药物肝毒性评价用多糖复合支架灌流式肝细胞反应器系统

摘要

一种药物肝毒性评价用多糖复合支架灌流式肝细胞反应器系统。反应器系统的构成包括：多糖复合支架固定化床反应器，反应器的上接口连接消泡器，消泡器通过接入口同时连接灌流培养液和细胞接种器；反应器的下接口通过管路和蠕动泵接入储液池，储液池再通过管路和调节阀接入消泡器，形成灌流培养液循环回路。本发明利用果胶与海藻酸盐复合制备三维多孔细胞培养支架设计制作了小型灌流式细胞反应器系统，改善了细胞-基质及细胞-细胞间的相互作用，通过消泡器稀释接种细胞，使细胞均匀分布于反应器中的三维多孔支架内，实现了操作简便的反应器内细胞三维动态接种；显著提高了体外培养肝细胞的生理功能及药物肝毒性表达水平。

说明书

【技术领域】：本发明涉及一种以三维果胶/海藻酸复合多孔支架为载体的小型肝细胞反应器系统，用于实现体外肝细胞高密度培养并促进培养肝细胞的药物肝毒性表达。

【背景技术】：细胞生物反应器系统可为培养的细胞、组织等生物活性物质提供三维动态微环境，通过体外调控培养环境中力学、生物及化学等信号因素，改善物质交换、模拟体内生理条件，促进实现细胞的三维功能化培养。鉴于肝脏是人体内最大的实现物质与能量交换器官，其具有复杂的细胞与细胞外基质组成，以及复杂的血管、胆管结构，肝细胞生物反应器已成为体外三维高密度培养肝细胞、诱导功能化肝组织再建的重要手段。研究新型肝细胞反应器系统并开发其在肝组织工程领域的应用研究已成为当今的研究热点^[1，2]。

近年来，肝组织工程研究领域先后出现了如下几种形式的反应器。①转瓶式反应器，其通过培养装置中的玻璃或磁力搅拌子转动而改善体系中的物质交换，设备简单、易操作，但培养液易产生涡流而影响细胞生长^[3]；②旋转培养管壁式反应器，可将培养组织细胞置于装满培养液的培养罐内，驱动培养罐沿水平轴转动，转速适宜时可使细胞组织移动产生的向心力与重力平衡，达到微重力培养效果，其减少破坏性应力产生、促进物质交换，但设备及无菌操作复杂，尚处基础研究^[4]；③中空纤维细胞反应器，由具有选择透过性的半透膜中空纤维构成，纤维内外腔分别为细胞和培养液，增加了细胞培养面积、容积，提高细胞培养密度，改善体系的物质交换，也是当前生物人工肝脏的主要反应器形式，但由于细胞腔内细胞的机械堆积，缺少良好的细胞-细胞、细胞-细胞外基质间的相互作用，细胞的长期生物学活性维持还有待进一步提高^[5]；④固定化床灌流式反应器，全部培养液将缓慢通过三维支架材料，可促进体系内细胞与培养液间的物质交换，并可通过调节流速适当调整流体力学信号刺激，但目前的多数此类反应器均面临细胞无法均匀灌注、因三维支架材料缺乏肝细胞特异亲和性导致细胞形态及功能无法长期维持的困难^[6]。

特别是近年来，在药物研发过程中，伴随对潜在药物靶点、内源性配体和底物的化学结构的认识，研究人员为新药提供了大量可筛选前体。传统的动物体内试验耗费大量人力财力，实验周期长，体外培养肝细胞已开始用于药物筛选^[7，8]。小型肝细胞生物反应器具有可减少肝细胞及被检测药物用量，并实现高通量筛选等特点，在药物肝毒性评价中的应用也越来越引起不同领域研究者的关注。目前小型肝细胞生物反应器主要集中在传统生物反应器的规模缩小上^[9，10]。

纵观肝细胞生物反应器的发展，各种肝细胞生物反应器都试图以不同的形式营造一个与体内近似的环境，以利于体外肝组织结构重建，实现体外功能化肝组织的构建及肝功能的替代。目前的研究结果均表明，肝细胞生物反应器普遍存在反应器内细胞三维均匀分布、肝组织结构诱导重建和细胞培养物回收利用等瓶颈问题还没有得到很好的解决。

【发明内容】：本发明目的是克服现有技术存在的上述不足，提供一种药物肝毒性评价用多糖复合支架灌流型肝细胞反应器系统。

本发明针对当前肝细胞反应器系统细胞活性差、操作复杂、实验成本高等缺点，利用果胶与海藻酸复合制备的三维多孔支架设计制作了小型灌流式细胞反应器系统，改善了细胞-基质及细胞-细胞间的相互作用，并通过消泡器稀释接种细胞，实现了操作简便的反应器内细胞三维动态接种；显著提高了体外培养肝细胞的生理功能及药物肝毒性表达水平。

本发明提供的药物肝毒性评价用多糖复合支架灌流型肝细胞反应器系统的构成包括：多糖复合支架固定化床反应器，反应器的上接口连接消泡器，消泡器通过接入口同时连接灌流培养液和细胞接种器；反应器的下接口通过管路和蠕动泵接入储液池，储液池再通过管路和调节阀接入消泡器，形成灌流培养液循环回路。

所述反应器中的固化床由三维多孔细胞培养支架制成，三维多孔细胞培养支架选用主链含半乳糖基团的天然多糖果胶与海藻酸钠为支架材料，通过冷冻干燥和多价阳离子交联制成。其中的天然多糖果胶与海藻酸钠的质量比是1∶(0.5～5)。

所述的三维多孔细胞培养支架中的天然多糖果胶与海藻酸钠的总重量体积百分浓度为1～3％。

所述的多价阳离子可以是钙、铜、钡、镁、铁、锰离子。

所述的多糖复合支架固定化床反应器底座采用商用滤膜过滤器底座，其与内外密封环实现了反应器内三维多孔支架的固定及培养液均匀分布。

本发明的优点和积极效果：

一，本发明在消泡器上开有接入口用于连接细胞接种器，接种细胞注入消泡器，其首先经灌流培养液稀释并迅速进入反应器，实现了操作简便的反应器内细胞三维动态接种，结果表明细胞可均匀分布于反应器内的三维多孔支架内。

二，本发明通过支架材料果胶中半乳糖基团与肝实质细胞表面脱唾液酸糖蛋白受体的特异性受体-配体相互作用，提高支架内细胞的接种密度，并改善细胞-基质间相互作用，进而促进细胞聚集形成细胞聚集体，改善细胞的尿素合成、肝毒性表达等肝细胞功能；同时海藻酸钠与果胶的复合显著提高了支架的力学性能。本发明首次报道使用果胶/海藻酸盐复合支架实现肝细胞的三维动态培养。

三，本发明中所涉及的主要部件均为透明可高温高压灭菌材料，易于操作和观察，可重复使用，大大降低了实验成本，利用本发明的肝细胞反应器体系考察了对乙酰氨基酚的药物毒性，建立了简易药物肝毒性评价用肝细胞模型。

【附图说明】：

图1是药物肝毒性评价用多糖复合支架灌流式肝细胞反应器结构示意图；

图2是相差显微镜观察反应器内海藻酸盐(A)和果胶/海藻酸盐复合支架(B)中肝细胞形态；

图3是细胞接种方法对三维动态培养肝细胞尿素合成功能的影响；

图4是本发明反应器动态培养肝细胞的尿素合成功能显著高于静态培养；

图5是MTT法检测本发明反应器动态培养肝细胞的对乙酰氨基酚的肝毒性评价。

图1中，1接种器、2消泡器、3反应器、3-1内密封圈、3-2三维多孔多糖复合细胞支架、3-3外密封圈、4储液池、5蠕动泵、6调节阀。

【具体实施方式】：

实施例1：

如图1所示，本发明提供的药物肝毒性评价用多糖复合支架灌流型肝细胞反应器系统的构成包括：反应器3，反应器3的上接口连接消泡器2，消泡器通过上方的接入口同时连接灌流培养液和细胞接种器1，接种细胞注入消泡器2后，首先经灌流培养液稀释并迅速进入反应器3中，实现了操作简便的反应器内细胞三维动态接种；反应器3的下接口通过管路和蠕动泵5接入储液池4，储液池4再通过管路和调节阀6接入消泡器2，形成灌流培养液循环回路。

本发明反应器底座采用商用滤膜过滤器底座，其与增加的内外密封环实现了反应器内液体的均匀分布和反应器密闭；反应器上接口处连接的消泡器同时与灌流培养液和细胞接种器连接；整个系统组成部件均可高温高压灭菌，并通过硅胶管连接成循环系统，置于二氧化碳培养箱中使用。

实施例2：

本发明反应器的具体构成如实施例1，所述反应器3中的固化床由三维多孔细胞培养支架构成，三维多孔细胞培养支架选用主链含半乳糖基团的天然多糖果胶与海藻酸钠为支架材料，通过冷冻干燥和二价阳离子交联制成。本发明以三维多孔细胞培养支架为固化床设计制作了可并联的容积为5毫升的小型固化床灌流式肝细胞反应器系统(图1)。

其中的天然多糖果胶与海藻酸钠的质量比和其总重量百分比浓度如表1所列数值时，经-20℃冷冻干燥和二价阳离子钙交联，制得支架孔径均在150-220μm范围，孔隙率在90％以上，果胶与海藻酸钠的质量比和总重量百分比浓度对所制支架结构及理化性能影响均无显著性差异；其用于肝细胞三维培养，结果显示支架内细胞黏附率显著提高，动态细胞接种率高于75％，反应器内动态培养24小时观察结果显示支架内大部分肝细胞形成了细胞聚集体(图2)。

表1是多糖复合三维多孔支架制备条件

  支架  1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  果胶与海藻酸钠质量比  2∶1  1∶1  1∶3  1∶5  2∶1  1∶1  1∶3  1∶5  2∶1  1∶1  1∶3  1∶5  果胶海藻酸钠重量  体积百分浓度  1  1  1  1  2  2  2  2  3  3  3  3

实施例3：

本发明中以实施例2中制备的三维多孔细胞培养支架为固化床制得的细胞反应器系统(图1)分别用于动静态细胞接种后续动态培养实验，对作为体外培养肝细胞的肝功能表达指标之一的尿素合成功能的考察结果显示：比较静态细胞接种，动态恒流速(2ml/min)细胞接种后续动态培养的肝细胞尿素合成功能显著升高(图3)；且该反应器动态培养肝细胞的尿素合成功能约为三维静态培养的2.5倍(图4)。

实施例4：

将本发明设计制作的小型肝细胞反应器系统用于乙酰氨基酚的药物肝毒性考察，即培养液中添加0uM，5uM，10uM浓度的对乙酰氨基酚，灌流培养24小时后，以MTT检测肝细胞的活性。结果表明：与传统的二维胶原、三维支架静态培养相比，本发明的反应器动态培养体系能够显著提高肝细胞对前毒性药物对乙酰氨基酚的敏感性(图5)。

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