公开/公告号CN101775399A
专利类型发明专利
公开/公告日2010-07-14
原文格式PDF
申请/专利权人 中国农业科学院兰州兽医研究所;
申请/专利号CN201010122010.4
申请日2010-03-11
分类号C12N15/42;C12N15/62;C07K14/09;A61K48/00;A61K47/48;A61K39/135;A61P31/14;
代理机构北京科龙寰宇知识产权代理有限责任公司;
代理人孙皓晨
地址 730046 甘肃省兰州市城关区盐场堡徐家坪1号
入库时间 2023-12-18 00:01:25
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2012-09-05
授权
授权
2010-09-15
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N15/42 申请日:20100311
实质审查的生效
2010-07-14
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种动物重组疫苗,尤其涉及牛口蹄疫病毒Asia1型多表位重组疫苗及其制备方法,属于动物口蹄疫病毒重组疫苗领域。
背景技术
口蹄疫作为重大动物疫病不仅严重威胁畜牧业的健康发展,而且会引起人们对食品安全的担忧等一系列社会问题。疫苗免疫仍然是有效防控口蹄疫的主要手段之一。但目前使用的疫苗大多是采用病原体研制的灭活疫苗,生产此类疫苗不仅需要防止病原体逃逸的高级别生物安全生产车间,而且需要区分疫苗免疫和自然感染动物。此外,病毒灭活不完全有引起疫苗毒株流行的危险,曾经在欧洲发生过由病毒灭活不彻底引起田间FMD流行的事例。再者,当口蹄疫流行时,疫苗免疫牛羊等反刍动物虽然不出现临床症状,但容易形成持续感染动物,有可能成为下次流行的潜在危险源。尤其是,21世纪初暴发的口蹄疫O型泛亚谱系毒株横扫亚欧大陆,就连几十年无疫的经济发达国家如英国、法国、日本、韩国等国家也难以幸免,经济损失惨重。以英国为例,2001年口蹄疫大流行导致450万动物被扑杀,经济损失高达103亿美元,此次疫情引起世界各国对口蹄疫防控形势的重新谈论和评估。大多数学者认为疫苗免疫仍然是防控口蹄疫的主要手段。为了克服传统疫苗的缺陷,开展安全、优质高效的新型疫苗是现在疫苗研制的必然趋势。
目前,除中国上海复旦大学郑赵鑫教授研制的猪口蹄疫病毒O型重组疫苗申获了专利并获得农业部颁发的“一类新兽药证书”外,没有查阅到有关牛口蹄疫病毒Asai1型多表位重组疫苗的专利信息。因此,研制价廉、安全、高效的牛口蹄疫新型疫苗对提升我国口蹄疫防控能力,保护畜牧业健康可持续发展,保障农民增收、促进农村经济快速稳定发展等具有重要意义。
现代免疫学、基因组学、分子生物学和生物信息学技术的快速发展,为研制分子疫苗奠定了基础。但是,以小分子靶标抗原为基础的疫苗组装体系以及最大化模拟自然感染免疫的能力依然是小分子表位疫苗研究的瓶颈。早在20世纪80年代初,研究者发现口蹄疫病毒VP1结构蛋白能够诱导机体产生免疫应答,并能抵抗同源病毒攻击。1982年,Bittle等发现化学合成的口蹄疫病毒VP1结构蛋白部分短肽(表位),能够诱导免疫应答。此后,研究者纷纷采用化学合成肽或基因工程技术研究分子疫苗。研究最为广泛的是用口蹄疫病毒VP1结构蛋白的优势抗原表位(140-160和200-213氨基酸序列)构建基因工程亚单位疫苗和DNA疫苗及合成肽,除了美国UBI公司研制的猪口蹄疫病毒O型合成肽已经商品化外,所有其他分子疫苗虽然能诱导小动物模型(小鼠、豚鼠)及部分本动物产生保护性抗体,保护动物抵抗病毒攻击。但大规模本动物试验均以失败告终(攻毒保护率达不到国家标准),主要是由于研制的小分子抗原不能刺激机体产生保护水平的中和抗体,有些即使能产生一定水平的保护性抗体,但持续时间短,不能满足疫病防控的需要。另外,研制的病毒颗粒样衣壳蛋白能够诱导机体产生高效价的保护性抗体,免疫动物能够抵抗同源病毒的攻击,但是该抗原的低产量和高成本限制了该疫苗的应用。近来,人们通过增加T细胞表位和外源载体蛋白以加强抗原递呈能力、增加分子量、促进B细胞成熟分化等手段来提高疫苗的免疫原性,增强免疫应答能力、提升外周血循环抗体的水平和持续时间,虽然在某种程度上明显提高了抗原的免疫原性,但是多次免疫后能产生高水平的外源载体蛋白抗体,反而影响了靶标抗原的免疫效果;另外,由于研究者采用的T细胞表位不是通用性表位,即不能被所有宿主动物的主要组织相容性复合物(MHC分子)识别,故并不能诱导所有动物产生免疫应答。近年来,以主要免疫因子如IFN-γ、IL-2等与抗原表位小分子偶联构建的表位疫苗成为表位疫苗研究的新突破点,但对本动物的免疫效果并不理想。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种口蹄疫病毒Asia1型多表位基因;
本发明的目的之二是提供一种口蹄疫病毒Asia1型多表位基因和载体蛋白的融合基因;
本发明的目的之三是提供一种牛口蹄疫病毒Asia1型多表位重组疫苗,该疫苗含有由上述口蹄疫病毒多表位基因和载体蛋白融合基因所表达的重组蛋白;
本发明的目的之四是提供上述牛口蹄疫病毒Asia1型多表位重组疫苗的制备方法;
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的:
一种口蹄疫病毒多表位基因,其碱基序列为SEQ ID NO:1所示;所编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。
一种口蹄疫病毒多表位基因和载体蛋白的融合基因,由SEQ ID NO:1所示的碱基序列和牛IgG基因组成;
本发明利用分子生物学、生物信息学以及相关技术分析Asia1型口蹄疫病毒的全基因组序列(JS/05株,GenBank accession number:),采用计算机软件预测、设计和筛选优势抗原表位基因和辅助表位基因。选取口蹄疫病毒的主要结构蛋白基因VP1上的两个免疫原性B细胞表位(136-160aa,198-211aa)进行适当串联(即136-160aa-linker-198-211aa),为了防止相邻表位相互连接形成新的表位,本发明采用一种全新高效的接头(GGSSGG)连接相邻的表位,避免不同表位连接后形成新表位,保护天然表位的结构和功能,以保证表位的结构和功能的完整性。为了增加表位的效价,将两个表位的串联体重复一次;为了提高表位的免疫原性即效价,将表位重复串联一次,即B1-B2-B1-B2,得到复合表位基因(SEQ ID NO:1)。
本发明采用RT-PCR扩增牛IgG基因(SEQ ID NO:5;其推导的氨基酸序列为SEQ ID NO:6),阳性扩增子与复合表位基因融合后插入表达载体pPROEXTb(Invitrogen)构建重组表达质粒pPROEXTb-EBIG。这种融合蛋白称为“抗体化抗原分子”。其中牛IgG基因通过增加小分子表位的分子量使其完全抗原化,增强靶标抗原的免疫原性,另外,通过MHC分子与IgG分子Fc端的高效结合促进靶标抗原的递呈,不仅增加了靶标抗原的免疫原性,同时延长了靶标抗原的半衰期,保证了免疫后较长时间内血清高效价抗体水平。
本发明还提供了牛口蹄疫病毒Asia1型多表位重组疫苗,该重组疫苗包括以下组分:口蹄疫病毒多表位基因和牛IgG重链区基因的融合基因所编码的蛋白以及口蹄疫病毒3D蛋白;
一种制备上述牛口蹄疫病毒Asia1型多表位重组疫苗的方法,包括:(1)制备口蹄疫病毒多表位基因和牛IgG重链区基因的融合基因蛋白;(2)制备口蹄疫病毒3D蛋白;(3)分别将步骤(1)和步骤(2)所制备的蛋白稀释后,混和均匀,加入佐剂,乳化,即得。
优选的,步骤(3)中将步骤(1)和步骤(2)所制备的蛋白稀释后按照等体积比例混合均匀,再加入与混合物体积相同的佐剂进行乳化。
其中,口蹄疫病毒3D蛋白基因的碱基序列为SEQ ID NO:3所示,所推导的氨基酸序列为SEQ ID NO:4所示;
基于传统疫苗和目前分子疫苗的诸多缺点和不足,本发明采用全新的免疫学理论,采用分子设计、基因操作、蛋白质工程及相关技术构建牛口蹄疫Asia1型多表位重组疫苗。本发明疫苗在设计上既考虑B细胞的功能,又兼顾T辅助细胞对B细胞的辅助功能及T细胞的细胞免疫功能。最主要的是选用了能被绝大多数动物MHC分子识别的T细胞表位即通用型表位,克服MHC分子的异质性限制,加强MHC分子对抗原的递呈能力和水平。另外,Th1细胞表位能诱导T细胞免疫应答。
本发明采用宿主动物牛自身蛋白分子(IgG)作为载体蛋白,不仅增大了小分子靶标抗原的分子量,使其完全抗原化,明显增强了靶标抗原的免疫原性,延长了半衰期,而且最大程度降低了副反应。载体蛋白IgG作为主要免疫成分能被MHC分子有效识别,促进抗原的递呈能力和水平。
本发明通过实验动物模型和本动物免疫效力实验验证靶标抗原的免疫原性,即诱导产生保护性中和抗体和细胞免疫能力,以及抵抗病毒攻击的能力(PD50测定),全面评价抗原的免疫效力。实验结果表明,本发明牛Asia1表位疫苗能产生全面的免疫保护反应,注射免疫豚鼠和牛体均能诱导产生高水平的中和抗体,同时也能诱导细胞免疫应答,说明本发明牛Asia1表位疫苗能有效保护动物抵抗口蹄疫病毒强毒攻击。
附图说明
图1各组疫苗免疫豚鼠后血清抗体水平消长规律。
图2各组疫苗免疫豚鼠后血清抗体水平变化柱状图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1牛口蹄疫病毒Asia1型多表位重组疫苗的制备
(1)口蹄疫多表位基因设计和合成:选用Asia1型口蹄疫病毒JS/05毒株全基因组序列(GenBank accession number:EF149009.1)进行多表位的设计,即选取主要结构蛋白基因VP1上的两个免疫原性B细胞表位(136-160aa,198-211aa)进行适当串联(即:136-160aa-linker-198-211aa),为了防止相邻表位相互连接形成新的表位,在相邻表位之间加入接头-GGSSGG,最大化减小相邻表位之间的影响,以保证表位的结构和功能的完整性。为了增加表位的效价,将两个表位的串联体重复一次,即:136-160aa-linker-198-211aa-linker-136-160aa-linker-198-211aa。为了将该多表位融合基因插入重组表达载体,在该融合基因的两端引入酶切位点,即5’端-BamH1,3’端-EcoR1,插入pUC-18载体即为重组质粒pUC-E。
复合多表位基因序列为SEQ ID NO:1所示,所推导的氨基酸序列为SEQ IDNO:2所示。
(2)牛IgG重链区基因的扩增:
根据牛IgG重链区基因序列(SEQ ID NO:5)设计引物并扩增得到牛IgG重链区基因;特异性引物为:上游,5-gctGAATTC(EcoR1)GCCTCCACCACAGCCCCGAAA-3;下游,5-gctCTCGAG(xho1)TTTACCCGCAGACTTA GAGGTGGAC-3。
总RNA的提取及PCR扩增:用RNA提取试剂盒(Qigen)分别从牛新鲜脾脏中提取总RNA。用one step RNA PCR试剂盒(Takara,Japan)扩增目的基因:总反应体积为50μl,包含1μl 10×one step RNAPCR缓冲液,10μl MgCl2,5μl dNTPs,1μl RNase inhibitor,1μl AMV RTase XL,1μl AMV Optimized Taq,1μl上游引物,1μl下游引物,5μl RNA,加无离子水20μl。按以下条件扩增,50℃反转录30min;94℃热变性5min;94℃,1min;60℃,1min;72℃,1min;30个循环。用DNA纯化回收试剂盒回收扩增产物,并插入pMD-18T载体(Takara,Dalian,China)进行测序鉴定。
(3)多表位-载体蛋白融合基因重组表达质粒的构建
上述(1)和(2)所得到的目的基因分别酶切,纯化回收后,插入表达质粒pPROEXHTb(购自Invitrogen),构建重组表达载体pPROEXHTb-EBIgG;
(4)富集T细胞表位的口蹄疫病毒基因的扩增及表达载体构建
参考(1)述Asia1型口蹄疫病毒JS/05株的基因组序列合成引物:上游5-GCTCCATGG(Nco1)ATGGATTGATAGTTGACACCAGAGAT-3;下游5-GCTAAGCTT(HindIII)TGCGT CACCGCACACGGCGTTC-3。参照(2)所述反应条件扩增口蹄疫病毒3D基因,扩增产物插入pMD-18T构建重组质粒pMD-3D,经生物公司(Takara,Dalian,China)测序验证目的基因的正确性。用Nco1/HindIII将目的基因3D从测序正确的阳性重组体切割下来插入表达载体pET30a(购自Novagen),构建重组表达质粒pET30-3D。
(5)多表位融合抗原和3D蛋白的表达和纯化:
重组多表位抗原和3D抗原的表达按照《分子克隆实验指南》第三版第15章进行,科学出版社,2002年8月。融合蛋白的纯化参照试剂公司手册进行(Novagen,TB273Rev.A 0603)。
(6)重组疫苗的制备
用PBS变性液将纯化的重组多表位抗原稀释成浓度为0.8mg/ml,3D蛋白稀释为0.4mg/ml。两种蛋白溶液等体积(0.5ml∶0.5ml)混匀后,加入等体积(1ml)206佐剂,用乳化机进行乳化(先低速搅拌,慢慢调高转速,总时间不超过2min)制备成疫苗(油包水)。以上操作均在无菌条件下进行。
(7)疫苗的无菌检测
取适当量的疫苗接种琼脂斜面、肉汤和肝汤培养基,37℃培养7天,以琼脂斜面未见菌落,液体清亮为合格,否则为不合格产品。另外,用BABL/c小鼠检测疫苗在动物体内的安全性,即选用5只BABL/c小鼠,每只注射0.5ml疫苗,观察72小时内是否出现不良反应,以未出现临床症状为合格。
试验例1本发明重组疫苗的免疫效力试验
为了验证本发明重组疫苗的免疫原性,在动物模型豚鼠以及牛上进行了疫苗的免疫效力实验。
(1)选取健康豚鼠(250-300g)20只,分成4组,每组5只豚鼠。其中,PBS为阴性对照,E/BIgG为重组蛋白组(SEQ ID NO:1+牛IgG重链区),E/BIgG/3D为重组蛋白加3D蛋白组(SEQ ID NO:1+牛IgG重链区+3D蛋白),IV为重组疫苗组(实施例1所制备的重组疫苗);
每只豚鼠经腹股沟注射抗原制剂1ml(300μg),一免28天后同剂量加强免疫。分别予免疫前1天,免疫后7,14,28及加强免疫后14天采血,用全病毒作为包被抗原,采用间接ELISA测定循环抗体效价,各组疫苗免疫豚鼠后血清抗体水平消长规律结果见表1和图1所示,首免后血清抗体随时间延长而上升,到35天达最高,加强免疫后,表位载体蛋白组上升幅度不明显,但表位载体蛋白-3D组血清抗体明显升高,说明重组抗原能诱导产生较高水平的中和抗体,但抗体水平低于全病毒灭活抗原的水平。令人鼓舞的是,加强免疫豚鼠能够抵抗1000个50%豚鼠感染剂量的攻击,100%保护。图2能明显反应各注苗组血清抗体效价消长情况随免疫次数及时间的动态变化趋势。
表1各组疫苗免疫豚鼠后血清抗体消长规律
(2)重组抗原在牛体的免疫效力试验:选用口蹄疫病毒特异性抗体和非结构蛋白抗体均为阴性牛6头(4月龄),分成3组,每组两只,分别注射PBS(阴性对照组),E/BIgG(:SEQ ID NO:1+牛IgG重链区),E/BIgG/3D(SEQ ID NO:1+牛IgG重链区+3D蛋白)。免疫牛在一免30天后进行加强免疫。定期采血(免疫前、一免疫后30天及加强后14天),用液相阻断ELISA测定血清抗体效价。如表2所示,多表位重组抗原(E/BIgG/3D)能够诱导高水平保护性中和抗体,尤其是加强免疫后血清抗体水平高达1∶180,具有良好的应用前景。
表2 候选疫苗免疫牛体后血清抗体水平消长规律
序列表
<110>中国农业科学院兰州兽医研究所
<120>牛口蹄疫病毒Asia1型多表位重组疫苗及制备方法
<130>KLPI0877
<160>6
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>288
<212>DNA
<213>artifical sequence
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(288)
<223>
<400>1
tac gga gaa gaa tcc tcg cgg cgt ggt gat ctc gcc gcc ctt gca cgc 48
Tyr Gly Glu Glu Ser Ser Arg Arg Gly Asp Leu Ala Ala Leu Ala Arg
1 5 10 15
aga gtg aac aac cgg ctg ccc act tcc ggt ggc tct agc ggc ggt cgc 96
Arg Val Asn Asn Arg Leu Pro Thr Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Arg
20 25 30
cgt aaa cag gag atc att gca cct gag aaa cag act tgg ggt ggt tct 144
Arg Lys Gln Glu Ile Ile Ala Pro Glu Lys Gln Thr Trp Gly Gly Ser
35 40 45
agc ggc ggt tac gga gaa gaa tcc tcg cgg cgt ggt gat ctc gcc gcc 192
Ser Gly Gly Tyr Gly Glu Glu Ser Ser Arg Arg Gly Asp Leu Ala Ala
50 55 60
ctt gca cgc aga gtg aac aac cgg ctg ccc act tcc ggt ggc tct agc 240
Leu Ala Arg Arg Val Asn Asn Arg Leu Pro Thr Ser Gly Gly Ser Ser
65 70 75 80
ggc ggt cgc cgt aaa cag gag atc att gca cct gag aaa cag act tgg 288
Gly Gly Arg Arg Lys Gln Glu Ile Ile Ala Pro Glu Lys Gln Thr Trp
85 90 95
<210>2
<211>96
<212>PRT
<213>artifical sequence
<400>2
Tyr Gly Glu Glu Ser Ser Arg Arg Gly Asp Leu Ala Ala Leu Ala Arg
1 5 10 15
Arg Val Asn Asn Arg Leu Pro Thr Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Arg
20 25 30
Arg Lys Gln Glu Ile Ile Ala Pro Glu Lys Gln Thr Trp Gly Gly Ser
35 40 45
Ser Gly Gly Tyr Gly Glu Glu Ser Ser Arg Arg Gly Asp Leu Ala Ala
50 55 60
Leu Ala Arg Arg Val Asn Asn Arg Leu Pro Thr Ser Gly Gly Ser Ser
65 70 75 80
Gly Gly Arg Arg Lys Gln Glu Ile Ile Ala Pro Glu Lys Gln Thr Trp
85 90 95
<210>3
<211>1410
<212>DNA
<213>Foot-and-mouth disease virus
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1410)
<223>
<400>3
gga ttg ata gtt gac acc aga gat gtt gag gag cgc gtg cat gtc atg 48
Gly Leu Ile Val Asp Thr Arg Asp Val Glu Glu Arg Val His Val Met
1 5 10 15
cgc aaa acc aag ctc gca ccc act gtg gca cac ggt gtg ttt aac cct 96
Arg Lys Thr Lys Leu Ala Pro Thr Val Ala His Gly Val Phe Asn Pro
20 25 30
gaa ttc ggg cct gcc gcc ttg tcc aac aaa gac ccg cgc ctg gat gaa 144
Glu Phe Gly Pro Ala Ala Leu Ser Asn Lys Asp Pro Arg Leu Asp Glu
35 40 45
gga gtt gtc ctc gat gaa gcc atc ttc tcc aaa cac aag gga gac aca 192
Gly Val Val Leu Asp Glu Ala Ile Phe Ser Lys His Lys Gly Asp Thr
50 55 60
aag atg tct gag gag gac aaa gcg ctg tcc cgc cgc tgc gct gcc gac 240
Lys Met Ser Glu Glu Asp Lys Ala Leu Ser Arg Arg Cys Ala Ala Asp
65 70 75 80
tac gcg tcg cgt ctg cac agc gtg ctg ggt acg gca aac gcc cca ctg 288
Tyr Ala Ser Arg Leu His Ser Val Leu Gly Thr Ala Asn Ala Pro Leu
85 90 95
agc atc tac gag gca att aag ggc gtc gac gga ctt gac gcc atg gaa 336
Ser Ile Tyr Glu Ala Ile Lys Gly Val Asp Gly Leu Asp Ala Met Glu
100 105 110
cca gac acc gcg cct ggt ctt ccc tgg gct ctc cag ggg aaa cgc cgt 384
Pro Asp Thr Ala Pro Gly Leu Pro Trp Ala Leu Gln Gly Lys Arg Arg
115 120 125
ggt gcg ctc att gac ttc gag aac ggc act gtc gga ccc gag gtt aaa 432
Gly Ala Leu Ile Asp Phe Glu Asn Gly Thr Val Gly Pro Glu Val Lys
130 135 140
gct gcc tta gag ctc atg gag aaa aga gag tac aag ttt gca tgc caa 480
Ala Ala Leu Glu Leu Met Glu Lys Arg Glu Tyr Lys Phe Ala Cys Gln
145 150 155 160
acc ttc ctg aag gac gag att cgc ccg atg gaa aag gta cgt gcc ggc 528
Thr Phe Leu Lys Asp Glu Ile Arg Pro Met Glu Lys Val Arg Ala Gly
165 170 175
agg act cgc att gtc gac gcc ttg cct gtt gaa cac att ctt tac acc 576
Arg Thr Arg Ile Val Asp Ala Leu Pro Val Glu His Ile Leu Tyr Thr
180 185 190
agg atg atg att ggc aga ttc tgt gct caa atg cac tca aac aac gga 624
Arg Met Met Ile Gly Arg Phe Cys Ala Gln Met His Ser Asn Asn Gly
195 200 205
ccg caa att ggc tcg gcg gtt ggt tgc aat cct gat gtt gat tgg caa 672
Pro Gln Ile Gly Ser Ala Val Gly Cys Asn Pro Asp Val Asp Trp Gln
210 215 220
aga ttt ggc aca cat ttt gct cag tac aga aac gtg tgg gat gtg gac 720
Arg Phe Gly Thr His Phe Ala Gln Tyr Arg Asn Val Trp Asp Val Asp
225 230 235 240
tat tcg gcc ttt gat gcc aac cac tgc agt gac gca atg aac atc atg 768
Tyr Ser Ala Phe Asp Ala Asn His Cys Ser Asp Ala Met Asn Ile Met
245 250 255
ttt gag gag gtg ttc aac acg gac ttc ggt ttc cac cca aac gct gag 816
Phe Glu Glu Val Phe Asn Thr Asp Phe Gly Phe His Pro Asn Ala Glu
260 265 270
tgg atc ctg aaa act ctc gtg aac act gaa cac gcc tat gag aac aaa 864
Trp Ile Leu Lys Thr Leu Val Asn Thr Glu His Ala Tyr Glu Asn Lys
275 280 285
cgc atc act gtt gag ggc ggg atg cca tct ggt tgt tcc gca aca agc 912
Arg Ile Thr Val Glu Gly Gly Met Pro Ser Gly Cys Ser Ala Thr Ser
290 295 300
atc atc aac aca att ttg aac aat atc tac gtg ctc tac gcc ttg cgt 960
Ile Ile Asn Thr Ile Leu Asn Asn Ile Tyr Val Leu Tyr Ala Leu Arg
305 310 315 320
aga cac tat gag gga gtt gag ctg gac act tac acc atg atc tct tac 1008
Arg His Tyr Glu Gly Val Glu Leu Asp Thr Tyr Thr Met Ile Ser Tyr
325 330 335
gga gac gac atc gtg gtt gca agt gat cac gat ctg gac ttt gag gcc 1056
Gly Asp Asp Ile Val Val Ala Ser Asp His Asp Leu Asp Phe Glu Ala
340 345 350
ctc aag cct cac ttc aaa tcc ctt ggt caa acc atc act cca gcc gac 1104
Leu Lys Pro His Phe Lys Ser Leu Gly Gln Thr Ile Thr Pro Ala Asp
355 360 365
aaa agc gac aaa ggt ttt gtt ctt ggt cac tcc atc acc gat gtc act 1152
Lys Ser Asp Lys Gly Phe Val Leu Gly His Ser Ile Thr Asp Val Thr
370 375 380
ttc ctc aaa aga cac ttt cac atg gat tat gga act ggg ttt tac aaa 1200
Phe Leu Lys Arg His Phe His Met Asp Tyr Gly Thr Gly Phe Tyr Lys
385 390 395 400
cct gtg atg gct tcg aag acc ctc gag gct atc ctc tcc ttt gca cgc 1248
Pro Val Met Ala Ser Lys Thr Leu Glu Ala Ile Leu Ser Phe Ala Arg
405 410 415
cgt ggg acc ata cag gag aag ttg atc tcc gtg gca gga ctc gcc gtc 1296
Arg Gly Thr Ile Gln Glu Lys Leu Ile Ser Val Ala Gly Leu Ala Val
420 425 430
cac tct gga cct gac gag tac cgg cgt ctc ttt gag cct ttc cag ggc 1344
His Ser Gly Pro Asp Glu Tyr Arg Arg Leu Phe Glu Pro Phe Gln Gly
435 440 445
ctc ttt gag att cca agc tac aga tca ctt tac ctg cgt tgg gtg aac 1392
Leu Phe Glu Ile Pro Ser Tyr Arg Ser Leu Tyr Leu Arg Trp Val Asn
450 455 460
gcc gtg tgc ggt gac gca 1410
Ala Val Cys Gly Asp Ala
465 470
<210>4
<211>470
<212>PRT
<213>Foot-and-mouth disease virus
<400>4
Gly Leu Ile Val Asp Thr Arg Asp Val Glu Glu Arg Val His Val Met
1 5 10 15
Arg Lys Thr Lys Leu Ala Pro Thr Val Ala His Gly Val Phe Asn Pro
20 25 30
Glu Phe Gly Pro Ala Ala Leu Ser Asn Lys Asp Pro Arg Leu Asp Glu
35 40 45
Gly Val Val Leu Asp Glu Ala Ile Phe Ser Lys His Lys Gly Asp Thr
50 55 60
Lys Met Ser Glu Glu Asp Lys Ala Leu Ser Arg Arg Cys Ala Ala Asp
65 70 75 80
Tyr Ala Ser Arg Leu His Ser Val Leu Gly Thr Ala Asn Ala Pro Leu
85 90 95
Ser Ile Tyr Glu Ala Ile Lys Gly Val Asp Gly Leu Asp Ala Met Glu
100 105 110
Pro Asp Thr Ala Pro Gly Leu Pro Trp Ala Leu Gln Gly Lys Arg Arg
115 120 125
Gly Ala Leu Ile Asp Phe Glu Asn Gly Thr Val Gly Pro Glu Val Lys
130 135 140
Ala Ala Leu Glu Leu Met Glu Lys Arg Glu Tyr Lys Phe Ala Cys Gln
145 150 155 160
Thr Phe Leu Lys Asp Glu Ile Arg Pro Met Glu Lys Val Arg Ala Gly
165 170 175
Arg Thr Arg Ile Val Asp Ala Leu Pro Val Glu His Ile Leu Tyr Thr
180 185 190
Arg Met Met Ile Gly Arg Phe Cys Ala Gln Met His Ser Asn Asn Gly
195 200 205
Pro Gln Ile Gly Ser Ala Val Gly Cys Asn Pro Asp Val Asp Trp Gln
210 215 220
Arg Phe Gly Thr His Phe Ala Gln Tyr Arg Asn Val Trp Asp Val Asp
225 230 235 240
Tyr Ser Ala Phe Asp Ala Asn His Cys Ser Asp Ala Met Asn Ile Met
245 250 255
Phe Glu Glu Val Phe Asn Thr Asp Phe Gly Phe His Pro Asn Ala Glu
260 265 270
Trp Ile Leu Lys Thr Leu Val Asn Thr Glu His Ala Tyr Glu Asn Lys
275 280 285
Arg Ile Thr Val Glu Gly Gly Met Pro Ser Gly Cys Ser Ala Thr Ser
290 295 300
Ile Ile Asn Thr Ile Leu Asn Asn Ile Tyr Val Leu Tyr Ala Leu Arg
305 310 315 320
Arg His Tyr Glu Gly Val Glu Leu Asp Thr Tyr Thr Met Ile Ser Tyr
325 330 335
Gly Asp Asp Ile Val Val Ala Ser Asp His Asp Leu Asp Phe Glu Ala
340 345 350
Leu Lys Pro His Phe Lys Ser Leu Gly Gln Thr Ile Thr Pro Ala Asp
355 360 365
Lys Ser Asp Lys Gly Phe Val Leu Gly His Ser Ile Thr Asp Val Thr
370 375 380
Phe Leu Lys Arg His Phe His Met Asp Tyr Gly Thr Gly Phe Tyr Lys
385 390 395 400
Pro Val Met Ala Ser Lys Thr Leu Glu Ala Ile Leu Ser Phe Ala Arg
405 410 415
Arg Gly Thr Ile Gln Glu Lys Leu Ile Ser Val Ala Gly Leu Ala Val
420 425 430
His Ser Gly Pro Asp Glu Tyr Arg Arg Leu Phe Glu Pro Phe Gln Gly
435 440 445
Leu Phe Glu Ile Pro Ser Tyr Arg Ser Leu Tyr Leu Arg Trp Val Asn
450 455 460
Ala Val Cys Gly Asp Ala
465 470
<210>5
<211>993
<212>DNA
<213>
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(993)
<223>
<400>5
gcc tca aca aca ccc ccg aaa gtc tac cct ctg act tct tgc tgc ggg 48
Ala Ser Thr Thr Pro Pro Lys Val Tyr Pro Leu Thr Ser Cys Cys Gly
1 5 10 15
gac acg tcc agc tcc atc gtg acc ctg ggc tgc ctg gtc tcc agc tat 96
Asp Thr Ser Ser Ser Ile Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr
20 25 30
atg ccc gag ccg gtg acc gtg acc tgg aac tct ggt gcc ctg acc agc 144
Met Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
ggc gtg cac acc ttc ccg gcc atc ctg cag tcc tcc ggg ctc tac tct 192
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Ile Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccg gcc agc acc tca gga gcc cag acc 240
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ala Ser Thr Ser Gly Ala Gln Thr
65 70 75 80
ttc atc tgc aac gta gcc cac ccg gcc agc agc acc aag gtg gac aag 288
Phe Ile Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
cgt gtt gag ccc gga tgc ccg gac cca tgc aaa cat tgc cga tgc cca 336
Arg Val Glu Pro Gly Cys Pro Asp Pro Cys Lys His Cys Arg Cys Pro
100 105 110
ccc cct gag ctc ccc gga gga ccg tct gtc ttc atc ttc cca ccg aaa 384
Pro Pro Glu Leu Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
115 120 125
ccc aag gac acc ctt aca atc tct gga acg ccc gag gtc acg tgt gtg 432
Pro Lys Asp Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
gtg gtg gac gtg ggc cag gat gac ccc gag gtg cag ttc tcc tgg ttc 480
Val Val Asp Val Gly Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe
145 150 155 160
gtg gac aac gtg gag gtg cgc acg gcc agg aca aag ccg aga gag gag 528
Val Asp Asn Val Glu Val Arg Thr Ala Arg Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
cag ttc aac agc acc ttc cgc gtg gtc agc gcc ctg ccc atc cag cac 576
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His
180 185 190
caa gac tgg act gga gga aag gag ttc aag tgc aag gtc cac aac gaa 624
Gln Asp Trp Thr Gly Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Glu
195 200 205
ggc ctc ccg gcc ccc atc gtg agg acc atc tcc agg acc aaa ggg cag 672
Gly Leu Pro Ala Pro Ile Val Arg Thr Ile Ser Arg Thr Lys Gly Gln
210 215 220
gcc cgg gag ccg cag gtg tac gtc ctg gcc cca ccc cag gaa gag ctc 720
Ala Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu
225 230 235 240
agc aaa agc acg ctc agc gtc acc tgc ctg gtc acc ggc ttc tac cca 768
Ser Lys Ser Thr Leu Ser Val Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
gac tac atc gcc gtg gag tgg cag aaa aat ggg cag cct gag tcg gag 816
Asp Tyr Ile Ala Val Glu Trp Gln Lys Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu
260 265 270
gac aag tac ggc acg acc aca tcc cag ctg gac gcc gac ggc tcc tac 864
Asp Lys Tyr Gly Thr Thr Thr Ser Gln Leu Asp Ala Asp Gly Ser Tyr
275 280 285
ttc ctg tac agc agg ctc agg gtg gac aag aac agc tgg caa gaa gga 912
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Arg Val Asp Lys Asn Ser Trp Gln Glu Gly
290 295 300
gac acc tac gcg tgt gtg gtg atg cac gag gct ctg cac aac cac tac 960
Asp Thr Tyr Ala Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
305 310 315 320
aca cag aag tcg atc tct aag cct ccg ggt aaa 993
Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys Pro Pro Gly Lys
325 330
<210>6
<211>331
<212>PRT
<213>
<400>6
Ala Ser Thr Thr Pro Pro Lys Val Tyr Pro Leu Thr Ser Cys Cys Gly
1 5 10 15
Asp Thr Ser Ser Ser Ile Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Met Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Ile Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ala Ser Thr Ser Gly Ala Gln Thr
65 70 75 80
Phe Ile Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Gly Cys Pro Asp Pro Cys Lys His Cys Arg Cys Pro
100 105 110
Pro Pro Glu Leu Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Gly Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe
145 150 155 160
Val Asp Asn Val Glu Val Arg Thr Ala Arg Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His
180 185 190
Gln Asp Trp Thr Gly Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Glu
195 200 205
Gly Leu Pro Ala Pro Ile Val Arg Thr Ile Ser Arg Thr Lys Gly Gln
210 215 220
Ala Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu
225 230 235 240
Ser Lys Ser Thr Leu Ser Val Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Asp Tyr Ile Ala Val Glu Trp Gln Lys Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu
260 265 270
Asp Lys Tyr Gly Thr Thr Thr Ser Gln Leu Asp Ala Asp Gly Ser Tyr
275 280 285
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Arg Val Asp Lys Asn Ser Trp Gln Glu Gly
290 295 300
Asp Thr Tyr Ala Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
305 310 315 320
Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys Pro Pro Gly Lys
325 330
机译: 表达RNA病毒抗原表位的重组麻疹病毒以及重组病毒在制备疫苗组合物中的用途
机译: 表达RNA病毒抗原表位的重组麻疹病毒和重组病毒在制备疫苗组合物中的用途
机译: 表达RNA病毒抗原表位的重组麻疹病毒和重组病毒在制备疫苗组合物中的用途