水样中硝基苯胺类污染物的固相萃取与HPLC-紫外检测方法

摘要

本发明公开了一种水样中硝基苯胺类污染物的固相萃取与HPLC-紫外检测方法，包括：将水样过滤，得到预处理后的水样；将固相萃取柱预先用甲醇活化后，再用NH4Cl-NH3缓冲液活化；将预处理后的水样在活化后的固相萃取柱上过柱，再以含乙腈和乙酸乙酯的水溶液净化洗去杂质，将柱子抽真空后，以含乙酸的甲醇溶液洗脱，所得洗脱液吹至近干，加乙酸铵水溶液定容，过滤后得到测试样品，进行HPLC-紫外检测，得到测试样品的色谱图，将色谱图上的峰面积在工作曲线上回归，计算测试样品中硝基苯胺类污染物的含量。该方法简单，利用常规仪器能同时检测五种目标化合物，且能应用于工业污水中硝基苯胺类同系物的分离检测。

说明书

技术领域

本发明涉及硝基苯胺类污染物的检测方法，具体涉及一种水样中硝基苯胺类污染物的固相萃取与HPLC-紫外(UVD)检测方法，属于环境监测技术领域。

背景技术

芳胺类化合物，包括苯胺及苯胺的各种衍生物，作为极为重要的中间体被广泛使用于偶氮染料、抗氧化剂、杀虫剂和农药等工业生产中。这些芳胺类化合物通常被认为是高度致畸和致癌的物质，在水环境中即使是微量也能对人体和水生物造成急性毒性作用。其中4-硝基苯胺，2，4-二硝基苯胺及2，6-二硝基苯胺等在我国已被列入环境优先污染物黑名单。因此，建立快速灵敏地检测环境样品中的硝基苯胺类物质含量的方法非常重要。

目前环境样品的前处理方法主要有液液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)、固相微萃取(SPME)和分散液相微萃取(DLLME)，然后用高效液相色谱分离，紫外检测器检测，也有用气相色谱/质谱(GC-MS)或毛细管电泳/电化学检测(CE-ED)。相较于LLE，SPE和SPME使用的有机溶剂量小，选择性好，是目前最为常用的前处理方法。高效液相色谱(HPLC)对于环境样品来说是高效且简便的分离方法，其他分离方法受各种条件限制，如毛细管电泳，经常需要极端的pH或需要加盐的缓冲液做流动相才能获得较为理想的分离效果。

因此，针对组分复杂的环境样品探索选择性检测芳胺类化合物的固相萃取与HPLC-紫外检测方法可实现环境样品中芳胺类化合物高效且简便的分离。

发明内容

本发明提供了一种水样中硝基苯胺类污染物的固相萃取与HPLC-紫外检测方法，采用常规分析仪器实现了对废水中硝基苯胺类污染物的痕量检测，能够满足环境样品检测的要求。

一种水样中硝基苯胺类污染物的固相萃取与HPLC-紫外检测方法，包括以下步骤：

(1)水样预处理：将水样过滤，得到预处理后的水样；

(2)固相萃取：将固相萃取柱预先用甲醇活化后，再用NH₄Cl-NH₃缓冲液活化，得到活化后的固相萃取柱；

将预处理后的水样在活化后的固相萃取柱上过柱，再以含乙腈和乙酸乙酯的水溶液净化洗去杂质，将柱子抽真空后，以乙酸的甲醇溶液洗脱，所得洗脱液吹至近干，加乙酸铵水溶液定容，过滤后得到测试样品，用于色谱检测；

(3)HPLC-紫外检测：采用TC-C18色谱柱，流动相为乙腈与水的混合溶液，色谱柱温度为30℃，紫外检测器波长为220nm～230nm，分析测试样品，得到测试样品的色谱图，将色谱图上的峰面积在工作曲线上回归，计算测试样品中硝基苯胺类污染物的含量。

固相萃取条件的选择：固相萃取条件优化中重要的一步就是洗脱液的选取，这直接影响到解析效果。在本发明中经初筛选后选取甲醇、乙醇、乙腈、正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷六种有机试剂中的一种或多种的混合物实验洗脱效果，在相同吸附条件下(如最佳吸附条件下)分别用6mL有机试剂进行洗脱，结果显示单组份洗脱液中甲醇的洗脱效果为最佳，含乙酸的甲醇能明显增强洗脱效果，其中乙酸体积百分浓度为0.3％的含乙酸的甲醇溶液对4-硝基苯胺、3-硝基苯胺洗脱效果良好，乙酸体积百分浓度为3％的含乙酸的甲醇溶液对其余三种硝基苯胺洗脱能达到要求。经实验筛选，选定乙酸的甲醇溶液作为固相萃取的洗脱液，优选乙酸体积百分含量为0.1％～0.5％的含乙酸的甲醇溶液和乙酸体积百分含量为1％～5％的含乙酸的甲醇溶液作为固相萃取的洗脱液，进一步优选乙酸体积百分含量为0.3％的含乙酸的甲醇溶液和乙酸体积百分含量为3％的含乙酸的甲醇溶液作为固相萃取的洗脱液。

经实验筛选，洗脱液体积在1mL～9mL能基本达到洗脱要求，优选2mL～8mL洗脱液，为了能基本达到完全洗脱效果进一步优选6mL洗脱液。

水样pH值能影响待测污染物在水中的存在形态，从而影响待测目标化合物在固相萃取柱上的吸附解吸效果。实验考察了pH值从1～11范围pH值变化对富集效果的影响，发现在pH值在弱酸性和接近中性(即pH值为5～7.1)时回收率较为理想，优选水样的pH值为6.9～7.1，可通过pH值为5～7.1的NH₄Cl-NH₃缓冲液来活化固相萃取柱，进而通过活化后固相萃取柱来调控检测时水样的pH，使待测目标化合物在固相萃取柱上保持较好的吸附解吸效果。

环境样品成分复杂，严重影响色谱分离和检测，而固相萃取柱只能选择性吸附极性相近或同类的离子，无法做到更具有选择针对性的吸附，因此洗脱之前的净化也是很重要的步骤。本发明经初筛选后选取各种质量百分浓度的正己烷水溶液、乙酸乙酯水溶液、乙腈水溶液、甲醇水溶液等中的一种或者多种以任意比例混合的混合溶液进行试验，发现乙酸乙酯和乙腈的混合水溶液对非待测目标化合物的洗脱能力最强，对样品的洗脱影响很小，即净化能力最好，而其余有机溶剂的净化能力较弱。故实验确定用含乙酸乙酯和乙腈的水溶液净化洗去杂质，优选用乙腈体积百分含量为5％～15％和乙酸乙酯体积百分含量为5％～15％的含乙酸乙酯和乙腈的水溶液，最优选用乙腈体积百分含量为10％和乙酸乙酯体积百分含量为10％的含乙酸乙酯和乙腈的水溶液。

HPLC色谱分离条件的选择：根据待测目标化合物的理化性质，初步筛选液相流动相由乙腈和水组成，在乙腈与水的体积比为20∶80～40∶60(即20～40∶60～80)时，乙腈比例增大对保留体积影响不大，待测目标化合物保留时间缩短，各物质保留时间间隔减小，综合考虑总出峰时间和时间间隔，优选乙腈与水的体积比为30∶70的流动相，以保证五种目标化合物能完全分离的时间小于25min。

HPLC-紫外检测中，液相流速对保留时间和保留体积的影响一致，随着流速增大保留时间缩短，保留体积减小。在流速为0.6mL/min～1.2mL/min范围测试，在流速为1mL/min时能更好的达到完全分离。

作为优选，水样中硝基苯胺类污染物的固相萃取与HPLC-紫外检测方法，包括以下步骤：

(1)水样预处理：取50mL～500mL的水样经过滤得到预处理后的水样；

(2)固相萃取：将固相萃取柱预先用3mL～7mL甲醇活化后，再用3mL～7mL pH＝5～7.1、0.1mol/L～0.3mol/L的NH₄Cl-NH₃缓冲液活化，得到活化后的固相萃取柱；

将预处理后的水样以2mL/min～6mL/min的速度在活化后的固相萃取柱上过柱，再用3mL～7mL乙腈体积百分浓度为5％～15％和乙酸乙酯体积百分浓度为5％～15％的含乙腈和乙酸乙酯的水溶液净化洗去杂质，将柱子抽真空5min～15min后，以1mL乙酸体积百分浓度为0.1％～0.5％的含乙酸的甲醇溶液洗脱1～3次后，再用1mL乙酸体积百分浓度为1％～5％的含乙酸的甲醇溶液洗脱2～6次，所得洗脱液吹干至0.1mL，加0.01mol/L乙酸铵水溶液定容至1.0mL，过滤后得到测试样品，用于色谱检测；

(3)HPLC-紫外检测：采用TC-C18色谱柱，流动相为乙腈与水体积比为20～40∶60～80的溶液，流速为0.8mL/min～1.2mL/min，色谱柱温度为30℃，紫外检测器波长为220nm～230nm，分析测试样品，得到测试样品的色谱图，将色谱图上的峰面积在工作曲线上回归，计算测试样品中硝基苯胺类污染物的含量。

最优选，所述的检测方法，具体包括以下步骤：

(1)水样预处理：取100mL的水样经过滤得到预处理后的水样；

(2)固相萃取：将固相萃取柱预先用5mL甲醇活化后，再用5mLpH＝6.9～7.1、0.2mol/L的NH₄Cl-NH₃缓冲液活化，得到活化后的固相萃取柱；

将预处理后的水样以4mL/min的速度在活化后的固相萃取柱上过柱，再用5mL乙腈体积百分浓度为10％和乙酸乙酯体积百分浓度为10％的含乙腈和乙酸乙酯的水溶液净化洗去杂质，将柱子抽真空10min后，以1mL乙酸体积百分浓度为0.3％的含乙酸的甲醇溶液洗脱2次后，再用1mL乙酸体积百分浓度为3％的含乙酸的甲醇溶液洗脱4次，所得洗脱液吹干至0.1mL，加0.01mol/L乙酸铵水溶液定容至1.0mL，过滤后得到测试样品，用于色谱检测；

(3)HPLC-紫外检测：采用TC-C18色谱柱，流动相为乙腈与水体积比为30∶70的溶液，流速为1.0mL/min，色谱柱温度为30℃，紫外检测器波长为225nm，分析测试样品，得到测试样品的色谱图，将色谱图上的峰面积在工作曲线上回归，计算测试样品中硝基苯胺类污染物的含量。

步骤(1)中，水样过滤时采用常规的过滤方法即可，例如先以中速定性滤纸过滤，再以0.45μm水膜过滤，除去水样中的固体杂质，得到预处理后的水样。

所述的硝基苯胺类污染物为2-硝基苯胺(2-NA)、3-硝基苯胺(3-NA)、4-硝基苯胺(4-NA)、2，4-二硝基苯胺(2，4-diNA)和/或2，6-二硝基苯胺(2，6-diNA)。

步骤(2)中，所述的固相萃取柱可选用本领域常用的固相萃取柱，优选HLB SPE柱，例如Waters公司生产的HLB SPE柱。

所述的NH₄Cl-缓冲液的配制：将NH₄Cl溶于水中，用氨水调节至所需pH值即可。

线性范围的确定：按照本领域常用的工作曲线绘制方法，取2-硝基苯胺、3-硝基苯胺、4-硝基苯胺、2，4-二硝基苯胺、2，6-二硝基苯胺标准品，分别用水溶解配制成各硝基苯胺浓度均为2.0×10^-3mol/L的储备液，逐级稀释成一系列由低浓度到高浓度的标准溶液。标样的逐级稀释可按10倍的梯度往低浓度稀释，比如取10mL的贮备液，稀释到100mL，得到浓度为2.0×10^-4mol/L的标样；再取10mL 2.0×10^-4mol/L的标样稀释到100mL，得到浓度为2.0×10^-5mol/L的标样，依次逐级稀释到2.0×10^-7mol/L的标样为止。用HPLC-紫外检测各不同浓度的标样，得到各不同浓度的标样的色谱图，根据色谱图的峰面积与标样浓度的关系绘制工作曲线(即线性方程)，确定线性范围，结果见表1。

检测限的确定：配制上述5种硝基苯胺浓度均为5.0×10^-7mol/L的混合液标样，连续进样测定11次，按照相对检测限的计算公式(3s/x)×c进行计算，得到检测限。s表示由标样11次测得的色谱峰面积计算得到的标准偏差，x表示11次测得的色谱峰面积的平均值，c表示选定的标样的浓度，即为5.0×10^-7mol/L，结果见表1。

表1线性范围与检测限

  组分  线性范围(mol/L)  线性方程(x：×10^-6mol/L)  检测限(mol/L)  2-硝基苯胺  2.0×10^-7～5.0×10^-5  y＝12.256x(R²＝0.9983)  2×10^-7  3-硝基苯胺  2.0×10^-7～5.0×10^-5  y＝10.789x(R²＝0.9985)  2×10^-7  4-硝基苯胺  5.0×10^-7～5.0×10^-5  y＝3.8447x(R²＝0.9857)  5×10^-7  2，4-二硝基苯胺  5.0×10^-7～5.0×10^-5  y＝3.835x(R²＝0.9986)  5×10^-7  2，6-二硝基苯胺  2.0×10^-7～5.0×10^-5  y＝11.288x(R²＝0.9950)  2×10^-7

本发明所用的试剂均选用分析纯，所用的水均选用超纯水(由优普超纯水器制备得到)。

本发明具有以下有益效果：

本发明选择了合适的固相萃取柱，并试验得到了合适的固相萃取的活化条件、净化条件与洗脱条件，使水样的浓缩倍数达到100以上，在本发明适宜的条件下，固相萃取不但浓缩了待测物，同时净化了样品中的基体干扰，有利于水环境样品的测定。

本发明针对待检测的目标污染物2-硝基苯胺、3-硝基苯胺、4-硝基苯胺、2，4-二硝基苯胺和2，6-二硝基苯胺，建立了高效、稳定的富集和分离方法，能同时检测五种目标化合物，且能应用于工业污水中硝基苯胺类同系物的分离检测。

附图说明

图1为实施例1中标样的HPLC-紫外检测色谱示意图；

图2为实施例1中加各硝基苯胺标准品后的杭州市四堡污水处理厂二沉池水样的HPLC-紫外检测色谱示意图；

图1～图2中，1，2，3，4，5分别代表4-硝基苯胺、3-硝基苯胺、2-硝基苯胺、2，4-二硝基苯胺、2，6-二硝基苯胺。

具体实施方式

实施例1

水样预处理：取经加各硝基苯胺标准品后的杭州市四堡污水处理厂二沉池水样100mL(各硝基苯胺浓度均为5.0×10^-8mol/L)，水样先以中速定性滤纸过滤，再以0.45μm水膜过滤，得到预处理后的水样；

固相萃取：以Waters公司生产的HLB SPE柱作为固相萃取柱，将固相萃取柱预先用5mL甲醇活化，再用5mLpH＝7.0、0.2mol/L的NH₄Cl-NH₃缓冲液活化，得到活化后的固相萃取柱；

将预处理后的水样以4mL/min的速度在活化后的固相萃取柱上过柱，然后以5mL乙腈体积百分浓度为5％和乙酸乙酯体积百分浓度为10％的含乙腈和乙酸乙酯的水溶液净化洗去杂质，将柱子抽真空约10min，最后以1mL乙酸体积百分浓度为0.3％的含乙酸的甲醇溶液洗脱2次后，再用1mL乙酸体积百分浓度为3％的含乙酸的甲醇溶液洗脱4次，所得洗脱液吹干至约0.1mL，加0.01mol/L乙酸铵水溶液定容至1.0mL，0.45μm水膜过滤后，得到测试样品，用于色谱检测。

2-硝基苯胺、3-硝基苯胺、4-硝基苯胺、2，4-二硝基苯胺、2，6-二硝基苯胺标样的配制：

取2-硝基苯胺、3-硝基苯胺、4-硝基苯胺、2，4-二硝基苯胺、2，6-二硝基苯胺标准品，用超纯水溶解，配制成2-硝基苯胺、3-硝基苯胺、4-硝基苯胺、2，4-二硝基苯胺、2，6-二硝基苯胺浓度均为2.0×10^-3mol/L的贮备液，避光保存。使用时逐级稀释至所需浓度，得到一系列从低浓度到高浓度的标样。标样的逐级稀释是按10倍的梯度往低浓度稀释的，取10mL的贮备液，稀释到100mL，得到浓度为2.0×10^-4mol/L的标样，再取10mL1.0×10^-4mol/L的标样稀释到100mL，得到浓度为2.0×10^-5mol/L的标样，依次逐级稀释到2.0×10^-7mol/L的标样为止。

HPLC-紫外检测：采用TC-C18色谱柱(5μm，4.6×250mm，美国Agilent公司)，流动相为乙腈与水体积比为30∶70的溶液，流速为1mL/min，色谱柱温度为30℃，紫外检测器波长为225nm，进样量20μL。

按上述固相萃取和HPLC-紫外检测方法测试分析标样和测试样品，分别得到各标样的色谱图以及测试样品的色谱图，见附图1，2。根据各标样色谱图的峰面积与相应的标样浓度的关系绘制工作曲线，将从测试样品色谱图上得到的峰面积在工作曲线上回归，计算测试样品中2-硝基苯胺、3-硝基苯胺、4-硝基苯胺、2，4-二硝基苯胺、2，6-二硝基苯胺的浓度。检测结果见表2，每个样品平行测定5次，结果取平均值。

表2加各硝基苯胺标准品后的污水样品测定结果

  组分  加入量  (10^-6mol/L)  测得的平均值  (10^-6mol/L)  回收率  (％)  相对标准偏差  (％，n＝5)  2-硝基苯胺  5.0  4.23  84.5  1.2  3-硝基苯胺  5.0  4.70  94.1  3.9  4-硝基苯胺  5.0  4.40  88.1  2.1  2，4-二硝基苯胺  5.0  4.37  87.3  4.7

  组分  加入量  (10^-6mol/L)  测得的平均值  (10^-6mol/L)  回收率  (％)  相对标准偏差  (％，n＝5)  2，6-二硝基苯胺  5.0  4.22  84.4  2.3

从表2看出：回收率都在84.4％～94.1％之间，RSD也都在4.7％以内，表明本发明方法抗干扰能力强，在河水复杂的基体中也能较准确地测定目标化合物。

实施例2

水样预处理：取经加加各硝基苯胺标准品后的杭州市贴沙河水样100mL(各硝基苯胺浓度均为5.0×10^-8mol/L)，水样先以中速定性滤纸过滤，再以0.45μm水膜过滤，得到预处理后的水样；

固相萃取：以Waters公司生产的HLB SPE柱作为固相萃取柱，将固相萃取柱预先用5mL甲醇活化，再用5mLpH＝7.0、0.2mol/L的NH₄Cl-NH₃缓冲液活化，得到活化后的固相萃取柱；

将预处理后的水样以约4mL/min的速度过柱，然后以5mL乙腈体积百分浓度为10％和乙酸乙酯体积百分浓度为10％的含乙腈和乙酸乙酯的水溶液净化洗去杂质，将柱子抽真空约10min，最后以1mL乙酸体积百分浓度为0.3％的含乙酸的甲醇溶液洗脱2次后，再用1mL乙酸体积百分浓度为3％的含乙酸的甲醇溶液洗脱4次，所得洗脱液吹干至约0.1mL，加0.01mol/L乙酸铵水溶液定容至1.0mL，0.45μm水膜过滤后，得到测试样品，用于色谱检测。

标样的配制和HPLC-紫外检测的操作同实施例1。

按上述固相萃取和HPLC-紫外检测方法测试分析标样和测试样品，分别得到各标样的色谱图以及测试样品的色谱图。根据标样色谱图的峰面积与相应的标样浓度的关系绘制工作曲线，将从测试样品色谱图上得到的峰面积在工作曲线上回归，计算测试样品中2-硝基苯胺、3-硝基苯胺、4-硝基苯胺、2，4-二硝基苯胺、2，6-二硝基苯胺的浓度。检测结果见表3，每个样品平行测定5次，结果取平均值。

表3加各硝基苯胺标准品后的河水样品测定结果

  组分  加入量  (10^-6mol/L)  测得的平均值  (10^-6mol/L)  回收率  (％)  相对标准偏差  (％，n＝5)  2-硝基苯胺  5.0  4.93  98.6  3.9  3-硝基苯胺  5.0  4.34  86.9  4.4  4-硝基苯胺  5.0  5.13  102.7  1.6

  组分  加入量  (10^-6mol/L)  测得的平均值  (10^-6mol/L)  回收率  (％)  相对标准偏差  (％，n＝5)  2，4-二硝基苯胺  5.0  5.09  101.9  4.4  2，6-二硝基苯胺  5.0  4.39  87.8  3.0

从表3看出：回收率都在86.9％～102.7％之间，RSD也都在4.4％以内，表明本发明方法抗干扰能力强，在河水复杂的基体中也能较准确地测定目标化合物。