一种负载液态氟碳的聚合物纳米超声显像囊泡及其制备方法

摘要

本发明公开了一种负载液态氟碳的聚合物纳米超声显像囊泡及其制备方法。本发明负载液态氟碳的聚合物纳米超声显像囊泡由如下按质量份数计的组分组成：聚乙二醇和聚丙交酯的两亲性共聚物1，液态氟碳类超声显像试剂2~40。本发明负载液态氟碳的聚合物纳米超声显像囊泡为纳米级，粒径分布较窄，在水中性能稳定，具有显著的体外超声显像效果，经浓缩后在动物皮下和心脏内部显像明显，可望进一步应用于体内及其它组织器官，在诊断领域有重大的研究价值和应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及高分子化学和生物医学工程领域，具体涉及一种负载液态氟碳的聚合物纳米超声显像囊泡及其制备方法。

背景技术

超声是最常用、也是最重要的影像学手段之一，它具有经济、简便、无辐射、可重复多次检查等优势，临床应用广泛，容易普及。目前常用的超声造影剂——微泡属于血池显像剂，其直径与红细胞相近，达到了数微米，经静脉注射入体内后，可通过肺循环到达全身组织脏器的微循环，通过改变扫查对象界面的声阻抗差，产生明显的造影显像效果，提高了超声对病灶的检出能力和鉴别诊断能力。但由于普通造影剂属于无组织特异性的全身性造影剂，对特定病灶的诊断能力尚不足。

为了更好的实现病灶特异性成像，有必要采用颗粒更小的纳米级超声造影剂：1)粒径达到纳米级有利于减少肾脏排泄清除、网状内皮系统吸收及吞噬细胞的识别，从而延长其在体内的循环时间；2)可顺利通过毛细血管内皮细胞间隙到达组织靶区，并可通过高通透高滞留效应(enhanced permeability andretention effect，EPR效应)在病灶组织中实现被动靶向富集；3)容易与特异性配体链接，选择性与病灶特异性分子结合，实现主动靶向成像。

现国内外研究的纳米级超声造影剂的主要分为纳米级脂质体造影剂、纳米级微泡造影剂和纳米级液态氟碳乳剂三类，但目前存在制作工艺不成熟，颗粒偏大，易被清除，体内循环时间较短，不易进行表面修饰，回声增强效果有限等不足。其中，纳米级微泡造影剂由于在组织内部引入气体而可能产生不利影响，而纳米级液态氟碳乳剂则由于表面活性剂活化的不稳定，导致造影剂在体内高度稀释和温度较高的情况很容易发生失活及沉淀。

在高效纳米载体中，脂质体囊泡作为一种生物膜载药模型，历来是重点的研究方向之一并已部分地应用于临床，但其具有靶向性差和无法实现可控释放的致命缺陷。因此，由两亲性嵌段共聚物发展出来的新型纳米囊泡正在逐步兴起并开始取代脂质体成为研究和应用的焦点模型。双亲分子由于其特殊的溶解性质在溶液中会自发集成为分子有序结构，其中一种表现为双层构型。当这些双层弯曲并封闭起来时就形成了一种新的构型。如果这些双亲分子是两亲性的嵌段共聚物，则称之为聚合物囊泡。其所用原料与胶束基本相同。

相比于其他纳米微粒，聚合物纳米囊泡具有以下优势：1)制备过程简单，利用两亲性共聚物在水溶液中自组装形成粒径相对均一的纳米微粒，并可包载不同的内容物；2)粒径小且可控，由于结构类似于细胞，具有更强的组织渗透性，且不易被清除；3)纳米囊泡的壁更厚而且可以调节，膜的通透性低，具有更好的稳定性和一定的伸缩性，在血液循环中具有较长的半衰期；4)容易进行化学修饰和引入靶向基团，以延长循环时间及实现主动靶向成像和治疗。研究结果表明，纳米囊泡在体内循环的半衰期是隐形脂质体囊泡的2倍以上，更有利于纳米囊泡在病灶组织中的富集。

另一方面，液态氟碳类造影剂性能稳定、超声回声效果显著，其最突出的优势是其可作为一种潜在的多功能造影剂，即不仅可以作为超声造影剂，还可以作为CT、MRI及核素显像造影剂。例如全氟辛溴，其沸点达到了144℃，化学性质稳定，被包负后可望在体内实现长效循环，进一步增强纳米载体的被动聚集效应。

发明内容

本发明的目的在于根据现有超声显像试剂中存在的不足，提供一种纳米级负载液态氟碳的聚合物超声显像囊泡。

本发明另一目的在于提供上述聚合物超声显像囊泡的制备方法。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

一种负载液态氟碳的聚合物纳米超声显像囊泡，由如下按质量份数计的组分制成：聚乙二醇和聚丙交酯的两亲性共聚物1，液态氟碳类超声显像试剂2~40。

其中，所述聚乙二醇和聚丙交酯的两亲性共聚物的结构中，聚乙二醇段的数均分子量为1.0~3.0KD，聚丙交酯段的数均分子量为8.0~45.0KD。

作为一种优选方案，本发明负载液态氟碳的聚合物纳米超声显像囊泡中，所述液态氟碳类超声显像试剂优选为全氟辛溴。

本发明所设计的纳米囊泡由聚乙二醇(Polyethyeneglycol，可简写为PEG)与聚丙交酯(poly(D，L-lactic acid)，可简写为PDLLA)的两亲性共聚物(可简写为PEG-PDLLA)制成。其中疏水的PDLLA段具有良好的链柔顺性、生物相容性和生物可降解性；亲水的PEG段能够延长整个药物载体的血液循环时间，以避免被网状内皮组织系统排泄出去。在自组装过程中，PDLLA段自发地形成囊泡的疏水性外壳，PEG段位于该壳的内外表面，其外壳可包负疏水性的液态氟碳类超声显像试剂——全氟辛溴。

本发明负载液态氟碳的聚合物纳米超声显像囊泡的制备方法包括如下步骤：以聚乙二醇和聚丙交酯的两亲性共聚物为原料，通过超声双乳化法来包覆液态氟碳类超声显像试剂，得到负载液态氟碳的聚合物纳米超声显像囊泡。

上述制备方法中，所述聚乙二醇和聚丙交酯的两亲性共聚物的制备方法如下：用聚乙二醇在辛酸亚锡的催化下引发单体丙交酯或己内酯的开环聚合，得到聚乙二醇和聚丙交酯的两亲性共聚物。

作为一种优选方案，本发明制备方法包括如下步骤：将1重量份共聚物与2~40重量份的液态氟碳共溶于10体积的四氯化碳中，在超声作用下于冰浴中滴加1体积0.0~5.0wt％的聚乙烯醇水溶液，然后将该乳化液在超声作用下分散至200体积0.5wt％聚乙烯醇水溶液中，即得负载液态氟碳的聚合物纳米超声显像囊泡。其中，最好对超声结束后的乳化液进行长时间搅拌，以除去其中的四氯化碳。如需浓缩，则可采用旋转蒸发仪进行减压蒸馏，除去多余的水，最终浓度及浓缩倍数视初始体积和最终体积而定。

本发明中可靶向化的负载全氟辛溴的聚合物纳米超声显像囊泡的研究得到了国家自然科学基金面上项目(30870717)的支持。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)该囊泡由聚乙二醇与聚丙交酯的两亲性共聚物制成，PEG作为亲水段能够延长囊泡的血液循环时间，而聚丙交酯作为疏水段则具有优良的生物相容性和降解性；

(2)该囊泡在水中非常稳定，平均粒径为200~800nm，有利于囊泡在人体内的被动聚集；

(3)该囊泡能够在PEG末端进行化学修饰以链接靶向配体，从而实现该显像试剂的靶向效果、提高显像试剂的局部浓度并提高显像效果等；

(4)全氟辛溴被包负进该纳米囊泡后能够显著提高其在水中的稳定性并提高了超声回声特性，相对于表面活性剂活化的液态氟碳造影剂所需浓度更低、显像效果更好；同时，由于在囊泡外壳中的包负更加分散，进一步提高了全氟辛溴的回声特性，相对于同浓度PFOB的纳米胶束载体显像效果更加明显。

附图说明

图1~3分别是实施例3中负载不同体积全氟辛溴的聚合物纳米囊泡的动态光散射粒径分布柱状图。其中，图1、图2和图3分别对应的全氟戊烷体积为0.05ml、0.1ml和0.2ml，其粒径分布位于400~500nm之间；

图4是负载0.2ml PFOB的纳米囊泡的透射电子显微镜图片。其中白色的微小圆球体为PFOB液滴，被均匀包负于为浅灰色球状囊泡的外壳内部；

图5~7分别是实施例4中负载不同体积PFOB的聚合物纳米囊泡的体外超声显像图片。其中，图5、图6和图7分别对应的全氟辛溴体积为0.025ml、0.05ml和0.1ml，均有明显的超声显像效果；

图8是实施例4中负载相同体积PFOB的聚合物纳米囊泡与胶束的超声显像灰度值比较，囊泡的显像效果更为明显；

图9是实施例5中经浓缩12倍后负载0.2ml PFOB的聚合物纳米囊泡在兔子皮下注射的超声显像图片，其显像效果明显；

图10是实施例5中经浓缩12倍后负载0.2ml PFOB的聚合物纳米囊泡在兔子心室注射的超声显像图片，其显像效果明显。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

本发明基于两亲性共聚物PEG-PDLLA的纳米囊泡被用于负载全氟辛溴，所得囊泡的粒径采用动态光散射来测定，并通过动物皮下和心室注射试验来评价这一纳米级超声显像试剂，即插入超声探头以对注射器中相同体积的超声显像囊泡溶液进行显像，并以兔子为试验对象，在皮下与心室即时注射并显像。

实施例1

1.聚合物纳米超声显像囊泡载体材料PEG-PDLLA的制备：

氩气保护下将0.2g端羟基PEG(分子量在1.0~3.0Kg/mol)在50℃左右真空干燥数小时后冷却至室温，然后注入1.6~2.4g干燥的丙交酯和少量辛酸亚锡。室温下真空干燥一小时后加入无水甲苯20ml，在120℃回流12~24h聚合。反应结束后，在无水乙醚中进行重沉淀，过滤后再用二氯甲烷溶解，于无水乙醚中进行二次重沉淀，经过滤和真空干燥得到纯样品。

2.负载全氟辛溴的聚合物纳米超声显像囊泡的制备：

将10mg共聚物(PEG-PDLLA)分别与0.05、0.1和0.2ml全氟辛溴共溶于8ml四氯化碳中，在超声作用下于冰浴中分散于20ml 2wt％聚乙烯醇水溶液中，经长时间搅拌挥发，除去溶剂四氯化碳即得。

实施例2负载全氟辛溴的聚合物纳米超声显像囊泡大小及形态的测试

所得囊泡的粒径大小采用动态光散射系统进行测量，其形态则通过透射电子显微镜来观察确定，测试结果见图1至4。图1(0.05ml PFOB)、图2(0.1mlPFOB)和图3(0.2ml PFOB)分别为对应PFOB浓度囊泡的动态光散射粒径分布柱状图。可以看出，负载全氟辛溴的聚合物纳米囊泡的粒径分布较窄，主要位于400~500nm，为纳米级。图4为负载0.2ml PFOB纳米囊泡的透射电子显微镜图片，从图中可以明显地看出两亲性聚合物在水溶液中自组装成粒径较为均匀的具有中心膜壁的“空心球”，其中白色的微小圆球体为PFOB液滴，被均匀包负于“空心球”的外壳内部。

实施例3负载全氟辛溴的聚合物纳米超声显像囊泡体外超声显像试验

用2ml注射器吸满制得的超声显像囊泡溶液，置于恒温水浴中并将超声探头置入进行显像，分别记录其超声显像图像，并与相同PFOB浓度的纳米胶束的注射器内部区域灰度值进行比较，测试结果见图5至8。图5至7显示了不同PFOB浓度的聚合物纳米囊泡的超声显像图像：0.05ml PFOB(图5)、0.05ml PFOB(图6)和0.1ml PFOB(图7)。从中可以看到，负载全氟辛溴的聚合物纳米囊泡在体外有明显的显像效果，其显像效果随PFOB的浓度的提高而提高。图8显示了相同PFOB浓度下胶束与囊泡的超声显像灰度值。很明显，该负载全氟辛溴的聚合物纳米囊泡的超声显像效果更佳。

实施例4负载全氟辛溴的聚合物纳米超声显像囊泡动物皮下及心室注射显像试验

用2ml注射器吸满经浓缩12倍后的负载0.2ml PFOB的超声显像囊泡溶液并注射于试验动物——兔子的皮下及心室，进行即时超声显像观察，测试结果分别见图9和图10。可以清楚地看到，图9上部皮下间隔组织区域内注射进入的纳米囊泡有明显的超声显像效果，图10中纳米囊泡在注射进入心室内部后也表现出了较强的超声显像效果。

以上测试结果表明，所得囊泡的粒径为400～500nm，为纳米级，超声显像试剂全氟辛溴被均匀地包负于该囊泡的外壳内部。体外显像实验表明，该负载全氟辛溴的聚合物纳米囊泡性能稳定，可进行体内的长效循环，而且该囊泡具有比相同PFOB浓度下的纳米胶束更为明显的超声显像效果，其显像效果随PFOB浓度的提高而提高。动物皮下和心室注射显像实验表明，该纳米囊泡经浓缩后在皮下和心室均具有较好的超声显像效果。