从大豆异黄酮苷元混合物中分离染料木素的方法

摘要

本发明公开了一种从大豆异黄酮苷元混合物中分离染料木素的方法，该方法以离子液体或由离子液体与其他极性溶剂组成的二元混合溶剂为萃取剂，采用分馏萃取法高效地从含有大豆黄素、染料木素和黄豆黄素的大豆异黄酮苷元混合物中分离染料木素。该方法具有分离效率高、溶剂消耗少、生产成本低、安全环保等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及染料木素的分离方法，属于化学工程技术领域，具体涉及一种从大豆异黄酮苷元混合物中分离染料木素的方法。

背景技术

大豆异黄酮苷元混合物包括大豆苷元(Daidzein)、染料木素(Genistein)和黄豆黄素(Glycitein)，其中活性功能最高的一种为染料木素。染料木素结构与雌二醇类似，能够与雌激素受体结合，发挥雌激素作用，此外还具有防治骨质疏松症、抗肿瘤、降血脂、抗氧化、体外抗肝纤维化等作用。国内外已批准多种主含染料木素的异黄酮产品作为食品用于人群。

目前染料木素的获取方法主要有三种：

第一种方法是从仅含有染料木素不含大豆苷元和黄豆黄素的植物中直接提取。公开号为CN1465571A的中国专利中公开了一种以槐角为原料，经过粉碎、醇提、浓缩、水沉、回流、抽滤、加热回流水解、结晶、真空干燥等步骤提取纯化染料木素的方法；公开号为CN101497594A的中国专利申请中公开了一种以木豆根茎为原料，通过匀浆诱导、酶和酸诱导、溶剂提取、超声波振荡絮凝、负压空气化混悬液固萃取、大孔吸附树脂富集、正相硅胶中压柱层析分离、低温析品和重结晶，得到染料木素单体的方法。然而植物中染料木素含量较低，从植物中直接提取染料木素工艺复杂，需要消耗大量有机溶剂，成本高，提取过程中染料木素损失较多。同时这种方法受原料限制，仅适用于槐角等仅含染料木素、不含有大豆苷元和黄豆黄素的植物。如果原料是大豆，由于大豆中同时含有大豆苷元、染料木素和黄豆黄素三种异黄酮苷元，采用直接提取法无法得到高含量的染料木素。

第二种方法是微生物发酵。美国专利US5554519中公开了用大豆培养基、红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)发酵，产生的染料木素用乙酸乙酯等疏水性有机溶剂在碱性条件下萃取获得的方法。公开号为CN1940081A的中国专利申请中也公开了一种从海洋碳样小单孢菌Micromonospora sp.FIM02-635的发酵产物中分离纯化染料木素的方法。但微生物发酵的方法发酵周期长，容易造成杂菌污染，长期连续发酵微生物容易发生变异，而且对仪器、设备等要求较高，得到的染料木素难以提纯，不宜大规模推广。

第三种方法是从大豆异黄酮苷元混合物中分离染料木素。大豆异黄酮苷元混合物主要有大豆苷元、染料木素和黄豆黄素三种成分，染料木素的含量较高。但是从大豆异黄酮苷元混合物中分离纯化染料木素的方法因三种苷元结构相近，分离比较困难，目前主要以色谱法为主。穆青等(天然产物研究与开发，2006，18(suppl)：118-121)用硅胶柱色谱法从含有三种大豆异黄酮苷元混合物的混合物中得到纯度95％的染料木素。但硅胶色谱法存在处理量小、溶剂消耗大、吸附剂重复使用困难、生产成本高、难以工业化等不足。

发明内容

萃取分离作为一种低成本、易于工业化的分离技术，其核心在于萃取剂的选择。现有的从大豆异黄酮苷元混合物中分离染料木素的技术中，之所以没有合适的萃取分离方法，原因在于大豆异黄酮苷元混合物中的三种主要苷元结构相近，仅在母核C-5、C-6取代基上有微小差异，如染料木素C-5上取代基为羟基，黄豆黄素C-6上取代基为甲氧基。传统的有机溶剂难以具备对大豆异黄酮苷元同系物的选择性萃取能力。

离子液体是一类新型的绿色溶剂。与传统溶剂相比，离子液体具有以下一些独特性质：(1)几乎没有蒸汽压，不挥发、不可燃，因而有助于工艺安全，环保；(2)热稳定性和化学稳定性良好；(3)结构和功能可调，可通过设计离子液体的阴、阳离子部分以达到某种特定的功能特性；(4)具备多种分子间相互作用方式，可兼具π-π、偶极、氢键等多种分子作用并易于调节。

本发明发现离子液体这一新型分离介质，由于具有多重分子间作用力且性质可控，特别是离子液体的氢键碱性可以进行精确调控，以用于识别大豆异黄酮苷元同系物结构和性质上的微小变化，对大豆异黄酮苷元同系物具有很高的分离选择性，可用于大豆异黄酮苷元同系物中染料木素的萃取分离。

因此，本发明提供了一种从大豆异黄酮苷元混合物中分离染料木素的方法，该方法以离子液体或由离子液体与极性溶剂组成的混合溶剂为萃取剂，通过多级分馏萃取，分离得到染料木素。

一种从大豆异黄酮苷元混合物中分离染料木素的方法，包括以下步骤：

以大豆异黄酮苷元混合物为原料，与中等极性溶剂、弱极性溶剂或由两种弱极性溶剂组成的二元混合溶剂中的一种配成原料液，以亲水性离子液体或由亲水性离子液体与极性溶剂组成的二元体系为萃取剂，以与原料液中溶剂相同的溶剂为洗涤剂，进行分馏萃取，得到萃取液，通过反萃取和真空浓缩得到染料木素。

或者，以大豆异黄酮苷元混合物为原料，与中等极性溶剂、碱水、水或由水与除水外的其他极性溶剂组成的二元混合溶剂中的一种配成原料液，以疏水性离子液体为萃取剂，以与原料液中溶剂相同的溶剂为洗涤剂，进行分馏萃取，得到萃取液，通过反萃取和真空浓缩得到染料木素。

所述的大豆异黄酮苷元混合物主要由大豆苷元(即大豆黄素)、染料木素和黄豆黄素组成，可采用常用的市售产品大豆异黄酮粗品经重结晶和酸水解结晶后得到，例如可选用九三油脂厂提供的大豆异黄酮粗品，该粗品的主要成分为大豆异黄酮糖苷形式，经过重结晶和酸水解结晶后得到大豆异黄酮苷元混合物，一般将市购的大豆异黄酮粗品(黑龙江九三油脂公司生产)，经过75％的乙醇水溶液重结晶两次以上后，水洗抽滤，真空干燥后得到含有大豆异黄酮糖苷的粗产品，再将得到的含有大豆异黄酮糖苷的粗产品以1mol/L硫酸为催化剂，以体积百分浓度为75％的乙醇水溶液为溶剂进行水解，将水解反应产物溶液经过过滤得到含有大豆异黄酮苷元的混合物，水洗至中性，以体积百分浓度为75％的乙醇水溶液或者正丁醇进行结晶与重结晶，真空干燥后得到含有大豆异黄酮苷元的固体混合物，即原料大豆异黄酮苷元混合物。

为了使分离得到的染料木素的量不至于过少，优选原料中大豆黄素、染料木素和黄豆黄素的总含量≥10％(重量百分比)，进一步优选为原料中大豆黄素、染料木素和黄豆黄素的总含量≥40％(重量百分比)。

根据不同萃取体系处理量的不同，原料液中大豆苷元、染料木素和黄豆黄素的总浓度优选为0.1克/升～20克/升。若原料液中大豆苷元、染料木素和黄豆黄素的含量过高，既可能超出萃取体系的溶解能力，又降低分离效率。

所述的离子液体由阳离子M⁺和阴离子N^-两部分组成，其中阳离子M⁺为具有取代基的咪唑阳离子、具有取代基的吡啶阳离子、具有取代基的胺类阳离子或具有取代基的吡咯啉阳离子中的一种；阳离子M⁺上的取代基包括烷烃基、烯烃基或芳烃基等有机基团，取代数目可以为单取代或者二取代、三取代等多取代类型，多取代时不同位点上的取代基可以相同也可以不同。

根据阳离子M⁺及其取代基的不同，疏水性离子液体的阴离子N^-可选用六氟磷酸根、四氟硼酸根、双(三氟甲烷磺酰)亚胺根或九氟丁基磺酸根中的一种，亲水性离子液体的阴离子N^-可选用氯离子、溴离子、碘离子、氢氧根、四氟硼酸根、三氟甲磺酸根、三氟乙酸根或氨基酸根中的一种。

当离子液体的阴离子N^-选用四氟硼酸根时，如果离子液体的阳离子M⁺上的取代基的碳链较长，则离子液体显示出疏水性，如果离子液体的阳离子M⁺上的取代基的碳链较短，则离子液体显示出亲水性。

本发明选用的离子液体具有氢键碱性，可识别大豆异黄酮苷元同系物弱酸的微小差别，实现染料木素的选择性萃取分离。

为了提高染料木素的选择性萃取分离效果，所述的离子液体进一步优选由阳离子M⁺为具有单个取代基或多个取代基的咪唑阳离子、具有单个取代基或多个取代基的吡啶阳离子(其中取代基包括烷烃基、烯烃基或芳烃基等有机基团)中的一种与阴离子N^-为六氟磷酸根、双(三氟甲烷磺酰)亚胺根、九氟丁基磺酸根中的一种组合的离子液体。

所述的离子液体阳离子M⁺上的取代基进一步优选C₁～C₈的烷烃基、C₁～C₃的烯烃基或C₆～C₁₅芳烃基中的一种。

所述的由亲水性离子液体与极性溶剂组成的二元混合溶剂中离子液体的摩尔分数优选为1％～90％；其中，所述的极性溶剂优选为水、甲醇、乙腈、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、碳酸丙烯酯、环丁砜或乙二醇中的一种。在离子液体中添加极性溶剂不仅可以降低离子液体的黏度，促进两相传递过程的进行，而且减少了离子液体的用量，降低了生产成本。

所述的中等极性溶剂优选正丙醇、异丙醇、正丁醇、正戊醇或乙酸乙酯中的一种。

所述的弱极性溶剂优选沸程为60℃～90℃的石油醚或者沸程为90℃～120℃的石油醚。

所述的由水与除水外的其他极性溶剂组成的二元混合溶剂中水的摩尔百分数优选为50％～99％，其中，所述的除水外的其他极性溶剂优选为甲醇、乙醇、丙酮、二甲基亚砜或二甲基甲酰胺中的一种。

所述的碱水优选氢氧化钠的水溶液、氢氧化钾的水溶液、氢氧化钙的水溶液中的一种，碱水的pH值为7.1～12，若碱性太强，大豆异黄酮苷元混合物会变质。

所述的洗涤剂和原料溶剂选用同种溶剂，在对染料木素具有较好溶解能力的同时，能与萃取剂形成液-液两相体系，可选用水、正丙醇、异丙醇、正丁醇、正戊醇、乙酸乙酯、沸程为60℃～90℃的石油醚、沸程为90℃～120℃的石油醚或由水与甲醇、乙醇、二甲基亚砜、丙酮、二甲基甲酰胺中的一种组成的二元混合溶剂，其中二元混合溶剂中水的摩尔百分数为50％～99％。如果选用不适合的溶剂作为原料溶剂和洗涤剂，既会导致生产能力下降，又会降低分离效率。

进行分馏萃取时，综合考虑产品质量、生产成本等因素，萃取剂、洗涤剂、原料液三者之间的流比优选为1～6∶1～5∶1～2。

所述的分馏萃取的操作温度以20℃～90℃为宜。如果温度过低，原料液、萃取剂、洗涤剂的黏度都会变大，不利于生产操作；温度过高，溶剂挥发严重则会降低分馏萃取的分配比和选择性。

分馏萃取采用现有的分馏萃取设备即可，分馏萃取过程一般分为萃取段和洗涤段，萃取剂从萃取段第一级进入分馏萃取体系，原料液从萃取段的最后一级进入分馏萃取体系，洗涤剂从洗涤段的第一级进入分馏萃取体系，在萃取段最后一级合并料液一起进入萃取段，萃取相和洗涤相进行多级逆流接触，从萃取段的第一级流出富集大豆黄素、黄豆黄素的萃余液，从洗涤段的第一级流出富集染料木素的萃取液。收集萃取液，通过反萃取、真空浓缩得到染料木素产品。

所述反萃取过程用的反萃取剂根据分馏萃取的两相体系的类型进行针对性设计。对于以疏水性离子液体为萃取剂的分馏萃取体系，采用pH值大于7的碱水作为反萃取剂；对于以亲水性离子液体或由亲水性离子液体与极性溶剂组成的二元体系为萃取剂的分馏萃取体系，采用与分馏萃取中洗涤剂相同的溶剂作为反萃取剂。

作为反萃取剂的碱水优选氢氧化钠的水溶液、氢氧化钾的水溶液、氢氧化钙的水溶液中的一种。

高效液相色谱分析大豆异黄酮苷元的浓度，HPLC分析条件为：C18柱(3.9×150mm，粒径4μm，Waters公司生产)，柱温40℃，流动相为A：乙酸浓度为0.1％(体积分数)的乙酸水溶液，B：乙酸浓度为0.1％(体积分数)的乙酸/乙腈溶液，梯度洗脱，流速1ml/min，检测波长为254nm。

本发明中纯度和收率的计算方法如下：

收率＝分离得到的染料木素的重量/原料中染料木素的重量×100％

纯度＝分离得到的染料木素的质量/分离得到产品的总质量×100％

本发明的优点在于：

1、本发明采用离子液体或含有离子液体的二元混合溶剂为萃取剂，对结构相似的大豆异黄酮苷元混合物具有较高的选择分离能力，提高了对染料木素的分离效率；同时采用该类萃取剂不仅便于回收和利用，而且减少了对环境的污染，具有广阔的应用前景；

2、本发明采用分馏萃取技术，化工原料的消耗量少、产能高、成本低；

3、本发明方法采用优化的分离条件染料木素的收率可达到95％以上。

具体实施方式

实施例1

将市购的大豆异黄酮粗品(黑龙江九三油脂公司生产)，其中含有40％质量分数的大豆异黄酮糖苷形式，经过体积百分浓度为75％的乙醇水溶液重结晶4次后，水洗抽滤，真空干燥后得到含有大豆异黄酮糖苷的粗产品。将得到的含有大豆异黄酮糖苷的粗产品以1mol/L硫酸为催化剂，以体积百分浓度为75％的乙醇水溶液为溶剂进行水解，将水解反应产物溶液过滤得到含有大豆异黄酮苷元的固体混合物，水洗至中性，用正丁醇重结晶4次后，真空干燥即得到原料大豆异黄酮苷元混合物。

将原料大豆异黄酮苷元混合物(其中大豆黄素、染料木素和黄豆黄素的总重量百分含量为95％)与正丙醇配成大豆黄素、染料木素和黄豆黄素的总浓度为1克/升的原料液。以1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([bmim][PF₆])为萃取剂，以正丙醇为洗涤剂，萃取剂、洗涤剂、原料液三者的流比为2∶5∶2，在30℃下在分馏萃取装置中进行分馏萃取，收集萃取液，经过pH＝8的氢氧化钾的水溶液反萃取和真空浓缩后得到染料木素。HPLC分析可知染料木素纯度为97％，收率为98％。

实施例2

原料大豆异黄酮苷元混合物的制备，除了大豆异黄酮苷元重结晶溶剂为体积百分浓度为75％的乙醇水溶液之外，其余操作均同实施例1。

将原料大豆异黄酮苷元混合物(其中大豆黄素、染料木素和黄豆黄素的总重量百分含量为90％)与正戊醇配成大豆黄素、染料木素和黄豆黄素的总浓度为0.5克/升的原料液。以1-丁基-3-甲基咪唑氯([bmim]Cl)-水混合溶剂为萃取剂([bmim]Cl摩尔分数65％)，以正戊醇为洗涤剂，萃取剂、洗涤剂、原料液三者的流比为4∶3∶2，在20℃下在分馏萃取装置中进行分馏萃取，收集萃取液，经过正戊醇反萃取和真空浓缩后得到染料木素。HPLC分析可知染料木素纯度为82％，收率为98％。

实施例3

原料大豆异黄酮苷元混合物的制备，除了大豆异黄酮糖苷重结晶的次数为3次、大豆异黄酮苷元重结晶溶剂为体积百分浓度为75％的乙醇水溶液之外，其余操作均同实施例1。

将原料大豆异黄酮苷元混合物(其中大豆黄素、染料木素和黄豆黄素的总重量百分含量为60％)与水配成大豆黄素、染料木素和黄豆黄素的总浓度为0.6克/升的原料液。以1-己基-3-甲基咪唑双(三氟甲烷磺酰)亚胺盐([hmim][NTf₂])为萃取剂，以水为洗涤剂，萃取剂、洗涤剂、原料液三者的流比为3∶2∶1.5，在60℃下在分馏萃取装置中进行分馏萃取，收集萃取液，经过pH＝9的氢氧化钠的水溶液反萃取和真空浓缩后得到染料木素。HPLC分析可知染料木素纯度为91％，收率为98％。

实施例4

原料大豆异黄酮苷元混合物的制备，除了大豆异黄酮糖苷重结晶的次数为4次、大豆异黄酮苷元重结晶次数为3次之外，其余操作均同实施例1。

将原料大豆异黄酮苷元混合物(其中大豆黄素、染料木素和黄豆黄素的总重量百分含量为75％)与水-二甲基甲酰胺混合溶剂(其中水的摩尔分数为80％)配成大豆黄素、染料木素和黄豆黄素的总浓度为1克/升的原料液。以1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([omim][PF₆])为萃取剂，以水-二甲基甲酰胺混合溶剂为洗涤剂，萃取剂、洗涤剂、原料液三者的流比为6∶3∶2，在50℃下在分馏萃取装置中进行分馏萃取，收集萃取液，经过pH＝9的氢氧化钙的水溶液反萃取和真空浓缩后得到染料木素。HPLC分析可知染料木素纯度为92％，收率为96％。

实施例5

将实施例1中得到的原料大豆异黄酮苷元混合物(其中大豆黄素、染料木素和黄豆黄素的总重量百分含量为95％)与水-二甲基亚砜混合溶剂(其中水的摩尔分数为50％)配成大豆黄素、染料木素和黄豆黄素的总浓度为5克/升的原料液。以1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([bmim][PF₆])为萃取剂，以水-二甲基亚砜混合溶剂为洗涤剂，萃取剂、洗涤剂、原料液三者的流比为6∶2∶1，在80℃下在分馏萃取装置中进行分馏萃取，收集萃取液，经过pH＝10的氢氧化钠的水溶液反萃取和真空浓缩后得到染料木素。HPLC分析可知染料木素纯度为96％，收率为98％。

实施例6

将实施例3中得到的原料大豆异黄酮苷元混合物(其中大豆黄素、染料木素和黄豆黄素的总重量百分含量为60％)与乙酸乙酯配成大豆黄素、染料木素和黄豆黄素的总浓度为1克/升的原料液。以1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([bmim][BF₄])-二甲基甲酰胺([bmim][BF₄]摩尔分数90％)为萃取剂，以乙酸乙酯为洗涤剂，萃取剂、洗涤剂、原料液三者的流比为3∶2∶2，在40℃下进行分馏萃取，收集萃取液，经过乙酸乙酯反萃取和真空浓缩后得到染料木素。HPLC分析可知染料木素纯度为85％，收率为98％。

实施例7

原料大豆异黄酮苷元混合物的制备，除了大豆异黄酮苷元重结晶的次数为2次之外，其余操作均同实施例1。

将原料大豆异黄酮苷元混合物(其中大豆黄素、染料木素和黄豆黄素的总重量百分含量为58％)与沸程为(60～90)℃的石油醚配成大豆黄素、染料木素和黄豆黄素的总浓度为1.0克/升的原料液。以氯化1-丁基-3-甲基咪唑([bmim]Cl)-二甲基亚砜([bmim]Cl的摩尔分数为1％)为萃取剂，以沸程为(60～90)℃的石油醚为洗涤剂，萃取剂、洗涤剂、原料液三者的流比为4∶5∶2，在40℃下在分馏萃取装置中进行分馏萃取，收集萃取液，经过沸程为(60～90)℃的石油醚反萃取和真空浓缩后得到染料木素。HPLC分析可知染料木素纯度为90％，收率为98％。

实施例8

原料大豆异黄酮苷元混合物的制备，除了大豆异黄酮糖苷重结晶的次数为2次之外，其余操作均同实施例1。

将原料大豆异黄酮苷元混合物(其中大豆黄素、染料木素和黄豆黄素的总重量百分含量为45％)与乙酸乙酯配成大豆黄素、染料木素和黄豆黄素的总浓度为10克/升的原料液。以氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑([Amim]Cl)为萃取剂，以乙酸乙酯为洗涤剂，萃取剂、洗涤剂、原料液三者的流比为6∶3∶1，在80℃下在分馏萃取装置中进行分馏萃取，收集萃取液，经过乙酸乙酯反萃取和真空浓缩后得到染料木素。HPLC分析可知染料木素纯度为82％，收率为95％。

实施例9

原料大豆异黄酮苷元混合物的制备，除了大豆异黄酮糖苷重结晶的次数为2次、大豆异黄酮苷元重结晶所用溶剂为体积百分浓度为75％的乙醇水溶液、结晶次数为2次之外，其余操作均同实施例1。

将原料大豆异黄酮苷元混合物(其中大豆黄素、染料木素和黄豆黄素的总重量百分含量为30％)溶解在沸程为(60～90)℃的石油醚中，配成大豆黄素、染料木素和黄豆黄素的总浓度为15克/升的原料液。以氢氧化1-丁基-3-甲基咪唑([bmim]OH)为萃取剂，以沸程为(60～90)℃的石油醚为洗涤剂，萃取剂、洗涤剂、原料液三者的流比为1∶2∶2，在50℃下在分馏萃取装置中进行分馏萃取，收集萃取液，经过沸程为(60～90)℃的石油醚反萃取和真空浓缩后得到染料木素。HPLC分析可知染料木素纯度为84％，收率为98％。

实施例10

原料大豆异黄酮苷元混合物的制备，大豆异黄酮糖苷重结晶的次数为2次、大豆异黄酮苷元重结晶所用溶剂为体积百分浓度为75％的乙醇水溶液、结晶次数为1次之外，其余操作均同实施例1。

将原料大豆异黄酮苷元混合物(其中大豆黄素、染料木素和黄豆黄素的总重量百分含量为10％)与水-甲醇混合溶剂(其中水的摩尔分数为99％)配成大豆黄素、染料木素和黄豆黄素的总浓度为20克/升的原料液。以1-丁基-3-甲基九氟丁基磺酸盐([bmim][NfO])为萃取剂，以水-甲醇混合溶剂为洗涤剂，萃取剂、洗涤剂、原料液三者的流比为2∶4∶1，在60℃下在分馏萃取装置中进行分馏萃取，收集萃取液，经过pH＝10的氢氧化钠的水溶液反萃取和真空浓缩后得到染料木素。HPLC分析可知染料木素纯度为80％，收率为95％。