18.0  17.0  15.2  13.0  11.9  9.7  17.0  24.6  33.6  34.1  39.5  76.0  78.4  78.6  79.7  80.5  80.1  80.6  75.7  67.5  61.2  61.1  59.3

上述基于阴离子表面活性剂形成的双水相体系，在具体使用(在2℃-48℃的温度范围内均可应用)时，按照比例将三者混合，震荡，溶解，静置，分层，形成双水相体系。当体系中各组分的质量百分含量为：阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠1.0％，离子液体1-丁基-3甲基咪唑四氟硼酸盐39.0％，水60.0％(实施例1)；或体系中各组分的质量百分含量为：阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠9.7％，离子液体1-丁基-3甲基咪唑四氟硼酸盐9.7％，水80.6％(实施例9)，双水相体系的性能最佳。

实验例1 实施例1所得基于阴离子表面活性剂形成的双水相体系用于提取和纯化生物活性物质。根据配制双水相体系的总质量，用微量电子天平称取占总质量1.0％(g/g)的十二烷基苯磺酸钠，39％(g/g)的1-丁基-3甲基咪唑四氟硼酸盐和60.0％的二次蒸馏水，震荡并用涡轮搅拌器(上海精科仪器有限公司)搅拌均匀，用微量注射器将5-20μg的油溶性的甜椒色素注射到双水相中，震荡、搅拌，在温度低于48℃下恒温放置，30分钟后溶液分层。辣椒色素全部萃取到上相。该实例证实了该体系对辣椒色素的分离萃取是一种优良的萃取体系。

实验例2 实施例9所得基于阴离子表面活性剂形成的双水相体系用于提取和纯化生物活性物质。根据配制双水相体系的总质量，用微量电子天平称取占总质量9.7％(g/g)的十二烷基苯磺酸钠，9.7％(g/g)的1-丁基-3甲基咪唑四氟硼酸盐和80.6％的二次蒸馏水，震荡并用涡轮搅拌器(上海精科仪器有限公司)搅拌均匀，用微量注射器将5-20μg的油溶性的甜椒色素注射到双水相中，震荡、搅拌，在温度低于48℃下恒温放置，30分钟后溶液分层。辣椒色素全部萃取到下相。该实例证实了该体系对辣椒色素的分离萃取是一种优良的萃取体系。

应当指出的是，具体实施方式只是本发明比较有代表性的例子，显然本发明的技术方案不限于上述实施例。还可以有很多变形。本领域的普通技术人员，从此文件中所公开提到或是联想到的，均应认为是本专利所要保护的范围。