能利用木糖生产乙醇的重组运动发酵单胞菌及发酵方法

摘要

本发明公开了一种能利用木糖生产乙醇的重组运动发酵单胞菌及发酵方法，一种能利用木糖生产乙醇的重组运动发酵单胞菌GX1(Zymomonas mobilis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC 3438，本发明首次将大肠杆菌rrnB调控元件与木糖代谢相关基因融合，构建带有人工融合操纵子的质粒，通过电转化和驯化的方法获得的能利用木糖生产乙醇的重组运动发酵单胞菌菌株，它能高效表达外源基因，能在30-34℃高效利用葡萄糖和木糖共发酵产醇，并且能利用含有木糖和葡萄糖的玉米芯水解液产醇。本发明的菌株对有效的利用废弃的木质纤维素生产清洁能源、解决当前能源危机具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种能利用木糖生产乙醇的重组运动发酵单胞菌及发酵方法。

背景技术

随着化石能源的日益枯竭，温室效应的逐步显现，清洁可替代能源已成为全球的研究热点，以木质纤维素为原料发酵生产燃料乙醇的研发工作更是备受关注。自然界中可再生的木质纤维素资源极为丰富，其主要成份之一是半纤维素。半纤维素中的85％～90％为木糖(Lachke 2002)，因此利用木糖发酵生产乙醇对木质纤维素的有效利用、解决当前能源危机有重要意义。

然而，自然界中高效产醇的菌种通常只能利用葡萄糖等六碳糖生产乙醇，不能利用木糖；而少数能利用木糖产醇的菌株，产醇能力低下，这限制了对自然界中木质纤维素的有效利用。运动发酵单胞菌具有产醇量高、生物量形成少、无氧气需求、乙醇耐受性高、糖浓度耐受性高等优点，但其利用的底物范围较窄，只能利用葡萄糖、果糖和蔗糖等六碳糖发酵(Rogers 2007)。若构建能利用木糖产醇的重组运动发酵单胞菌，使其能有效利用木质纤维素各组分，对清洁可替代能源的生产有重要的意义。

运动发酵单胞菌利用ED(Entner-Doudoroff)途径实现高效产醇，缺少完整的磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway)，要引入木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛酶和转酮酶才能构成完整的代谢途径，转换木糖成ED途径的中间产物，使运动发酵单胞菌能发酵木糖生产乙醇。

欲将外源木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛酶和转酮酶基因在运动发酵单胞菌中表达，须考虑表达载体和外源基因的性质、启动子和SD序列、宿主菌调控系统等。运用基因工程改良宿主菌的代谢途径或运用低拷贝的质粒作表达载体表达目的基因时，可通过改变目的基因的mRNA稳定性来调控基因表达，mRNA稳定性的增加将使mRNA的丰度增加，会导致蛋白表达量按比例的增加(Smolke 2000；Pfleger 2006)。提高mRNA稳定性可通过改变目的基因的调控元件来实现，诸如改变非翻译区的二级结构，核糖体结合序列等调控元件(Carrier 1997)。转录终止子对外源基因在细菌中的高效表达有重要作用。

大肠杆菌rrnB操纵元T1T2是强而有力的转录终止子，可以有效预防转录中的通读现象并保证表达质粒的稳定性，进而提高外源基因在原核细胞中的表达水平，大肠杆菌的rrnB能增加外源基因在大肠杆菌中、枯草芽孢杆菌中外源基因的表达量(戎2005；Wang 1992)；然而目前未有将rrnB与木糖代谢相关基因组成操纵子在运动发酵单胞菌中使用的报道。J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔，分子克隆实验指南(上册)(第三版)，黄培堂等译，北京：科学出版社，2002

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戎晶晶，刁振宇，周国华.大肠杆菌表达系统的研究进展[J].药物生物技术，2005，12(006)：416-420.

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种能利用木糖生产乙醇的重组运动发酵单胞菌GX1(Zymomonas mobilis)CGMCC 3438。

本发明的第二个目的是提供一种获得能利用木糖生产乙醇的重组运动发酵单胞菌的方法。

本发明的第三个目的是提供能利用木糖生产乙醇的重组运动发酵单胞菌的发酵方法。

一种能利用木糖生产乙醇的重组运动发酵单胞菌GX1(Zymomonas mobilis)在2009年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号CGMCC 3438。

获得一种能利用木糖生产乙醇的重组运动发酵单胞菌的方法，包括如下步骤：

(1)能在大肠杆菌和运动发酵单胞菌中复制的穿梭表达载体pZ的构建：首先用SDS碱裂解法(萨姆布鲁克，2002)提取Z.mobilis(ATCC NO.10988)中的质粒，用AvaI酶切所述质粒后电泳，回收2.7kb的质粒线形片断，连接后即得到运动发酵单胞菌质粒pZM2；提取大肠杆菌质粒pACYC，将所述大肠杆菌质粒pACYC和所述运动发酵单胞菌质粒pZM2用AvaI酶切，连接后构建成表达载体pZ；

(2)表达木糖代谢基因的穿梭载体pXylose的构建：

提取大肠杆菌K12基因组DNA和运动发酵单胞菌(ATCC NO.31821)基因组DNA；

以运动发酵单胞菌(ATCC NO.31821)基因组DNA为模板，以序列表SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所述序列为PCR引物，扩增运动发酵单胞菌的启动子Pgap；

以大肠杆菌K12基因组DNA为模板，以序列表SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所述序列为PCR引物，扩增编码木糖异构酶XylA基因和木糖激酶XylB基因及非翻译区序列，扩增产物经过Kpn I和Xba I酶切后连接至pUC19质粒中，再经Nsi I和Sma I酶切后，补平粘末端后连接得到载体pXX；

以pXX为模板，以序列表SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.4所述序列为PCR引物重新扩增XylA-XylB，通过重叠延伸PCR将所述Pgap和XylA-XylB连接成一个操纵子，用EcoR I消化后连接到所述载体pZ中，得到质粒PZ-XX；

以运动发酵单胞菌(ATCC NO.31821)基因组DNA为模板，以序列表SEQ ID NO.5和SEQID NO.6所述序列为PCR引物扩增eno基因的启动子；

以大肠杆菌K12基因组DNA为模板，以序列表SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所述序列为PCR引物扩增得到编码转醛酶的Tal基因，通过重叠延伸PCR，形成Peno-Tal的融合基因片段，构建至TA载体pGMT，得到质粒pTal；

以大肠杆菌K12基因组DNA为模板，以序列表SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所述序列为PCR引物扩增转酮酶Tkt基因；

以大肠杆菌K12基因组DNA为模板，以序列表SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所述序列为PCR引物扩增rrnB，通过重叠延伸PCR获得Tkt-rrnB的融合DNA片断；用Xba I和SphI双切质粒pTal和DNA片断Tkt-rrnB，连接后得到质粒pTT；所述pTT和质粒PZ-XX用NcoI酶切消化后连接得到含有代谢木糖所需的外源基因木糖异构酶基因、木酮糖激酶基因、转酮酶基因、转醛酶基因和基因表达调控元件大肠杆菌终止子rrnB、运动发酵单胞菌gap和eno启动子的质粒pXylose；

(3)质粒pXylose向运动发酵单胞菌的转化：将质粒pXylose转化到运动发酵单胞菌CP4(CICC 10232)中，获得重组菌株；

(4)将所述重组菌株按体积百分含量为2-10％的接种量接种到5ml含木糖的RM液体培养基中，30℃培养至OD600为1.0后转接到另一个新的含木糖的RM液体培养基中继续培养，所述转接的次数为8-12次，获得一种能利用木糖生产乙醇的重组运动发酵单胞菌菌株GX1(Zymomonas mobilis)CGMCC 3438；所述含木糖的RM液体培养基为20g/L木糖、10g/L酵母提取物和KH₂PO₄ 2g/L，余量为水。

所述步骤(3)质粒pXylose向运动发酵单胞菌的转化为：将运动发酵单胞菌CP4(CICC10232)培养物按体积百分含量为0.5-1.5％的接种量接种到50ml RM液体培养基中，30℃静止培养至OD₆₀₀＝0.5；6000rpm离心5min，收集菌体，用冰浴的体积百分含量为10％的甘油水溶液洗涤2-4次，用2ml体积百分含量为10％的甘油水溶液悬浮混匀，即得感受态细胞；取40μl感受态细胞，加入1μg质粒pXylose混合，转移至无菌预冷的1mm电击杯中，1800V电击，迅速加入450ul RM液体培养基，混匀后转移到1.5ml无菌离心管中，30℃静置培养12-17小时；将培养物涂布于含20μg/ml四环素的RM固体培养基筛选平板，倒置放于培养箱30℃培养2～3天，挑选转化子；菌落经PCR鉴定后，选取转化子测定外源蛋白木糖异构酶、木酮糖激酶、转酮酶或转醛酶的酶活，获得一种能利用木糖生产乙醇的重组运动发酵单胞菌菌株，所述RM液体培养基为：20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物和KH₂PO₄ 2g/L，余量为水，所述RM固体培养基为：20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、20g/L琼脂粉和KH₂PO₄ 2g/L，余量为水。

一种能利用木糖生产乙醇的重组运动发酵单胞菌菌株的发酵方法，包括如下步骤：

将能利用木糖生产乙醇的重组运动发酵单胞菌的菌株GX1(Zymomonas mobilis)CGMCC3438在含木糖的液体RM培养基中培养至菌体浓度OD600＝1.0-1.5，离心浓缩菌体，接种到含木糖和葡萄糖的RM液体培养基中，初始菌体的浓度控制在OD600＝0.1-0.2，在上述菌分别在30℃-34℃发酵48-96小时；所述含木糖和葡萄糖的RM液体培养基为25g/L木糖、25g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物和KH₂PO₄ 2g/L，余量为水。

本发明的创新点：

本发明首次将大肠杆菌rrnB调控元件与木糖代谢相关基因融合，构建带有人工融合操纵子的质粒，通过电转化和驯化的方法获得的能利用木糖生产乙醇的重组运动发酵单胞菌菌株，它能高效表达外源基因和利用木糖产醇。天然的运动发酵单胞菌只能利用葡萄糖、果糖和蔗糖等六碳糖发酵，而本发明中的一种能利用木糖生产乙醇的重组运动发酵单胞菌能在30-34℃的条件下能高效的利用葡萄糖和木糖共发酵产醇，并且能利用含有木糖和葡萄糖的玉米芯水解液产醇。自然界中有诸多的废弃的木质纤维素，其主要成份之一是半纤维素。半纤维素中的85％～90％为木糖(Lachke 2002)，因此本发明的菌株对有效的利用废弃的木质纤维素生产清洁能源、解决当前能源危机具有重要意义。

附图说明

图1为表达载体PZ的构建过程

图2为运动发酵单胞菌和大肠杆菌穿梭载体的构建过程。

图3是重组菌株在2％木糖中的生长曲线。

图4是一种能利用木糖生产乙醇的重组运动发酵单胞菌菌株在2％木糖中的生长曲线。

图5一种能利用木糖生产乙醇的重组运动发酵单胞菌菌株在各温度条件下共发酵葡萄糖和木糖产醇。A为在各种温度条件下发酵葡萄糖的消耗和乙醇生成；B为在各种温度条件下发酵菌株的生长曲线及木糖的消耗情况；C为在各种温度条件下副产物甘油的生成情况；D为在各种温度条件下副产物乙酸的生成情况；E为在各种温度条件下副产物木糖醇的生成情况。

图6为一种能利用木糖生产乙醇的重组运动发酵单胞菌菌株在NBS公司的发酵罐中发酵的情况，在30度pH5.5的25g/L的葡萄糖和木糖的RM培养基中条件下发酵，菌体的浓度、糖浓度、乙醇产量等。

图7为一种能利用木糖生产乙醇的重组运动发酵单胞菌菌株在30度pH5.5条件下在玉米芯水解液中的发酵情况。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1能在大肠杆菌和运动发酵单胞菌中复制的穿梭表达载体pZ的构建：首先用SDS碱裂解法(萨姆布鲁克，2002)提取Z.mobilis(ATCC10988)的质粒，用Ava I酶切质粒后电泳，回收2.7kb的质粒线形片断，连接后即得到运动发酵单胞菌的pZM2质粒。用SDS碱裂解法提取大肠杆菌质粒pACYC。以大肠杆菌质粒pACYC和运动发酵单胞菌的质粒pZM2为基础，用AvaI酶切后连接成质粒pZ。pZ含有大肠杆菌和运动发酵单胞菌的复制原点(图1)，即能在上述两种宿主菌中复制。

实施例2表达木糖代谢基因的穿梭载体pXylose的构建

用天根公司的细菌基因组提取试剂盒提取大肠杆菌K12基因组DNA和运动发酵单胞菌(ATCC NO.31821)基因组DNA；

以运动发酵单胞菌(ATCC NO.31821)的基因组为模板，以序列表SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所述序列为PCR引物，扩增运动发酵单胞菌的启动子Pgap；

以大肠杆菌K12基因组DNA为模板，以序列表SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所述序列为PCR引物，扩增编码木糖异构酶XylA基因和木糖激酶XylB基因及非翻译区，扩增产物经过Kpn I和Xba I酶切后连接至pUC19质粒中，再经Nsi I和Sma I酶切后，补平粘末端后连接得到载体pXX；

以pXX为模板，以序列表SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.4所述序列为PCR引物重新扩增XylA-XylB，通过重叠延伸PCR将所述Pgap和XylA-XylB连接成一个操纵子，用EcoR I消化后连接到实施例1中构建的载体pZ中，得到质粒PZ-XX；

以运动发酵单胞菌(ATCC NO.31821)基因组DNA为模板，以序列表SEQ ID NO.5和SEQIDNO.6所述序列为PCR引物扩增eno基因的启动子；

以大肠杆菌K12基因组DNA为模板，以序列表SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所述序列为PCR引物扩增得到编码转醛酶的Tal基因，通过重叠延伸PCR，形成Peno-Tal的融合基因片段，构建至TA载体pGMT，得到质粒pTal；

以大肠杆菌K12基因组DNA为模板，以序列表SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所述序列为PCR引物扩增转酮酶Tkt基因；

以大肠杆菌K12基因组DNA为模板，以序列表SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所述序列为PCR引物扩增rrnB，通过重叠延伸PCR获得Tkt-rrnB的融合DNA片断；用XbaI和SphI双切质粒pTal和DNA片断Tkt-rrnB，连接后得到质粒pTT；所述pTT和质粒PZ-XX用NcoI酶切消化后连接得到含有代谢木糖所需的外源基因木糖异构酶基因、木酮糖激酶基因、转酮酶基因、转醛酶基因和基因表达调控元件大肠杆菌终止子rrnB、运动发酵单胞菌gap和eno启动子的质粒pXylose(见图2)。质粒pXylose含有能编码木糖代谢的木糖异构酶、木糖激酶、转醛酶及转酮酶基因，这四种酶能和运动发酵单胞菌中已有的组份构成新的代谢途径将木糖有效的转换成乙醇。

SEQ ID NO.1：5’ctcagaattctgtcgatgccgagttggactt3’；

SEQ ID NO.2：5’aataggcttgcatgtttattctcctaactta3’；

SEQ ID NO.3：5’ctcggtaccatgcaagcctattttgacca3’；

SEQ ID NO.4：5’gtttctagagaattctgcctctcgtgtcagcgtg 3’；

SEQ ID NO.13：5’gagaataaacatgcaagcctattttgacca3’；

SEQ ID NO.5：5’cccatggctcgagatctccagttactcaata3’；

SEQ ID NO.6：5’tgtccgtcatatcgaaacctttcttaaaat3’；

SEQ ID NO.7  5’aggtttcgatatgacggacaaattgacctc3’

SEQ ID NO.8  5’cgtctagattacagcagatcgccgatca3’

SEQ ID NO.9：5’cgtctagacgatctggagtcaaaatgtcc3’；

SEQ ID NO.10：5’cgccaaaacagttacagcagttcttttgctttc3’；

SEQ ID NO.11：5’aactgctgtaactgttttggcggatgagaga3’；

SEQ ID NO.12：5’tcaatgcatgccatggaagagtttgtagaaacgcaa3’。

实施例3重组菌株的获得

用promega公司的大提质粒试剂盒提取质粒pXylose。将运动发酵单胞菌CP4(CICC10232)培养物按0.5％或1.5％接种量接种到装有50ml RM液体培养基中，30℃静止培养至OD₆₀₀＝0.5；6000rpm离心5min，收集菌体，用冰浴的体积百分含量为10％的甘油水溶液洗涤2次或4次，用2ml体积百分含量为10％的甘油水溶液悬浮混匀，即得感受态细胞；取40μl感受态细胞，加入1μg质粒pXylose混合，转移至无菌预冷的1mm电击杯中，1800V电击，迅速加入450ul RM体培养基，混匀后转移到1.5ml无菌离心管中，30℃静置14小时(也可以选12小时或17小时)，将培养物涂布含20μg/ml四环素的RM固体培养基筛选平板，倒置放于培养箱30℃培养2至3天，挑选转化子；菌落经PCR鉴定后，选取三个转化子测定外源蛋白木糖异构酶的酶活分别为0.0471、0.0552和0.0676U/mg，即成功的获得了重组菌株。(也可以测定木酮糖激酶、转酮酶或转醛酶的酶活)，RM液体培养基为：20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物和2g/L KH₂PO₄，余量为水，RM固体培养基为：20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、20g/L琼脂粉和2g/L KH₂PO₄，余量为水。

实施例4重组菌株利用木糖生长观察

将重组菌株在含有20g/L葡萄糖的RM培养基中于30℃静置培养至OD₆₀₀为1.2左右，菌液离心后，用不含任何糖组分的RM培养基重悬菌体，洗涤一次，将浓缩菌体接种到含20g/L木糖的RM培养基中，接种后初始OD₆₀₀为0.08，放于30℃温箱静止培养。在0至96小时菌OD600从0.08-0.088，无显著变化；120至192h时，OD600从1.161增长至1.359，在312h最大菌体浓度OD₆₀₀在1.48左右(图3)。

实施例5重组菌株适应木糖发酵产醇的驯化培养

为提高重组菌株利用木糖的能力，将重组菌株按体积百分含量为5％(也可以选2％或10％)的接种量接种到5ml含木糖的RM液体培养基中，30℃培养至OD600为1.0后转接到另一个新的含木糖的RM液体培养基中继续培养，所述转接的次数为10次(也可以选8次或12次)，获得一种能利用木糖生产乙醇的重组运动发酵单胞菌菌株；所述含木糖的RM液体培养基为20g/L木糖、10g/L酵母提取物和KH₂PO₄2g/L，余量为水。菌体适应木糖的生长能力增强，菌株起始的培养浓度为OD600＝0.114，经过34h后OD600即能达到1.775，最大菌体浓度OD₆₀₀为1.915(图4)，菌株于-70度保存供后续的发酵使用。

实施例6能利用木糖生产乙醇的重组运动发酵单胞菌共发酵葡萄糖和木糖生产乙醇的发酵温度优化

在含木糖和葡萄糖的RM液体培养基中，将能利用木糖生产乙醇的重组运动发酵单胞菌分别在26℃、30℃、34℃、37℃和40℃五个温度梯度条件下发酵，通过EChrom98HPLC测得的测定发酵液中的能利用木糖生产乙醇的重组运动发酵单胞菌菌体浓度、糖的消耗及乙醇的生成、木糖醇等副产物含量，优化发酵产醇的温度。

菌株在上述的温度条件下发酵，发酵温度越高葡萄糖消耗越快，在24h内完全利用葡萄糖(图5A)。木糖消耗随发酵温度的不同变化较为明显：在30℃和34℃的条件下发酵，木糖利用的最好：发酵96h时，木糖利用率分别达到93.4％和95.4％；在37℃和40℃发酵，木糖利用率有所降低；在26℃下，木糖利用率最低(图5B)，即温度过高和过低都不利于木糖的利用。

随着葡萄糖及木糖的消耗，乙醇逐渐生成。在30℃和34℃下，乙醇产量最高，达到23.0g/L和23.3g/L，菌体终浓度也最高；而在37℃和40℃下发酵，乙醇产量降低，菌体浓度降低(图5A，B)。而26℃菌体浓度最低，乙醇仅为17.54g/L(图5B)。在30℃，34℃，37℃，40℃条件下发酵，48小时乙醇产量基本达到最大值，72小时和96小时乙醇产量无显著增长；即利用GX1在30℃至34℃发酵48小时可取得较好的效果。

发酵温度越高副产物甘油生成的越多(图5C)。在34℃和37℃发酵时，乙酸最大生成量较高，分别为0.53g/L和0.52g/L，在40℃和30℃下乙酸生成量次之，在26℃最低(图5D)。木糖醇在30℃和34℃发酵时分别为1.25g/L和1.06g/L，高于其它温度条件下发酵所生成的0.8g/L左右(图5E)。

综上，在30℃和34℃下发酵48-96小时，木糖利用率和乙醇生成量高，副产物生成少，是最适发酵温度条件。

含木糖和葡萄糖的RM液体培养基为25g/L木糖、25g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物和KH₂PO₄2g/L，余量为水。

实施例7能利用木糖生产乙醇的重组运动发酵单胞菌共发酵葡萄糖和木糖生产乙醇

取能利用木糖生产乙醇的重组运动发酵单胞菌接种至5ml的RM木糖培养基中，30℃培养21h，将上述5ml菌液转接至300ml RM木糖培养基中，30℃培养36h后收集菌体，重悬菌体后接种至3-L的BIOFLO 3000发酵罐(New Brunswick Scientific，Edison，NJ)中发酵，发酵罐中培养基为含木糖和葡萄糖的RM液体培养基，菌的初始OD₆₀₀＝0.2，工作体积为1.5L。根据实施例6选择在30℃、pH值5.5和转速150rpm条件下发酵。定时取样分析生物量、糖、乙醇及副产物浓度。

葡萄糖在20h即可完全消耗，木糖浓度在24h时降至0.45g/L，利用率为98.2％，此时的乙醇浓度也接近最高值，达到22.4g/L。在发酵32h时，乙醇最高产率为22.54g/L，乙醇得率为87.8％。菌体浓度在16h就已达到最大值OD₆₀₀为2.0，发酵过程中也伴随产生副产物木糖醇、乙酸和甘油的产生，分别为0.9g/L，0.8g/L和1.5g/L(图6)。

实施例8能利用木糖生产乙醇的重组运动发酵单胞菌在玉米芯水解液中的发酵

将能利用木糖生产乙醇的重组运动发酵单胞菌接种至含有35.6g/L葡萄糖和12.9g/L木糖的玉米芯纤维素水解液中，30℃静置发酵。取样测定糖、乙醇及木糖醇、甘油和乙酸等副产物的浓度。发酵24h内葡萄糖基本消耗完，仅剩0.3g/L；木糖利用率为84.8％，剩1.96g/L，最终生成的乙醇浓度分别为20.26g/L(图7)，乙醇得率(基于消耗糖计算的乙醇得率)达到理论值的87.6％，基于总糖计算的乙醇得率为理论值的83.0％，即重组菌在玉米芯水解液中有较强的产醇能力。水解液自身就存在发酵副产物木糖醇、乙酸等，发酵中产生的副产物木糖醇、乙酸的量与同等糖浓度培养基中发酵产生的量基本一致。本发明的重组菌株能较好的利用纤维素为原料的水解液进行发酵，为高效利用木质纤维素各组份生产乙醇奠定了基础。