逍遥散抗抑郁症有效部位及其提取方法

摘要

本发明提供了逍遥散抗抑郁症的有效部位及其提取方法，按逍遥散处方重量比例称取柴胡、当归、茯苓、白芍、白术、炙甘草、薄荷、生姜，加无水乙醇回流提取，过滤，滤液浓缩至浸膏，真空干燥，粉碎得醇提物；醇提物加石油醚，超声提取，浓缩，干燥，粉碎得有效部位A；将石油醚提取后的残渣干燥、粉碎、加蒸馏水溶解，过D101大孔吸附树脂柱，依次用60％、95％乙醇洗脱，收集95％洗脱液、浓缩、干燥得有效部位B4。本发明的有效部位与原逍遥散复方相比，抗抑郁活性明显提高，而且可减少服用量，增强药物顺应性，方便贮藏和运输；其抗抑郁活性达到或超过现有临床常用的抗抑郁症西药。

说明书

技术领域

本发明涉及中药有效部位，具体属于逍遥散抗抑郁症有效部位及其提取方法。

背景技术

抑郁症是一种常见的精神疾病，具有发病率高、复发率高和高致残的特点。据WHO预测：到2020年，单项抑郁症将成为第二大致残性疾病，其危害已越来越引起医药卫生界的重视。

逍遥散为经典名方，至今已有近千年的应用历史。现代临床与药理研究已证实其具有明显的抗抑郁作用，且未发现毒副作用。目前虽有散剂、丸剂、浓缩丸、颗粒剂等多种剂型，但这些药品均以药材为原料，经简单加工，无效成分多，服药剂量大，顺应性差等缺陷。

发明内容

本发明的目的是提供逍遥散抗抑郁症的有效部位。采用现代提取分离技术，以逍遥散整体复方为原料，提取并筛选出药效物质含量高，且药理活性优于或相当于原方的有效部位，进一步以有效部位为组分制成的制剂，与现有制剂相比，可减少服用量，增强药物顺应性，方便贮藏和运输。

本发明提供的逍遥散抗抑郁症有效部位，通过如下提取方法制得：按重量份数称取柴胡20-40，白术25-35，白芍25-35，当归25-35，茯苓25-35，甘草10-20，薄荷5-15，生姜5-15；优选柴胡30，白术30，白芍30，当归30，茯苓30，甘草15，薄荷10，生姜10；粉碎后按每克药材加6-10毫升的无水乙醇，加热回流提取2-3次，每次1-2h，合并提取液，过滤，滤液浓缩至浸膏，60℃真空干燥，粉碎得醇提物；醇提物加沸点为60-90℃的石油醚，超声提取2-3次，每次0.5-1h，过滤，合并滤液，回收溶剂，浓缩至浸膏，60℃真空干燥，粉碎得部位A；将石油醚提取过滤后的残渣，经60℃真空干燥，粉碎得部位B；将部位B用蒸馏水溶解，过D101大孔吸附树脂柱，分别用60％、95％乙醇洗脱，将95％乙醇洗脱液浓缩、干燥得部位B₄。药理实验证明部位A和部位B₄具有明显的抗抑郁活性。

与现有技术相比，以本发明制备的抗抑郁症中药有效部位的药理活性达到或超过原有制剂，且进一步制成的制剂可减少服用量，增强药物顺应性，还方便贮藏和运输。

附图说明

图1逍遥散各部位提取、分离流程图

具体实施方式

实施例1

1)逍遥散各提取部位的制备

逍遥散复方12kg粉碎，加无水乙醇10升加热回流提取2次(每次2h)，合并提取液，过滤，滤液浓缩至浸膏，置真空干燥箱中(60℃)烘干，粉碎得醇提物；醇提物加石油醚(60-90℃)，超声提取3次(每次30min)，合并石油醚提取液，回收溶剂，浓缩至浸膏，置真空干燥箱中(60℃)烘干，粉碎得部位A；将石油醚提取后的残渣置真空干燥箱中(60℃)烘干，粉碎得部位B。部位B用蒸馏水溶解，过D101大孔吸附树脂柱，依次用10％、30％、60％、95％乙醇洗脱，洗脱液分别浓缩、干燥得部位B₁、B₂、B₃、B₄。将复方乙醇提取后的药渣加水回流提取2次(每次2h)，趁热过滤，合并滤液，减压浓缩至浸膏，置真空干燥箱中(60℃)烘干，粉碎得部位C。部位C加蒸馏水溶解，过D101大孔吸附树脂柱，依次用水、50％乙醇洗脱，洗脱液分别浓缩、干燥得部位C₁、C₂。各部位的提取、分离流程图如图1所示。

2)对照药物的制备：

逍遥散水煎物制备

逍遥散复方3kg粉碎，水煎煮3次，1h/次，趁热过滤，合并滤液，减压浓缩至浸膏，置真空干燥箱中(60℃)烘干，粉碎得水煎物。

逍遥散散剂制备

为方便给药，散剂组采用如下方法制得：逍遥散复方3kg粉碎，经无水乙醇加热回流提取2次(每次2h)，合并提取液，过滤，滤液浓缩至浸膏；药渣加水加热回流2次(每次2h)，合并提取液，过滤，滤液浓缩至浸膏；两部分浸膏置真空干燥箱中(60℃)烘干，粉碎混匀得提取物作为散剂组实验样品。

实施例2逍遥散各分离部位指纹图谱研究

为减少后期药效评价的工作量，对逍遥散各分离部位进行指纹图谱研究，发现部位B₂中大部分成分分别和部位B₁、B₃交叉，故不对部位B₂进行体外活性筛选。

实施例3药物各分离部位体外活性筛选

对上述提取、分离的各部位进行了对大鼠脑突触体摄取5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NA)和多巴胺(DA)是否有抑制作用的体外筛选研究。具体方法和结果如下：

1动物

品系：SD大鼠，性别：雄性，体重：200-220g，来源：上海斯莱克实验动物责任有限公司，动物合格证号：SCXK(沪)2007-0005，饲养：SPF级动物房常规饲养

2供试样品

部位C、C₁、C₂及逍遥散水煎物分别溶于双蒸水中，部位A、B、B₁、B₃、B₄分别溶于10％DMSO(二甲基亚砜，一种药理常用溶剂)，配制成1mg/ml的溶液，然后再稀释100倍使浓度为10μg/ml。

3对照药物

I.名称：盐酸氟西汀1.73mg→0.5ml双蒸水，终反应浓度：0.1mM(100％抑制了³H-5-HT的再摄取)

II.名称：地西帕明1.51mg→0.5ml双蒸水，终反应浓度：0.1mM(100％抑制了³H-NA的再摄取)

III.名称：6-羟DA 1.03mg→0.5ml双蒸水，终反应浓度：0.1mM(100％抑制了³H-DA的再摄取)

4实验方法

4.1脑突触体的制备

4.1.15-HT和NA能脑突触体的制备

大鼠断头后迅速取出大脑，置于预冷(4℃)的生理盐水中，去除软脑膜及血管组织。取3g大脑皮层，放入到30ml 0.32M的冷蔗糖溶液中。用超声波细胞粉碎器匀浆(保持低温)，4℃平衡离心(1500g，10min)，随后取上清液离心(20000g，30min)。弃取上清液，留用沉淀，即突触小体的粗提物。此沉淀部分再用0.32M的冷蔗糖溶液悬浮后小心铺在已由管底依次铺上1.2M和0.8M(各10ml)的冷蔗糖梯度溶液上，4℃平衡离心(38000g)60min。用穿刺针小心收集0.8-1.2M蔗糖界面处的悬浮带，置于10ml 0.32M的冷蔗糖溶液中混匀，4℃平衡离心(20000g)30min)，沉淀物即为精制的脑突触体。将沉淀物悬浮于少量Tris-Krebs缓冲液(Tris：15mM；NaCl：94.7mM；KCl：4.7mM；CaCl₂：0.5mM；MgSO₄：2.4mM；NaH₂PO₄：1.2mM；Glucose：10.6mM；Ascorbic：0.57mM；Pargyline：0.01mM)中，用总蛋白测定试剂盒测定悬液中的蛋白含量。

4.1.2DA能脑突触体的制备

大鼠断头后迅速取出大脑，置于预冷(4℃)的生理盐水中，去除软脑膜及血管组织。取2g大脑去皮层后的剩余脑组织，放入到20ml 0.32M的冷蔗糖溶液中。用超声波细胞粉碎器匀浆(保持低温)，4℃平衡离心(1500g，10min)，随后取上清液离心(20000g)30min。弃取上清液，留用沉淀，即突触小体的粗提物。将沉淀物悬浮于少量Tris-Krebs缓冲液中，用总蛋白测定试剂盒测定悬液中的蛋白含量。

4.2单胺的再摄取

试管中先加入1.0ml Tris-Krebs缓冲液(预先通氧15min)，随后加入20μl突触小体悬液，然后加入对照样品或待测药物10μl(均于4℃环境中操作)，混合均匀，37℃水浴中温浴5min。于4℃环境中加入10μl底物(³H-5HT、³H-NA或³H-DA；终反应浓度：300nM)，混匀，37℃水浴中温浴5min。随后每管加入3ml予冷的Tris-Krebs缓冲液终止反应，并迅速用多头细胞收集器通过玻璃纤维滤膜抽滤，再用同体积的相同溶液冲洗试管和滤器2次。取下滤膜，60-70℃烘干，将滤膜放入闪烁瓶内，加入甲苯闪烁液，于β-液闪计数器计数。空白、37℃、及不同的药物浓度均为3复管。突触体的净摄取量：37℃的cpm值(主动再摄取)减去0℃的cpm值(非特异性聚集)。

阳性对照药(氟西汀、地西帕明、6-羟多巴)的终反应浓度均为0.1mM。在此浓度之下，阳性对照药可以100％的抑制大鼠脑突触体对5-HT、NA和DA的再摄取。因此，以0.1mM为阳性对照药的终反应作用浓度，待测样品的抑制作用和相应的阳性对照药进行比较进行抑制作用的筛选。

5结果

10μg/ml作为筛选的终反应浓度。结果见表1。

表1.中药提取物对大鼠脑突触体摄取5-HT、NA和DA的抑制作用

6初步结论：

体外单胺类神经递质的再摄取抑制实验显示，部位A和B₄能有效抑制5-HT、NA的再摄取行为，抑制率高于传统复方水煎物，对NA的抑制效果甚至高于地西帕明。

实施例4各部位绝望模型体内活性筛选

(一)有效部位A的抗抑郁作用体内活性验证及剂量筛选

根据体外活性筛选的结果，在本实施例中采用体内模型验证有效部位A的活性并筛选最佳体内服用剂量。

药物配制：部位A溶于0.5％吐温80(w/v)1％cmc-Na溶液，分别配成3mg/ml、6mg/ml、12mg/ml、36mg/ml、80mg/ml浓度的药液。

实验方法：小鼠悬尾实验；小鼠强迫游泳实验。

实验动物、分组及给药剂量：

昆明种小白鼠(雄性)20+2g，每组10只。空白组每天给0.5％吐温80(w/v)1％cmc-Na溶液0.2mL/10g，阳性组每天给文拉法辛50mg/kg，其他组给药剂量按表2所示。

表2有效部位A小鼠悬尾和强迫游泳实验的分组与给药剂量

                                                                          

实验分组                        剂量(日次)

                                                                          

空白组                          0.2mL/10g

(0.5％吐温80(w/v)1％cmc-Na溶液)

阳性对照组(文拉法辛)            50mg/Kg

部位A剂量1                      60mg/Kg(相当于约12g生药材/Kg动物)

部位A剂量2                      120mg/Kg(相当于约23g生药材/Kg动物)

部位A剂量3                      240mg/Kg(相当于约46g生药材/Kg动物)

部位A剂量4                      720mg/Kg(相当于约138g生药材/Kg动物)

部位A剂量5                      1600mg/Kg(相当于约306g生药材/Kg动物)

                                                                           

实验过程：

1.游泳实验：

实验动物按上表剂量连续给药2周，给药前一天测小鼠自主活动(5min内)。于末次灌胃1h后先测小鼠自主活动(5min内)，然后将单个小鼠放入水深10cm烧杯(高20cm，直径13cm)中，水温：25±2℃，观察6min，记录后4min小鼠游泳的不动时间(指小鼠在水中停止挣扎或显示漂浮状态，仅有微小的肢体运动以保持头部浮在水面)。实验完将小鼠放在取暖设备下烘干，放回笼内。每次平行做6只小鼠。

2.悬尾实验：

实验动物按上表剂量连续给药2周，给药前一天测小鼠自主活动(5min内)。于末次灌胃1h后先测小鼠自主活动(5min内)，然后将单个小鼠尾端(距尾端2cm处)用胶布粘在纸箱上部，使其成倒挂状态，头部离箱底15cm，中间以隔板隔离小鼠视线。观察6min，记录后4min内小鼠不动时间为失望时间。每次平行做6只小鼠。

实验结果：如表3所示

表3各组小鼠悬尾及强迫游泳不动时间比较：(n＝10，)

与空白组比较：*P＜0.05，**P＜0.01

采用上述动物模型对逍遥散有效部位A的抗抑郁作用进行体内试验验证及剂量筛选，结果即证明了其体内的有效性且最佳有效剂量为240mg/Kg(相当于46g生药材/Kg动物)，为了避免出现假阳性的结果，本实验同时测定了小鼠的自主活动，结果显示各给药组都能在一定程度上减少小鼠悬尾和游泳的不动时间，并对自主活动无影响，表明抗抑郁作用是药物引起的，而非中枢神经兴奋所致，体现了一定的抗抑郁效果。

(二)其他部位的抗抑郁作用体内活性筛选

在证实部位A在体内确实有效且最佳有效剂量为240mg/Kg(相当于46g生药材/Kg动物)的基础上，采用小鼠悬尾实验对其他部位进行抗抑郁作用的筛选。

实验方法：小鼠悬尾实验(方法同上)

给药剂量：各部位给药剂量均相当于46g生药材/Kg动物。

药物配制：各部位溶于0.5％吐温80(w/v)1％cmc-Na溶液，使各部位溶度为2.3g/ml(按生药材计算)。

实验结果：如表4所示

表4各部位小鼠悬尾不动时间比较：(n＝10，)

组别                                        悬尾不动时间(s)

                                                                

空白组(0.5％吐温80(w/v)1％cmc-Na溶液)       120.7±40.4

阳性对照组(文拉法辛组)                      4.78±98.3^**

逍遥散水煎物                                42.6±20.7^**

部位B₁+B₂+B₃                                75.0±31.1^*

部位B₄                                      49.3±30.2^**

部位C₁                                      91.3±33.8

部位C₂                                      98.3±43.2

与空白组比较：*P＜0.05，**P＜0.01

从实验结果可见，部位B₄具有抗抑郁活性，其活性与逍遥散水煎物相当；部位B₁+B₂+B₃具有一定的活性，但活性较B₄差，因B₃和B₄极性相近，故下一步将单独考察B₃活性。

(三)部位B₃及其他组合部位的进一步活性筛选

实验方法：小鼠悬尾实验(方法同上)

给药剂量：各部位给药剂量均相当于46g生药材/Kg动物

药物配制：各部位溶于0.5％吐温80(w/v)1％cmc-Na溶液，使各部位溶度为2.3g/ml(按生药材计算)。

实验结果：如表5所示

表5各部位小鼠悬尾不动时间比较：(n＝10，)

                                                           

组别                                    悬尾不动时间(s)

                                                           

空白组(0.5％吐温80(w/v)1％cmc-Na溶液)   74.3±26.2

阳性对照组(文拉法辛组)                  36.2±36.5^*

部位B₁+B₂                               83.0±42.1

部位B₃                                  60.5±46.1

部位B₁+B₂+C                             45.4±37.3

                                                             

与空白组比较：*P＜0.05

从实验结果可见，部位B₃在此实验中并没有明显的抗抑郁活性。

本实施例采用动物模型对逍遥散各部位及部位组合的抗抑郁作用进行体内活性筛选，结果显示部位A和B₄具有较好的抗抑郁活性，而其他部位的作用不明显。

实施例5药物慢性不可预知应激模型(CUMS)体内活性验证

给药剂量：各部位给药剂量均相当于46g生药材/Kg动物

药物配制：各部位溶于0.5％吐温80(w/v)1％cmc-Na溶液，使各部位溶度为2.3g/ml(按生药材计算)。

实验动物分组：大鼠适应性饲养1周，每日触摸动物以适应实验人员的操作。第三天后采用open-field法进行行为学评分，根据行为学评分和体重将大鼠随机分为10组，8只/组。即部位A、B₁+B₂、B₃、B₄、C组、逍遥散水煎物组，逍遥散散剂组、空白对照组、模型组和阳性药(文拉法辛)对照组。除空白对照组外，其余各组均单笼饲养并实施造模程序。造模开始后每天灌胃给相应药液(1ml/100g体重)，模型组及空白组给予等体积生理盐水，每天1次，连续3周。

CUMS模型的建立：采用慢性轻度不可预见性的温和刺激结合孤养的造模方法。刺激因子包括禁食、禁水、4℃冰水游泳、50℃热应激、夹尾、电击足底、潮湿垫料和鼠笼倾斜45°、束缚应激、陌生物品、噪音刺激。每日给予一种刺激，每种刺激累计使用2-3次，顺序随机，应激持续21天。

各项指标检测方法：

一般状态的观察仔细观察各组大鼠的精神状态，皮毛色泽和状态，休息时的姿势，眼裂粘膜色泽，耳廓色泽以及粪便等情况。

旷场实验分别于造模天始前和开始后第7、14、21天将单只大鼠置于长宽各80cm、高40cm光洁敞箱中央，敞箱底面划分为16个等边方格，内面用黑漆涂满，观测动物5min内的活动情况：观察指标包括中央格停留时间(自大鼠被放入中央格至其三爪跨离该格的时间，以s计)、水平穿越格数(以穿越底面方格数为其水平得分，穿越1格为1分)、垂直运动(两前腿离地或爬墙壁)、理毛时间及粪便粒数。并在彻底清洁敞箱后再进行下只动物的得分测定。

数据以均数±标准差表示。运用Minitab软件，采用方差分析(ANOVA)进行统计处理，比较采用t检验，以P＜0.05作为差异存在统计学意义的界限。

实验结果：如表6所示

表6：0-21天各组各指标的变化

注：各组与空白对照组相比：P＜0.05*  P＜0.01**

与模型组相比：P＜0.05#  P＜0.01##

采用上述CUMS模型，比较各组行为学指标，模型组与空白组差异非常显著性，证明造模成功；部位A组与模型组部分指标有非常显著差异，阳性组、逍遥散水煎物组及逍遥散散剂组与模型组相比部分指标有显著差异，说明按生药量计算相同给药剂量情况下，部位A的抗抑郁活性强于阳性药、逍遥散复方水煎物及散剂；部位B₃和B₄与模型组部分指标有显著差异，但部位B₃与空白组的部分指标有非常显著差异，而部位B₄只有一个指标与空白组有显著差异，说明部位B₃抗抑郁作用不明显，而部位B₄有一定的抗抑郁作用；其他部位组与模型组比较，没有显著性差异，说明其他部位在此实验中没有表现抗抑郁作用。

实验结论：

本发明将逍遥散复方提取分离成若干部位，经体外试验证明，部位A和B₄的活性优于传统水煎物，对NA的再摄取抑制活性优于西药地西帕明；体内试验证明，部位A和B₄确实具有抗抑郁活性。且因这两部位较复方相比，化学成分组成简单，属低极性成分，适宜开发成抗抑郁新药。