进境植物检疫性有害生物蔗扁蛾的快速鉴定方法

摘要

一种进境植物检疫性有害生物蔗扁蛾的快速鉴定方法，以蔗扁蛾特异性引物CF720/CR1113对待测样品基因组DNA提取液进行PCR扩增，取PCR扩增液于0.5×TBE电泳缓冲液中在5V/cm电压下电泳后，置于溴化乙锭染色盒中染色，在紫外凝胶成像仪上观察扩增条带，判断该待测样品是否为检疫性有害生物蔗扁蛾；该方法的鉴定时间由原来的一周以上缩至一天以内，鉴定准确性由原来的70％提高至99％，可帮助出入境检疫部门、海关等相关单位在口岸进行快速、准确、高效的检测鉴定。

说明书

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，具体指一种进境植物检疫性有害生物蔗扁蛾的快速鉴定方法。

背景技术：

蔗扁蛾Opogona sacchari(Bojer，1856)为我国进境植物检疫性有害生物(见2007版的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》)。主要危害巴西木、发财树以及棕搁科植物为主的观赏园林植物和香蕉、甘蔗等传统的经济作物。例如在北京，受害严重的温室每年巴西木的淘汰率达50％以上，造成经济损失高达几百万元。

目前，我国通用的检测鉴定蔗扁蛾的方法仍然是实验室形态学鉴定方法，该法须经饲养、解剖、镜检等繁琐的步骤，其鉴定时间一般至少需要1周。在贸易全球化加速发展的今天，此方法显然已不再适用于当今植物及其产品的进出境检疫，这就迫切要求我们建立一种能快速、准确、高效检测鉴定植物及其产品中是否存在该检疫性有害生物的方法。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种进境植物检疫性有害生物蔗扁蛾的快速鉴定方法，是以分子生物学检测方法-PCR法为基础，建立一种针对蔗扁蛾的特异性基因片段进行检测鉴定的方法，可帮助出入境检疫部门、海关等相关单位在口岸进行快速、准确、高效的检测鉴定。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种进境植物检疫性有害生物蔗扁蛾的快速鉴定方法，其特点是：以蔗扁蛾特异性引物CF720/CR1113对待测样品基因组DNA提取液进行PCR扩增，取PCR扩增液于0.5×TBE电泳缓冲液中在5V/cm电压下电泳后，置于溴化乙锭染色盒中染色，在紫外凝胶成像仪上观察扩增条带，判断该待测样品是否为检疫性有害生物蔗扁蛾；

其中：上述PCR扩增液为PCR反应体系经PCR反应参数后的PCR扩增产物，总反应体系为25μl，各成分组成如下：10×PCR Buffer 2.5μl、各2.5mM的dNTP Mixture 2μl、10pM的蔗扁蛾特异性引物CF720/CR1113各1μl、5U/μl的Taq DNA聚合酶0.13μl、50ng/μl的DNA提取液2μl、灭菌双蒸水16.37μl；PCR反应参数是：94℃预变性4min；94℃变性20s，62℃退火20s，72℃延伸30s共30个循环；72℃延伸5min；最后4℃保存；

上述蔗扁蛾特异性引物为：

正向引物CF720：5‘-ATATATTTTAATTTTACCAGGATTCGGT-3’

反向引物CR1113：5‘-TACTACATAGTAAGTATCGTGGAGAGAT-3’。

本发明的鉴定检测方法的具体步骤如下：

1、待测样品(蔗扁蛾)基因组DNA提取(主要针对新鲜材料，取其足部等)：

1.1.取1克待测样品(蔗扁蛾)肌肉组织(检验检疫现场发现的幼虫、蛹或成虫等样品)于灭菌双蒸水中漂洗，吸水纸吸干，解剖镜下剔除附着物、内容物等杂质，以免其他非样品物质污染。

1.2.将处理后的样品置于1.5ml离心管，加入30μl匀浆缓冲液(STE∶5％SDS∶2mg/ml蛋白酶K＝8∶1∶1)，充分研磨成匀浆后加入匀浆缓冲液补充至600μl，置于37℃水浴1h直至混合液消化变清亮为止。

(注：STE为0.05mol/L Tris-HCl、0.1mol/L NaCl、0.1mol/L EDTA、PH值为7.0-8.0)

1.3.在混合液中加入等体积的酚氯仿(酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1)，上下缓慢颠倒十次、混匀，12000r/min离心15min取上清液。

1.4.重复前一步骤一次，取上清液。

1.5.加入0.8倍体积的异丙醇置-20℃冰箱中30min，沉淀DNA。

1.6.12000r/min离心15min弃上清液，用无水冰乙醇500μl洗涤沉淀，12000r/min离心15min弃上清液。

1.7.用600μl 75％乙醇重复洗涤一次沉淀，弃上清液。

1.8.自然干燥或55℃温箱干燥约10min，加入50μl TE(或灭菌双蒸水)溶解DNA，用超微量紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度后将样品置于-20℃保存备用。

2、样品(蔗扁蛾)基因组DNA浓度、纯度测定：

2.1超微量紫外分光光度计(ND-1000)开机自检。

2.2将2μl的灭菌双蒸水点在检测眼里，将信号接收器归位，点击操作软件，仪器进入检测状态，随后用吸水纸吸干。

2.3TE(或灭菌双蒸水)(同溶解DNA用溶剂)上样，重复前一步骤的操作、校零，随后用吸水纸吸干。

2.4吸取1.0μl待检样品(蔗扁蛾)基因组DNA样品，点击软件按钮，分别测定260nm、280nm波长时的OD值并记录，分析DNA提取液的纯度、浓度。

2.5依据测定的浓度，以TE(或灭菌双蒸水)(同溶解DNA用溶剂)作为溶剂配制出50ng/μL的DNA提取液作为PCR扩增反应的模板。

3、PCR扩增：

3.1计算PCR反应体系(参照《分子克隆实验指南(第三版)》，依据标准PCR反应体系计算)

PCR反应体系(总25μL)如下：

10×PCR Buffer                            2.5μl

dNTPMixture(各2.5mM)               2μl

蔗扁蛾特异性引物CF720、CR1113(10pM)各1μl

Taq DNA聚合酶(5U/μl)              0.13μl

50ng/μl的DNA提取液                2μl

灭菌双蒸水                         16.37μl

注：上述10×PCR Buffer、dNTPMixture、Taq DNA聚合酶均购置于宝生物工程有限公司(大连)，蔗扁蛾特异性引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

3.2配制PCR反应体系(冰上操作)

按计算的量分别先后加入ddH2O、10×PCR Buffer、dNTP Mixture(各2.5mM)、蔗扁蛾特异性引物、DNA提取液及Taq DNA聚合酶。

3.3配制好的反应体系移入PCR仪，设置PCR反应参数

PCR反应参数：预变性94℃，4min；(94℃变性，20s；62℃退火，20s；72℃延伸，30s)30个循环；72℃延伸5min；最后4℃保存。

4、电泳检测：

4.1用灭菌双蒸水将凝胶模具和梳子冲洗干净，把凝胶模具放在水平桌面上，并架好梳子。

4.2称取0.4g的琼脂糖粉放入三角瓶中，用1x TBE缓冲液(或1xTAE缓冲液)配成1.5％浓度的琼脂糖，盖上封口膜，微波炉内加热熔化，冷却至60℃，倒入凝胶模具中，待凝固。(注：琼脂糖的量具体依凝胶模具的大小而定)

4.3琼脂糖凝胶凝固后，将凝胶模具移入电泳槽中，再向电泳槽中加0.5xTBE缓冲液至淹没凝胶1-2mm，小心移去梳子；取10μl PCR扩增反应液及2μl 6x上样缓冲液混匀后加入样品孔内(6x上样缓冲液为0.25％溴酚蓝、40％蔗糖溶液)。

4.4接通电源，一般红色为正极，黑色为负极，DNA样品由负极往正极泳动，调电压至5V/cm。

4.5根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳。

4.6凝胶放入溴化乙锭(EB)染色盒中染色10min(5μl EB母液加入100ml水中)，在紫外凝胶成像仪上观察扩增DNA条带及其位置，并与DNA Mark(购置于宝生物工程(大连)有限公司)比较扩增产物的大小。

5、结果判定：

通过紫外凝胶成像仪观察，若样品能扩增出1条约400bp(目标片段长度理论上为394bp)的DNA条带，则说明该样品为检疫性有害生物蔗扁蛾；若样品在400bp左右未能扩增出明显条带，则说明该样品不是检疫性有害生物蔗扁蛾。

关于蔗扁蛾特异性引物的设计及PCR反应体系及反应参数的设置具体步骤如下：

下述实验中主要材料、试剂和仪器来源：

本实验所用的蔗扁蛾中国种群的成虫、幼虫、蛹等标本来自实验室饲养，其DNA样品均分个体编号单独提取、保存(虫源：2008年9月18日，扬州)；蔗扁蛾中国种群H001及其近缘属种444、445、446，同属近缘种447、448、449和检疫性有害生物美国白蛾中国种群018标本由湖南农业大学昆虫学研究所提供；蔗扁蛾日本种群486及其近缘种472由大阪府立大学昆虫学研究室提供；检疫性有害生物美国白蛾美国种群H056、检疫性有害生物美国白蛾日本种群H057、H058标本由日本国立科学博物馆提供。

10×PCR Buffer、dNTP Mixture、Taq DNA聚合酶、DNA Marker、克隆载体pMD^TM19-T Vector试剂盒、感受态细胞均购置于宝生物工程(大连)有限公司(Takara公司)；Agarose-H琼脂糖购置于上海生工生物工程技术服务有限公司；PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；其他试剂按普通分子生物学实验操作规定。

梯度PCR仪(Bio-RAD C-1000)；凝胶成像系统(Bio-RAD Gel DocXR)；高速冷冻离心机(Ependorf 5415R)；电泳仪(Bio-RAD POWERPac300)；超纯水处理器(MILLI-Q Plus)；超微量紫外分光光度计(ND-1000)。

1、DNA样品的获得：所有材料的基因组DNA提取方法同检测方法的样品基因组DNA提取。

2、DNA样品的浓度、纯度测定：同检测方法的样品基因组DNA浓度、纯度测定。

3、COI基因的扩增、纯化以及测序：

3.1.在NCBI中查找与鳞翅目昆虫COI基因序列及其相关的基因序列，并以此为基础结合MEGA4.0.2专业软件进行序列排列比对，从中找出适合鳞翅目昆虫COI基因PCR扩增的通用引物：

COI-CF1 TATCGCYTAWAHCTCAGCCA

COI-CR1 TCAWGTTGCCATTTCTA

3.2.用通用引物将蔗扁蛾及其近缘种群线粒体DNA中COI基因进行PCR扩增，PCR反应体系(总25μl)组份为：

10×PCR Buffer               2.5μl

dNTPMixture(各2.5mM)         2.0μl

通用引物COI-CF1/COI-CR1(10pM)各0.5μl

Taq DNA聚合酶(5U/μl)        0.5μl

50ng/μl的DNA提取液          2.0μl

灭菌双蒸水                   17.0μl

按计算的量分别先后加入ddH2O、10×PCR Buffer、dNTP Mixture(各2.5mM)、通用引物、模板DNA及Taq DNA聚合酶(冰上操作)。将配制好的反应体系移入PCR仪，设置PCR反应参数：预变性94℃，5min；(94℃变性，45s；51℃退火，45s；72℃延伸，1min 30s)34个循环；72℃延伸7min；最后4℃保存。

3.3.将PCR扩增成功的COI基因，用宝生物工程有限公司(大连)生产的pMD^TM19-T Vector试剂盒进行克隆，具体步骤基于试剂盒说明书步骤略有改动，如下：

3.3.1.将载体和感受态细胞(-70℃保存)置于冰中融化，约30min。

3.3.2.在PCR管中配制DNA溶液，总体积为5μl(载体1μl、DNA扩增产物3μl、灭菌双蒸水1μl)。

3.3.3.加入5μl的Solution I，柔和地混匀。

3.3.4.16℃反应过夜。

3.3.5.将全量(10μl)加入50μl感受态细胞中，冰中放置30min。

3.3.6.42℃加热90s后，再放入冰中2min。

3.3.7.加入940μl LB液体培养基(不含Amp)，37℃震荡培养约60min。

3.3.8.取培养好的菌液12000r/min离心1min，弃上清液800μl。剩余培养液用枪头悬垂打匀。超净工作台中，在新的1.5ml离心管中加入20mg/ml的IPTG(异丙基-β-D半乳糖苷)诱导剂5μl、20mg/ml的X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷)20μl以及175μl培养后的感受态细胞配制成混合液。

3.3.9.将LB固体培养基融化，待其冷却至60℃左右，加入Amp使其终浓度为100μg/ml，倒入平皿冷却。

3.3.10.将3.3.8中的混合液均匀涂布于含Amp的LB固体培养基中，风干后平皿倒置37℃温箱培养培养过夜。

3.3.1l.用灭菌后的牙签挑取白色菌落在含Amp的LB液体培养基中(Amp终浓度为100μg/ml)培养5-10h左右，再用其做PCR扩增确认目的片段是否克隆成功，并将基因克隆成功的菌液送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

4、特异性引物的设计：

4.1.将COI基因测序结果用MEGA4.0.2专业软件进行序列排列比对，人工设计特异性引物，并用Primer Primer5.0检查引物二聚体、发夹结构以及错配情况。设计的引物输入GeneBank，用Blast程序验证引物的特异性。

初步设计正向引物12条、反向引物5条(见下表1)，

表1初步设计的正向、反向引物

用蔗扁蛾及其近缘种群COI基因克隆成功的样品做初步筛选。初筛包括引物的最适退火温度、引物特异性、引物的最适浓度等，最后筛选出一对最适合的特异性引物(引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)，见表2。

表2特异性引物(5′-3′)

5、PCR反应体系和反应参数的设定：

计算PCR反应体系：针对筛选出来的特异性引物CF720/CR1113参照《分子克隆实验指南(第三版)》，依据标准PCR反应体系、基于特异性引物自身的要求计算PCR反应体系(总25μL)如下：

10×PCR Buffer                     2.5μl

dNTPMixture(各2.5mM)               2μl

蔗扁蛾特异性引物CF720、CR1113(10pM)各1μl

Taq DNA聚合酶(5U/μl)              0.13μl

50ng/μl的DNA提取液                2μl

灭菌双蒸水                         16.37μl

(经过温度梯度实验比对，选择最佳退火温度，依据引物条件需求，设定程序)

最佳退火温度的选择：

1.根据引物合成报告单中每条引物的Tm值，计算引物的平均Tm值。

2.用重组质粒pMDTM19-T-COI为模板，对筛选出的特异性引物进行梯度PCR反应以摸索该对引物的最佳退火温度，退火温度范围上限为平均Tm值高4℃、下限为平均Tm值低5℃(以CF720/CR1113为例，其平均Tm值约为61℃，则退火温度范围设定为65℃-56℃)，搜索出最佳退火温度，最终确定PCR反应参数为：94℃预变性4min；(94℃变性20s；62℃退火20s；72℃延伸30s)30个循环；72℃延伸5min；最后4℃保存。

特异性验证：

用所建立的PCR检测体系，对蔗扁蛾2个不同地理(中国和日本)种群及其近缘种群进行特异性检测。为确保结果的可靠性，每次实验均重复三次。结果显示，蔗扁蛾的2个种群均能扩增出1条约400bp左右的DNA片段(见图1)，其他近缘种群均未扩增出特异性条带，表明该体系具有良好的特异性。

灵敏度验证：

用所建立的PCR检测体系，以蔗扁蛾重组质粒pMDTM19-T-COI的6个不同浓度的DNA模板来确定PCR反应的检测灵敏度，重复三次。结果显示(见图2)，模板浓度在100-10ng/μl时，均能扩增出强烈的检测信号；对于1ng/μl的DNA模板，检测扩增产物明显降低，检测信号较弱；当DNA模板浓度为0.5ng/μl时，由于无扩增产物或检测信号太弱而无法检出。表明该方法的检测限度为1ng/μl，最适检测浓度为100-10ng/μl。若原始的50ng/ml DNA提取液的量未达到该检测方法的最低限量将导致PCR反应不能完成扩增作用。

与现有技术相比，本发明的优点是：鉴定时间由原来的一周以上缩至一天以内；鉴定准确性由原来的70％提高至99％；对检测样品要求由原来的形态学特征完整降低到1克以上的昆虫组织；对专家要求由原来的专业人士降低非专业人士。

附图说明：

图1是用PCR反应体系进行特异性检测结果图。

图中：1表示444(蔗扁蛾近缘属种1)；2：445(蔗扁蛾近缘属种2)；3：446(蔗扁蛾近缘属种3)；4：447(蔗扁蛾同属近缘种种1)；5：448(蔗扁蛾同属近缘种种2)；6：449(蔗扁蛾同属近缘种种3)；7：472(蔗扁蛾同属近缘种种4)；8：018(检疫性有害生物美国白蛾中国种群)；9：H056(检疫性有害生物美国白蛾美国种群)；10：H057(检疫性有害生物日本白蛾日本种群)；11：H058(检疫性有害生物美国白蛾日本种群)；12：H001(蔗扁蛾中国种群)；13：486(蔗扁蛾日本种群)；14：CK(空白对照)；15：Mark(DNA Mark)

图2是以蔗扁蛾中国种群重组质粒的6个不同浓度为扩增模板DNA，运用PCR反应体系检测特异性的灵敏度图。

图中：1表示Mark；2-7分别表示模板DNA的不同浓度：2：100ng/μl、3：50ng/μl、4：25ng/μl、5：10ng/μl、6：1ng/μl、7：0.5ng/μl。

图3是本发明的实施例的检测结果图。

图中：M表示Mark；1-3分别表示三个重复的实验。

具体实施方式：

以即将入境待检植物上的生物为样品，进行样品基因组DNA的提取、基因组DNA提取液的浓度和纯度测定，基于本发明创建的蔗扁蛾特异性引物CF720/CF1113、设置的PCR反应体系(总反应体系为25μl，各成分组成如下：10×PCR Buffer 2.5μl、各2.5mM dNTP Mixture 2μl、10pM蔗扁蛾特异性引物CF720/CF1113各1μl、5U/μl Taq DNA聚合酶0.13μl、50ng/μl DNA提取液2μl、灭菌双蒸水16.37μl)和设定的PCR反应参数(94℃预变性4min；94℃变性20s，62℃退火20s，72℃延伸30s共30个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存)进行PCR扩增；特异性扩增完成后，取10μl PCR扩增液和2μl 6x上样缓冲液混合，混合液在1.5％琼脂糖凝胶中以5V/cm的电压进行电泳，电泳结束后置凝胶于含溴化乙锭的溶液中染色10min，在凝胶成像系统中观察结果，得知，能扩增出1条约400bp左右的DNA片段(见图3中的1)，说明该样品生物为检疫性有害生物蔗扁蛾。为检测测定结果的可靠性，实验重复三次，结果见图3，表明该检测方法的稳定性良好。