以纤维蛋白原为基础的三维多孔纳米支架及其制备方法

摘要

本发明提供了一种以纤维蛋白原为基础的三维多孔纳米支架及其制备方法。所述的以纤维蛋白原为基础的三维多孔纳米支架，其特征在于，由纤维蛋白原以及聚乳酸/聚己内酯共聚物制成。其制备方法为：配制纤维蛋白原液和聚乳酸/聚己内酯原液；静电纺丝；以及后处理。本发明具有良好的比表面积、高孔隙率、空隙相连性好等特点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种以纤维蛋白原为基础的三维多孔纳米支架及其制备方法，属于医学组织工程领域。

背景技术

组织工程是20世纪80年代提出的新型交叉学科，它主要是利用生物科学和工程学原理，开发用于修复、重建和维持受损组织和器官结构和功能的科学。组织工程的研究主要集中在三维支架的构建和种子细胞选择领域。理想的组织工程支架应具有以下特点：(1)良好的生物相容性，表面微结构和生物特性有利于种子细胞的黏附与增殖；(2)适当的机械性能，符合替代部位组织器官的力学性能；(3)特定的生物可降解性，生物材料的降解速率必须与种子细胞合成细胞基质的速率相互匹配；(4)类似于天然细胞外基质的三维结构和生物学功能，有利于种子生长和分泌细胞外基质；(5)生物材料及其降解产物在体内不引起炎症反应和产生毒副作用，从而保证组织工程器官构建成功。目前应用于构建组织工程支架的可降解生物材料主要有两类，即天然生物材料和人工合成的高分子材料。天然材料一般都具有清水、生物相容性及细胞亲和性好的特点，但缺点是力学性能差、降解速度快、加工性能差。人工合成的高分子材料不仅具有良好的物理机械性能，而且易于加工，比较容易地进行批量生产并且可以根据特殊用途改变其特点，可通过改变工艺调节降解速度；但人工合成材料多为疏水性，不利于种子细胞的黏附与增殖。因此将两者混合，理论上就克服了两者的不足，构建的组织工程支架具有良好的应用前景。

纤维蛋白原是参与凝血过程后期阶段的一个血浆糖蛋白。在凝血过程中，纤维蛋白原在凝血酶的作用下水解转变成纤维蛋白，最终形成血凝块。纤维蛋白原不仅参与凝血功能，其在创伤修复和肿瘤生长过程中也发挥了作用，近年来作为组织工程支架的优势逐渐引起人们的重视。纤维蛋白原来源广泛，不仅可以从自身获得，而且可以从哺乳动物身上获得。目前纤维蛋白原主要是以胶体形式(纤维蛋白胶)在促进伤口愈合、封闭组织缺损、防止组织粘连等方面获得广泛应用，并且已显示其有良好的组织相容性。在组织工程中，纤维蛋白原是一种生物活性材料，可作为细胞生长的支架材料，其主要采用其胶体形式应用于组织工程支架，但以纯纤维蛋白胶构建的组织工程支架还缺乏足够的机械强度，在体内还不能够抵抗生理性的动态环境，难以满足组织工程支架的需求；而且以纤维蛋白胶构建组织工程支架多需要种子细胞与纤维蛋白原混合后再形成纤维蛋白胶，不利与支架的消毒与大规模应用。

合成材料，如：聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸/聚己内酯等，凭借其良好的力学性能、组织相容性、可控的生物降解性和易加工成型性能在组织工程中得到了广泛的应用。但是这些合成材料缺乏生物活性。将这些具有合成材料与具有生物活性的纤维蛋白原复合是构建具有良好生物活性、适宜机械强度组织工程支架的一条行之有效的途径。

天然细胞外基质呈纳米级构造，利用不同纳米技术构建组织工程器官是组织工程发展的新趋势。为构建与细胞外基质相类似的纳米三维结构，已有研究者采用了不同的实验方法。如：分子自组装技术，相分离技术及静电纺丝技术。其中，静电纺丝技术制备的无纺纤维膜具有高比表面积、高孔隙率、孔隙相连性好等特点，与正常组织细胞外基质的结构非常类似，有利于细胞的黏附吸附和生长。而且，静电纺丝具有使用简便快捷、成本低廉、结构可控等优点。现有文献中未见以静电纺丝方式生产以纤维蛋白原为基础的三维多孔纳米支架的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种三维多孔纳米支架及其制备方法，所述支架具有良好的生物活性，适宜的机械强度，可控的降解速率，可用来替代各种原因造成的弹性组织缺失。

为实现上述目的，本发明提供了一种以纤维蛋白原为基础的三维多孔纳米支架，其特征在于，由纤维蛋白原以及聚乳酸/聚己内酯共聚物制成。

所述纤维蛋白原与聚乳酸/聚己内酯共聚物的质量比为1∶5～12∶5。

所述聚乳酸/聚己内酯共聚物中聚乳酸与聚己内酯的质量比为5∶5～8∶2。

所述聚乳酸/聚己内酯共聚物的分子量为5万～30万。

本发明还提供了上述以纤维蛋白原为基础的三维多孔纳米支架的制备方法，其特征在于，具体步骤为：

第一步：将纤维蛋白原溶解在由体积比为9∶1的六氟异丙醇和10×DMEM培养基混合而成的溶剂中制备成质量分数为80～120mg/ml的纤维蛋白原液；

第二步：将聚乳酸/聚己内酯共聚物溶解在六氟异丙醇、三氯甲烷、二甲基甲酰胺、四氢呋喃和丙酮中的一种或两种以上的混合溶剂中制备质量分数为5～10％的聚乳酸/聚己内酯原液；

第三步：将纤维蛋白原液与聚乳酸/聚己内酯原液混匀后加入静电纺丝机的同一容量管中进行静电纺丝，纺丝电压为0.5～3kv/纺丝距离cm，纺丝液推进速度0.5～4ml/h，在接收装置上得到膜状或管状的三维多孔纳米支架；

或者，将纤维蛋白原液和聚乳酸/聚己内酯原液分别加入到静电纺丝机上两不同的容量管中，将两容量管中的不同原液同时进行静电纺丝，纺丝电压为0.5～3kv/纺丝距离cm，纺丝液推进速度0.5～4ml/h，在接收装置上得到膜状或管状的三维多孔纳米支架；

第四步：将三维多孔纳米支架真空干燥以除去支架中的残留有机溶剂，以环氧乙烷或γ射线消毒。

本发明技术方案中，根据目的组织工程支架所需的力学强度和降解速度，可通过选用不同质量比的聚乳酸/聚己内酯聚合物，以及通过改变纤维蛋白原与聚乳酸/聚己内酯两种材料的浓度和组成比例来获得适宜的机械强度和降解速度，同时具有良好的生物学性能。纤维蛋白原可来自于人、哺乳动物(如：牛、猪)，纤维蛋白原经提取冻干后呈粉末状。

本发明所构建的三维多孔纳米支架的纤维直径为200-800nm，孔隙率为65-85％。

与现有构建的组织工程支架相比，本发明具有以下显著的有益效果：

1.本发明所构建的组织工程支架具有与细胞外基质相类似的纳米纤维结构，并具有良好的比表面积、高孔隙率、空隙相连性好等特点，有利于种子细胞的生长与迁移，易于种子细胞的代谢交换。

2.本发明构建的组织工程支架具有良好的生物活性，能为种子细胞提供良好的生活坏境，有利于种子细胞的粘附、增殖和分化，易于种子细胞分泌细胞外基质，最终完好替代缺损组织。

3.本发明构建的组织工程支架具有良好的机械强度和弹性，能够满足作为各种弹性组织支架的力学要求。并可通过改变原材料的浓度以及混合比例来调整组织工程的力学性能，从而满足不同弹性组织各种不同的力学性能要求。

4.本发明构建的组织工程支架，可通过改变高分子聚合物的成分来调节支架的降解速度，从而满足自体组织器官的再生速度，。

5.本发明所使用的静电纺丝技术操作方便，制备工艺简单，根据接收装置形状不同可以制备管状、膜状等不同形态支架，满足不同组织形态需要。

附图说明

图1为以纤维蛋白原为基础的三维多孔纳米支架的表面形态的扫描电镜图片。

具体实施方式

下面结合实施例来具体说明本发明。

实施例1

第一步：将纤维蛋白原溶解在由体积比为9∶1的六氟异丙醇和10×DMEM培养基混合而成的溶剂中制备成质量分数为100mg/ml的纤维蛋白原液；

第二步：将聚乳酸/聚己内酯共聚物(聚乳酸/聚己内酯的重量比为7∶3，分子量为15万)溶解在六氟异丙醇中制备质量分数为8％的聚乳酸/聚己内酯原液；

第三步：将纤维蛋白原液与聚乳酸/聚己内酯原液按体积比1∶4混匀后加入静电纺丝机的同一容量管中进行静电纺丝，纺丝电压为2kv/纺丝距离cm，纺丝距离12cm，纺丝液推进速度3ml/h，在接收装置(转速500rpm、外径约0.5cm的钢管)上得到直径0.5cm，长度为10cm的管状的三维多孔纳米支架；

第四步：将三维多孔纳米支架真空干燥24小时以除去支架中的残留有机溶剂，以环氧乙烷消毒，所得支架中纤维蛋白原与聚乳酸/聚己内酯共聚物的质量比为5∶16，支架中纤维直径450nm，孔隙率60％。拉伸强度11MPa。如图1所示，为以纤维蛋白原为基础的三维多孔纳米支架的表面形态的扫描电镜图片，纤维呈无序状态、形态均一，未见纺锤形的珠滴形成。

实施例2

第一步：将纤维蛋白原溶解在由体积比为9∶1的六氟异丙醇和10×DMEM培养基混合而成的溶剂中制备成质量分数为80mg/ml的纤维蛋白原液；

第二步：将聚乳酸/聚己内酯共聚物(聚乳酸/聚己内酯的重量比为5∶5，分子量为5万)溶解在三氯甲烷中制备质量分数为5％的聚乳酸/聚己内酯原液；

第三步：将纤维蛋白原液与聚乳酸/聚己内酯原液按体积比1∶2混匀后加入静电纺丝机的同一容量管中进行静电纺丝，纺丝电压为0.5kv/纺丝距离cm，纺丝距离12cm，纺丝液推进速度0.5ml/h，在接收装置(转速500rpm、外径约0.5cm的钢管)上得到直径0.5cm，长度为10cm管状的三维多孔纳米支架；

第四步：将三维多孔纳米支架真空干燥24h以除去支架中的残留有机溶剂，以γ射线消毒。所得支架中纤维蛋白原与聚乳酸/聚己内酯共聚物的质量比为4∶5，支架中纤维直径280nm，孔隙率72％。拉伸强度7.5MPa。

实施例3

第一步：将纤维蛋白原溶解在由体积比为9∶1的六氟异丙醇和10×DMEM培养基混合而成的溶剂中制备成质量分数为120mg/ml的纤维蛋白原液；

第二步：将聚乳酸/聚己内酯共聚物(聚乳酸/聚己内酯的重量比为8∶2，分子量为30万)溶解在二甲基甲酰胺中制备质量分数为10％的聚乳酸/聚己内酯原液；

第三步：将纤维蛋白原液与聚乳酸/聚己内酯原液按体积比1∶1混匀后加入静电纺丝机的同一容量管中进行静电纺丝，纺丝电压为3kv/纺丝距离cm，纺丝距离12cm，纺丝液推进速度4ml/h，在接收装置(5cm×10cm平整钢板)上得到5cm×10cm的膜状的三维多孔纳米支架；

第四步：将三维多孔纳米支架真空干燥24小时以除去支架中的残留有机溶剂，以环氧乙烷消毒，所得支架中纤维蛋白原与聚乳酸/聚己内酯共聚物的质量比为6∶5，支架纤维直径650nm，孔隙率65％。拉伸强度10.2MPa。

实施例4

第一步：将纤维蛋白原溶解在由体积比为9∶1的六氟异丙醇和10×DMEM培养基混合而成的溶剂中制备成质量分数为100mg/ml的纤维蛋白原液；

第二步：将聚乳酸/聚己内酯共聚物(聚乳酸/聚己内酯的重量比为7∶3，分子量为15万)溶解在四氢呋喃中制备质量分数为8％的聚乳酸/聚己内酯原液；

第三步：将等体积纤维蛋白原液和聚乳酸/聚己内酯原液分别加入到静电纺丝机上两不同的容量管中，将两容量管中的不同原液同时进行静电纺丝，静电纺丝参数设置相同，纺丝电压为0.5kv/纺丝距离cm，纺丝距离12cm，纺丝液推进速度0.5ml/h，在接收装置(转速500rpm、外径约0.5cm的钢管)上得到直径0.5cm，长度为10cm管状的三维多孔纳米支架；

第四步：将三维多孔纳米支架真空干燥24小时以除去支架中的残留有机溶剂，以环氧乙烷消毒，所得支架支架中纤维蛋白原与聚乳酸/聚己内酯共聚物的质量比为5∶4，纤维直径520nm，孔隙率68％。拉伸强度8.6MPa。

实施例5

第一步：将纤维蛋白原溶解在由体积比为9∶1的六氟异丙醇和10×DMEM培养基混合而成的溶剂中制备成质量分数为80mg/ml的纤维蛋白原液；

第二步：将聚乳酸/聚己内酯共聚物(聚乳酸/聚己内酯的重量比为7∶3，分子量为15万)溶解在丙酮中制备质量分数为10％的聚乳酸/聚己内酯原液；

第三步：将体积比为1∶4的纤维蛋白原液和聚乳酸/聚己内酯原液分别加入到静电纺丝机上两不同的容量管中，将两容量管中的不同原液同时进行静电纺丝，纤维蛋白原纺丝液推进速度0.75ml/h，聚乳酸/聚己内酯纺丝液推进速度3ml/h，其余参数设置相同，纺丝电压为2kv/纺丝距离cm，纺丝距离12cm，在接收装置上(5cm×10cm平整钢板)得到膜状的三维多孔纳米支架；

第四步：将三维多孔纳米支架真空干燥24小时以除去支架中的残留有机溶剂，以环氧乙烷消毒，所得支架中纤维蛋白原与聚乳酸/聚己内酯共聚物的质量比为1∶5，支架纤维直径760nm，孔隙率65％。拉伸强度13.6MPa。

实施例6

第一步：将纤维蛋白原溶解在由体积比为9∶1的六氟异丙醇和10×DMEM培养基混合而成的溶剂中制备成质量分数为120mg/ml的纤维蛋白原液；

第二步：将聚乳酸/聚己内酯共聚物(聚乳酸/聚己内酯的重量比为7∶3，分子量为15万)溶解在体积比为1∶1的二甲基甲酰胺与丙酮的混合溶剂中制备质量分数为5％的聚乳酸/聚己内酯原液；

第三步：将等体积纤维蛋白原液和聚乳酸/聚己内酯原液分别加入到静电纺丝机上两不同的容量管中，将两容量管中的不同原液同时进行静电纺丝，静电纺丝参数设置相同，纺丝电压为3kv/纺丝距离cm，纺丝距离12cm，纺丝液推进速度3ml/h，在接收装置上(5cm×10cm平整钢板)得到膜状的三维多孔纳米支架；

第四步：将三维多孔纳米支架真空干燥24小时以除去支架中的残留有机溶剂，以环氧乙烷消毒，所得支架中纤维蛋白原与聚乳酸/聚己内酯共聚物的质量比为12∶5，支架纤维直径280nm，孔隙率74％。拉伸强度6.8MPa。

同样，分别以纯100mg/ml纤维蛋白原原液和纯8％聚乳酸/聚己内酯原液进行静电纺丝，静电纺丝设置参数同实施例1，纺丝电压为2kv/纺丝距离cm，纺丝距离12cm，纺丝液推进速度3ml/h，在接收装置(转速500rpm、外径约0.5cm的钢管)上得到直径0.5cm，长度为10cm的管状的三维多孔纳米支架。所得纤维蛋白原支架纤维直径220nm，孔隙率76％。拉伸强度1.4MPa；聚乳酸/聚己内酯支架纤维直径460nm，孔隙率54％，拉伸强度8.1MPa。以人脐静脉内细胞皮分别种植于纯纤维蛋白原支架、纯聚乳酸/聚己内酯支架和实施例1所得支架的表面，培养一周后测得支架表面脐静脉内皮细胞增殖速率分别为3.5、0.2及3.2倍。