以显色剂为样品载体并可重复加样的免疫层析法及装置

摘要

本发明公开了一种以显色剂为样品载体并可重复加样的免疫层析法及装置，方法包括：1)按常规法制备试剂条；2)按照常规方法制备显色剂，并将待测样品对应的抗原/抗体与显色剂混合，形成显色剂混合物；3)加入50μl～5ml的显色剂混合物于显色剂加样区；4)当显色剂进入硝酸纤维膜的加样区域时，于加样区加入5μl～100μl待测样品，在1～30分钟内判读结果，在此期间可以重复加样。与其他常规方法相比，由于本发明中显色剂较样品先一步进入硝酸纤维膜并有其持续的跟进供应，从而产生的动力学效果使本发明具有每次样品用量少、判读时间缩短、单位时间内的灵敏度高、反应后硝酸纤维膜的背景干净等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种免疫层析法，特别是涉及一种以显色剂为样品载体并可重复加样的免疫层析法及装置。

背景技术

在刚过去的半个世纪里，大多数的免疫检测需要昂贵分析设备和仪器，并且要专业人员操作检测。虽然这些昂贵的检测方法具有很高的灵敏度和特异性，但却因为昂贵、不方便携带、专业性等原因，而无法满足人们健康保障的日常需求。

胶体金免疫层析(GICA)技术是20世纪90年代初在免疫渗滤技术基础上建立的一种简易快速的免疫学检测技术，由Beggs等最先用于人绒毛膜促性腺激素(HCG)的测定。GICA是以硝酸纤维素膜(NC膜)为载体，利用微孔膜的毛细管作用，使滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，如同层析一般。免疫金复合物干片粘连在近NC膜条下端(c)，膜条测试区(t)包有特异抗体，当试纸条下端进入液体标本样中，下端吸水材料吸取液体向上端移动，流经c处时，使干片上的免疫金复合物复溶，并带动其向膜条渗移，若标本有特异性抗原时，可与免疫金复合物的抗体结合，形成的金标抗原-抗体复合物流至测试区，被固相抗体所捕获，形成抗体-抗原-金标抗体复合物，在膜上t处出现红色控制线。胶体金可以以乳胶和荧光等显色剂代替。

现有市面上大多的免疫层析法的产品，其中一种方法是采用冻干的显色剂片，测试时，将一定量的待测样品加于试纸条末端，待测液体会由于毛细作用向吸水纸方向移动，经过冻干的显色剂片处，使之复溶，并产生免疫反应，形成抗体-抗原复合物，一起进入硝酸纤维膜后，于膜上包被有的抗体/抗原进行反应并产生肉眼可见的结果。这种方法操作简便，但由于采用冻干的显色剂片，对于储存有一定的要求，必须要储存在密封性良好的铝箔袋中，且一旦打开受潮即丧失功效。另外由于加入的待测样品要起到复溶冻干显色剂和带动复合物在固相膜上移动的作用，样品用量会比较大。

而现有的小部分不采用冻干显色剂片方法进行测试的，进行测试的方法可以是先加显色剂，采用样品带动显色剂移动(该方法和采用冻干方法是类似的，只是显色剂为液态状态)；另一种为将样品先加于固相薄膜上，等样品流经反应区域后，再加入足量的显色剂，从而发生显色反应。后一种方法可参考申请号为200510027710.4的专利申请。前一种方法依然需要使用较大量的样品。后一种方法样品量较前一种略少，但由于样品直接先加于固相膜上，由于固相膜的吸附作用，其样品的有效使用率一定会有所下降，对反应的灵敏度也会产生一定的影响。另外，由于显色剂被加在样品之后，其流经反应区需时较长，因而显色反应的发生也较缓慢。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种以显色剂为样品载体并可重复加样的免疫层析法及其装置。该方法及其装置与上述方法相比，可提高测试效率(即在单位时间内和以特定检测试剂量用更少样品量达到更高灵敏度)并可重复加样。本发明的方法在原有的层析方法的基础上，通过显色剂较样品先一步进入硝酸纤维膜并携带样品进入反应区，使样品的用量减少，判读的时间缩短，单位时间内的灵敏度提高，并且使重复加样以提高灵敏度的方案可行。

为解决上述的技术问题，本发明的以显色剂为样品载体并可重复加样的免疫层析法，步骤包括：

(1)按常规方法制备试剂条

该试剂条由背衬(塑料板或硬化板)、硝酸纤维膜、吸水纸和玻璃纤维膜组成，硝酸纤维膜上按层析方向依次由加样区、测试区和质控区组成，加样区与一玻璃纤维膜通过略微重叠而相接，测试区上包被待测样品对应的抗原/抗体，质控区包被有相应待测样品的质控试剂(包括蛋白、抗原、抗体等)，玻璃纤维膜上有显色剂加样区；

(2)按照常规方法制备显色剂，并以一定比例将待测样品对应的抗原/抗体与显色剂混合，形成显色剂混合物；

(3)加入50μl～5ml的显色剂混合物于试剂条的显色剂加样区；

(4)当显色剂进入硝酸纤维膜的加样区域时，于加样区显色剂后加入5μl～100μl待测样品，在1～30分钟内判读结果，在此期间，如有需要可以重复加样。

所述步骤(2)中的显色剂是液体状态的显色剂，包括胶体金、乳胶或荧光等，该显色剂中含有一定量的洗涤剂和/或封闭剂，该洗涤剂、封闭剂是常规的洗涤剂、封闭剂，如吐温-20、聚乙二醇、通常用量为0.1％～10％(体积百分比)，其中，显色剂混合物中待测样品对应的抗原/抗体的浓度为0.001mg/ml～100mg/ml。

通常来说，硝酸纤维膜测试区中包被待测样品对应的抗原/抗体的浓度为0.001mg/ml～100mg/ml，质控区中包被与相应待测样品相对应的抗原/抗体、蛋白或能与显色剂混合物起反应的相应制剂，质控试剂的浓度为0.001mg/ml～100mg/ml。

另外，本发明的以显色剂为样品载体并可重复加样的免疫层析法中的用于装试剂条的装置，如图3所示，该装置为塑料壳，塑料壳表面按照试剂条的层析方向依次有加显色剂孔、加样孔、测试区和质控区的反应窗口。

本发明中由于显色剂较样品先一步进入硝酸纤维膜之上，起到一定的承载作用，样品随着显色剂的流动而流动，产生动力学效果，会加快样品的流动速度，并且由于显色剂的承载作用，溶液样品直接与固相硝酸纤维膜的接触大为减少，所以，其在固相膜上的损耗必定会减少，样品的使用量较现有的方法少很多。由于样品与固相膜直接接触的量减少以及胶体金本身含有洗涤剂和封闭剂，而胶体金先一步进入固相膜，其中含有的成分使试条膜上的背景得以有效降低，结果显示更清晰。而且由于在该发明下，反应的发生并不是一步接着一步进行，而是呈现动力学效果，即反应在判读时间段内为持续发生的，如此以来即使操作人员在反应已经开始后，发现反应是由于样品量不够无法发生的，也可以通过继续加入样品使反应继续进行，因此，与现有市面上的其他产品所用方法相比较，本发明的方法具有以下优点：

1)样品用量减少或可以重复加样；

2)判读时间缩短；

3)单位时间内的灵敏度提高；

4)反应后硝酸纤维膜的背景干净。

附图说明

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：

图1是本发明的试剂条结构图；

图2是本发明操作过程的演示图，其中，1-样品检测用的试剂条，C-是质控区，T-测试区，2-先加显色剂，3-当显色剂进入加样区后，于加样区再加样品，4-进行免疫层析反应，5-反应后的试剂条；

图3是本发明中用于装试剂条的外壳装置，其中S区域对应试剂条上的加样区，C和T分别对应质控区和测试区，R为加显色剂的区域；

图4是实施例1的实验结果图，a-原方法，b-本发明的方法；

图5是实施例2的实验结果图，a-原方法，b-本发明的方法；

图6是实施例3的实验结果图，a-原方法，b-本发明的方法；

图7是实施例4的实验结果图，a-原方法，b-本发明的方法；

图8是实施例5的实验结果图，a-原方法，b-本发明的方法。

具体实施方式

以下实施例中，试剂条按照常规制备，其由塑料板背衬、硝酸纤维膜、吸水纸和玻璃纤维膜组成(如图2中的1所示)，硝酸纤维膜上按层析方向依次有加样区、测试区和质控区组成，加样区紧挨玻璃纤维膜，玻璃纤维膜上有加显色剂区。

原方法：样品、显色剂混合物的加样次序为：1)加样品于硝酸纤维膜上的加样区；2)待样品经过测试区后，加显色剂混合物于加样区后的加显色剂区，其它按照一般免疫层析方法操作。

本发明的方法：1)加显色剂混合物于加样区后的加显色剂区；2)当显色剂进入加样区后，加样品于加样区，其它按照一般免疫层析方法操作。

另外，实施例中的显色剂中都含0.5％的吐温-20作为洗涤剂，显色剂胶体金按常规的柠檬酸三钠还原法制备，粒径在1～150nm。

实施例1原方法与本发明的方法检测HCV(丙型肝炎病毒)抗体

本实施例中，采用相同量的样品、试剂条相同，均为5mm宽，按照一般方法制作，同时对比原方法与本发明的方法检测HCV抗体。

其中，在质控区包被1mg/ml的SPA(重组金黄色葡萄球菌蛋白A)，用量0.5μl/试剂条，包被呈线状。在测试区包被0.5mg/ml的HCV抗原，用量0.5μl/试剂条，包被呈线状。显色剂混合物：采用与SPA结合的胶体金液体制剂(1mg/ml SPA∶胶体金的体积比是1∶500)。

原方法与本发明的方法使用的样品均为5μl HCV临界阳性样品(浓度大约为0.00001mg/ml)，使用的胶体金制剂均为100μl。测试计时均为15分钟。唯一不同的是上述的加样与加胶体金制剂的顺序。

结果如图4所示，原方法在15分钟内没有检测到HCV抗体，而本发明的方法能检测到HCV抗体。由此可知，本发明的方法在采用相同样品量的条件下，其单位时间内的灵敏度有所提升，且相对来说，为检测到HCV抗体，本发明的方法可使样品用量减少。

实施例2可重复加样的实施例

本实施例中，继续以测试HCV为例，其试剂条、测试区、质控区、显色剂混合物(胶体金制剂)、试剂条宽度、样品与实施例1相同。

原方法：于硝酸纤维膜上加5μl HCV临界样品(浓度大约为0.00001mg/ml)，等样品跑过测试区后，于玻璃纤维上加入100μl的胶体金制剂。1分钟后，加入5μl样品，其后每隔1分钟，加样5μl，重复两次，即共加样20μl。共计时30分钟，判读结果。

本发明的方法：于玻璃纤维上加入100μl的胶体金制剂，等胶体金跑出玻璃纤维，进入加样区，于加样区加入5μl HCV临界样品(浓度大约为0.00001mg/ml)。1分钟后，加入5μl样品，其后每隔1分钟，加样5μl，重复两次，即共加样20μl。共计时30分钟，判读结果。

结果如图5所示，原方法没有检测到HCV抗体，而本发明的方法能检测到HCV抗体，且由于样品量的增大，比实施例1中的所采用的本发明方法所得结果更为明显。由此可知，原方法一旦加入所有的试剂后，反应即结束，重复加样对于反应的实现没有任何帮助。而本发明的方法，可以在判读时间结束之前的任何时间重复加入样品，以帮助反应的实现。如此可以帮助实验人员有效的确认反应所需的最佳样品用量。

实施例3荧光测试艾滋病毒(HIV)

采用相同量的样品，同样的时间同时对比原方法和本发明的方法检测HIV抗体。其中，试剂条相同，按照一般方法制作，质控区包被1mg/ml的SPA(重组金黄色葡萄球菌蛋白A)，用量0.5μl/条。测试区包被0.1mg/ml的HCV抗原，用量0.5μl/条。试剂条宽度为5mm。显色剂混合物：采用与SPA结合的异硫氰酸荧光素(FITC)制剂(1mg/mlSPA∶FITC的体积比是1∶500)。

原方法：于硝酸纤维膜上加5μl HIV临界样品(浓度大约为0.000005mg/ml)，等样品跑过测试区后，于玻璃纤维上加入100μl的FITC(异硫氰酸荧光素)制剂。计时15分钟，于520nm波长的紫外下判读结果。

本发明的方法：于玻璃纤维上加入100μl的FITC制剂，等荧光制剂跑出玻璃纤维，进入加样区，于加样区FITC制剂之后加入5μl HIV临界样品(浓度大约为0.000005mg/ml)，计时15分钟，于520nm波长的紫外下判读结果。

结果如图6所示，原方法没有检测到HIV抗体，而本发明的方法能检测到HIV抗体。

实施例4乳胶测试Toxo抗体(弓形虫)

采用相同量的样品，同样的时间同时对比原方法和本发明的方法检测Toxo抗体(弓形虫)。其中，试剂条相同，按照一般方法制作，质控区包被5mg/ml的SPA(重组金黄色葡萄球菌蛋白A)，用量1.5μl/条。在测试区包被1mg/ml的Toxo抗原，用量1.5μl/条。试剂条宽度为13mm。显色剂混合物：采用与SPA结合的蓝色乳胶制剂(10mg/ml SPA∶蓝色乳胶的体积比是1∶500)。

原方法：于硝酸纤维膜上加15μl Toxo临界样品(浓度大约为0.00005mg/ml)，等样品跑过测试区后，于玻璃纤维上加入300μl的蓝色乳胶制剂。计时15分钟，判读结果。

本发明的方法：于玻璃纤维上加入300μl的蓝色乳胶制剂，等蓝色乳胶制剂跑出玻璃纤维，进入加样区，于加样区蓝色乳胶制剂之后加入15μl HIV临界样品(浓度大约为0.00005mg/ml)，计时15分钟，判读结果。

结果如图7所示，原方法没有检测到Toxo抗体，而本发明的方法能检测到Toxo抗体。

实施例5原方法与本发明方法的背景比较

采用相同量的样品，同样的时间同时对比原方法和本发明方法检测HCV抗体。其中，试剂条相同，按照一般方法制作，在质控区包被1mg/ml的SPA(重组金黄色葡萄球菌蛋白A)，用量0.5μl/条。测试区包被0.5mg/ml的HCV抗原，用量0.5μl/条。试剂条宽度为5mm。显色剂混合物：采用与SPA结合的胶体金液体制剂(1mg/ml SPA∶胶体金的体积比是1∶500)。待测样品为非新鲜样品，有沉淀颗粒。

原方法：于硝酸纤维膜上加5μl HCV阳性样品(浓度大约为0.01mg/ml)，等样品跑过测试区后，于玻璃纤维上加入100μl的胶体金制剂。计时15分钟，判读结果。

本发明的方法：于玻璃纤维上加入100μl的胶体金制剂，等胶体金跑出玻璃纤维，进入加样区，于加样区胶体金制剂之后加入5μl HCV临界样品(浓度大约为0.01mg/ml)，计时15分钟，判读结果。

结果如图8所示，原方法的背景颜色比较深，而本发明的方法背景清晰。