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法律状态
2016-02-10
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):G01N30/02 授权公告日:20120201 终止日期:20141218 申请日:20091218
专利权的终止
2012-02-01
授权
授权
2010-07-21
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N30/02 申请日:20091218
实质审查的生效
2010-06-02
公开
公开
技术领域
本发明属药物分析领域,涉及一种内源性微量物质的检测,具体涉及一种快速检测中药注射剂致过敏介质释放的分析方法。
背景技术
随着中药现代化学和中药制剂学技术的不断提高及研究,中药注射剂在我国已广泛应用于临床。中药注射剂起效快、作用强,尤其在危重疾病急救及感染性疾病、心脑血管疾病、恶性肿瘤等疾病的治疗上具有一定的优势。然而,随着中药注射剂在临床的广泛应用且中药注射剂大多不是单一化学物质,因此,必然会带来一些传统中药制剂的安全性问题[1]。从临床最常用的中药注射剂清开灵、血栓通、葛根素到鱼腥草、复方丹参、双黄连、穿琥宁和参麦注射液等,其不良反应已较多见,发生的机率均较高[2,3]。中药注射剂的不良反应主要为过敏反应,约占不良反应的80%,而类过敏反应(pseudoanaphylaxis,anaphylactoid action)则占了过敏反应中的76%[4]。类过敏反应与过敏反应一样,常伴有呼吸暂停、心脏骤停、低血压、休克、血管扩张以及致死性反应。组胺是类过敏反应的主要释放介质,机体肥大细胞释放的组胺进入体液或血液循环中能引起全身毛细血管扩张通透性升高、腺体分泌增加、平滑肌痉挛;作用于内皮细胞和神经细胞引起末梢神经刺激并能够募集炎症细胞,引起组织损伤和变态反应。当血中的组胺达到一定水平时将产生过敏性休克甚至死亡[5]。因此,组胺是过敏性疾病药物治疗的一个很好的靶分子,而且体内组胺水平的升高可作为过敏性疾病确诊的一项重要指标。
目前对于组胺的检测方法主要有(1)酶联免疫吸附测定(enzyme linkedimmunosorbent assay,ELISA),该方法的优点是快速、价廉、检测设备简单。ELISA测组胺的不足之处是特异性较低,且不易精确定量,不适合组胺含量低的生物样品中组胺的测定。(2)荧光分光光度法,组胺的分子式为C5H9N3,分子量为111,在化学上属咪唑类,为含两个杂原子的五元杂环。其分子结构中存在共轭体系,易于吸收光能。在紫外光照射下组胺分子吸收光子能量被激发后,可用荧光法测定其从激发态最低振动能级返回到基态时所发出的光。可以使某些荧光试剂与组胺作用后增强组胺的荧光性来提高组胺检测的灵敏度和选择性。但荧光分光光度法的缺点是操作步骤繁琐,而组胺半衰期极短[6],过敏反应发生后几分钟就不能检测到。因此,我们在将现代分析仪器用于检测释放的过敏介质含量的时候,除了要考虑解决分析方法的快捷性及灵敏性,还要考虑如何使用化学衍生化的方法将组胺捕捉到。
正是基于上述原因,本发明确定以“GC-MS用于中药注射剂致过敏介质释放的检测方法”为内容,建立痕量、精确的组胺检测技术,为临床、制药企业解决中药注射剂的安全性问题提供科学方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测中药注射剂致过敏介质释放的方法。是一种用GC-MS检测因中药注射剂引起类过敏反应后,机体内源性产生微量组胺的方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现:
1.反应液的配制
由无水乙醇、三乙胺、9-methylanthracene、丙酮按一定比例组成,范围在体积比为无水乙醇∶三乙胺∶9-methylanthracene溶液∶丙酮=30∶6∶1∶80~20∶4∶1∶50,其中9-methylanthracene的浓度为2μg/mL,优选1110μL的无水乙醇:240μL三乙胺:50μL 2μg/mL的9-methylanthracene:3.6mL的丙酮混合均匀而成;
2.衍生化液的配制
由衍生化试剂Ethylchloroformate(氯甲酸乙酯)按一定比例与氯仿混溶组成,具体而言为氯甲酸乙酯与氯仿按体积比为2∶8~1∶9组成;
3.供试品溶液的衍生化制备
在100μL的血浆或细胞培养上清中加入1350μL的反应液,于涡旋仪上涡旋3秒后加入550μL衍生化液,连续涡旋10秒;加入3.5mL水再涡旋5秒,1500转离心5分钟,取有机相,加入10mg无水硫酸钠脱水后,置于有内衬管的GC自动采样瓶中供分析用;
4.过敏介质释放的检测
(1)色谱条件的确定
选择柱类型为极性色谱柱,进样口:进样温度140℃,进样2min后分流口吹扫流量:40mL/min,压力:50.8Kpa,总流量:1mL/min。其中起始温度为120℃下停留2min,再以40℃/min的速度升至240℃,在该温度下停留10min。
(2)质谱条件的确定
采用SIM(选择离子监测)模式,以m/z166的保留时间来定性过敏介质,以m/z192的保留时间来定性内标9-methylanthracene(9-甲基蒽),根据过敏介质和内标的峰面积按公式mi=f×Ai/(As/ms)计算过敏介质含量,其中f代表校正因子,Ai和As分别为供试品和内标物质的峰面积或峰高,ms为加入内标物质的量;
(3)过敏介质定性
过敏介质为组胺衍生物,m/z166的碎片峰为组胺衍生物的典型特征,在上述色谱条件下组胺衍生物的保留时间为13.5min。
目前对于组胺的几种检测方法都有较明显的局限性:ELISA测组胺的不足之处是特异性较低,且不易精确定量,不适合组胺含量低的生物样品中组胺的测定。柱前衍生反相高效液相色谱法(RP-HPLC):使用丹磺酰氯柱前衍生以反相高效液相色谱方法检测,该方法的缺点在于样品前处理的衍生化步骤太繁琐,且噪音对结果的影响较大,检测限亦较高,不易测到浓度低的样品。荧光分光光度法的缺点是操作步骤繁琐,而组胺半衰期极短,过敏反应发生后几分钟就不能检测到。本发明提供的分析方法,优势在于对于血浆、细胞上清等生化样品,只需采用一步衍生化的方法对少量的样品(100μL)就可快速完成样品前处理,既克服了HPLC方法中繁琐的多步衍生化步骤导致的系统误差,且不需要消耗大量的样品和前处理时间;本发明选用的衍生化试剂ECF是良好的胺衍生化试剂,较之荧光分光光度法的衍生化试剂OPA具有更高的稳定性;本发明提供的分析方法,在0.002~2μg/ml范围线性良好,以更低廉的成本达到ELISA试剂盒所能测定的检测限,比之ELISA的测定方法。本发明方法得到的色谱图基线平稳、峰形良好,方法简便、快捷、灵敏、重现性好,本发明提供的分析方法还克服了ELISA测定常出现的假阳性结果,为临床、制药企业解决中药注射剂的安全性问题提供科学方法。
说明书附图
图1为组胺衍生物(13.5min)和内标-9-甲基蒽(11min)的GC图谱。
图2为内标质谱图。
图3为组胺衍生物质谱图。
图4为组胺线性关系考察。
图5为Beagle犬对注射液过敏反应情况。
图6为正常组、I组、II组P815细胞组胺分泌的测定。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1
1.反应液的配制
由1110μL的无水乙醇、240μL三乙胺、50μL 2μg/mL的9-methylanthracene、3.6mL的丙酮混合均匀而成;
2.衍生化液的配制
由衍生化试剂Ethylchloroformate(氯甲酸乙酯)按一定比例与氯仿混溶组成,具体而言为氯甲酸乙酯与氯仿按体积比为1∶9组成;
3.供试品溶液的衍生化制备
在100μL的血浆或细胞培养上清中加入1350μL的反应液,于涡旋仪上涡旋3s后加入550μL衍生化液,连续涡旋10s;加入3.5mL水再涡旋5s;1500转离心5分钟,取有机相置一干净瓶中,加入10mg无水硫酸钠脱水后,置于有内衬管的GC自动采样瓶中供分析用。
4.确定色谱条件
选择柱类型为极性色谱柱Agilent(DB-WAX 15×0.25mm内径,0.25μm膜厚);不分流进样方式以1μL自动进样,取样前进样针先用溶剂氯仿清洗3次,并在进样前在样品瓶中取8μL样品润洗三次,进样后再用氯仿将进样针清洗3次。进样口:进样温度140℃,进样2min后分流口吹扫流量:40mL/min,压力:50.8Kpa,总流量:1mL/min。起始温度为120℃下停留2min,再以40℃/min的速度升至240℃,在该温度下停留10min。结果参见图1:组胺衍生物(13.5min)和内标-9-甲基蒽(11min)。
5.确定质谱条件
采用SIM选择离子模式,以m/z166的保留时间来定性组胺衍生物,以m/z192的保留时间来定性内标9-甲基蒽。根据组胺和内标的峰面积按公式mi=f×Ai/(As/ms)计算组胺含量,其中f代表校正因子,Ai和As分别为供试品和内标物质的峰面积或峰高,ms为加入内标物质的量。参见图2和图3,图2为内标的质谱图,图3为组胺衍生物质谱图。
6.组胺衍生化碎片裂解过程解析
由过敏反应所释放的内源性微量过敏介质为组胺衍生物。
实施例2
1.反应液的配制
由1000μL的无水乙醇、200μL三乙胺、50μL 2μg/mL的9-methylanthracene、2.5mL的丙酮混合均匀而成;即无水乙醇∶三乙胺∶9-methylanthracene溶液∶丙酮=30∶6∶1∶80~20∶4∶1∶50,
2.衍生化液的配制
由衍生化试剂Ethylchloroformate(氯甲酸乙酯)按一定比例与氯仿混溶组成,具体而言为氯甲酸乙酯与氯仿按体积比为2∶8组成;
3.供试品溶液的衍生化制备
在100μL的血浆或细胞培养上清中加入1350μL的反应液,于涡旋仪上涡旋3s后加入550μL衍生化液,连续涡旋10s;加入3.5mL水再涡旋5s;1500转离心5分钟,取有机相置一干净瓶中,加入10mg无水硫酸钠脱水后,置于有内衬管的GC自动采样瓶中供分析用。
实施例3
1.线性关系考察
线性关系是考察被测样品浓度的变化与试样结果成正比关系的程度,常用绘制标准曲线方法来确定。分别精密吸取组胺对照品贮备液(2μg/mL)0.01,0.1,0.25,0.5,1,2.5ml置10ml量瓶中,定容后各取100μL按一项下方法进行衍生化实验,按二、三项下方法进行测定,以对照品浓度为横坐标,对照品与内标物峰面积比值为纵坐标,绘制标准曲线,进行回归分析,得回归方程Y=1.0726X+0.031,r=0.9993,表明组胺在0.002~2μg/ml范围内具有良好线性关系。参见图4。
2.重复性实验
取相同的供试品溶液,按二、三项下方法,重复进样5次,依次测得对照品和内标峰面积之比,计算RSD%=0.19%,参见表1。
表1组胺重复性实验结果
3.重现性实验
取同一批供试品溶液5份,按二、三项下方法测定,计算组胺含量,结果RSD:0.44%,参见表2,表明重现性良好。
表2组胺重现性实验结果
4.稳定性实验
取上述供试品溶液,分别于0,2,4,8,12小时进样,依法测定,结果RSD=0.46%,表明供试品溶液在12小时内稳定性良好。参见表3。
表3组胺稳定性实验结果
5.加样回收率实验
分别精密称取已测定含量的同一批血浆样品5份,各约100μL,加入组胺对照品适量,精密加入内标物溶液50μL,按一项下方法衍生化处理,记录色谱,结果组胺平均加样回收率为100.6%,RSD:1.86%。结果见表4。
表4组胺加样回收率实验结果
通过上述方法学考察,确定本发明采用的组胺含量测定方法满足于分析要求。
实施例4
本发明所述的组胺含量测定分析方法用于含不同浓度吐温-80的中药鱼腥草注射液引起的Beagle犬血浆组胺释放的测定
1、实验动物:健康、雄性Beagle犬3只,体重12Kg,由浙江大学实验动物中心提供。
2、实验材料:鱼腥草注射液(浙江某企业生产),吐温-80(上海凌峰化学试剂有限公司),9-methylanthracene、Ethylchloroformate(Sigma),低温中速离心机(日立公司),气质联用分析仪(GC-MS):Agilent,毛细管分析柱:(DB-WAX 15×0.25mm内径,0.25μm膜厚),所用试剂均为分析纯。
3、给药方法:3只Beagle犬,1只给予鱼腥草注射液(浙江某企业生产)2mL,1只给予含吐温-800.5%的鱼腥草注射液2mL;另一只作为阴性对照。
4.观察项目及方法
1)动物一般行为学观察:观察给药后动物的行为,是否有颤抖、烦躁、昏厥等症状。
2)血浆中组胺释放量的测定:给药5分钟后,于动物前肢静脉取血2mL,全血置于含肝素钠的采血管中。低温离心机离心3000转10分钟,取上清100μL加入1350μL的反应液,于涡旋仪上涡旋3后加入550μL衍生化液,连续涡旋10s;加入3.5mL水再涡旋5s,1500转离心5分钟,取有机相置一干净瓶中,加入10mg无水硫酸钠脱水后,置于有内衬管的GC自动采样瓶中供分析用。各组重复测定三次。
5.结果
阴性对照组血浆中未能检测出组胺,给予浙江某企业生产的鱼腥草注射液以及含吐温-800.5%的鱼腥草注射液的动物血浆中均能检测出组胺。浙江某企业生产的鱼腥草注射液与正常组比较,没有显著差异(P>0.05),含吐温-800.5%的鱼腥草注射液与正常组相比,组胺释放量显著增加,差异显著(P<0.01),Beagle犬也呈现较明显的过敏症状,四肢及面部出现大面积红色如图5及表5所示。参见图5:a.阴性对照组;b.浙江某企业生产鱼腥草注射液;c.含吐温-800.5%的鱼腥草注射液。
表5血浆组胺含量测定结果(x±s)
实施例5
本发明所述的组胺含量测定分析方法用于含不同浓度吐温-80的中药鱼腥草注射液引起的P815细胞组胺分泌的测定
1、材料和方法
1、人肥大细胞(P815)购自上海中科院细胞库,DMEM培养基为sigma公司产品,胎牛血清(FBS)为PAA公司产品。鱼腥草注射液为浙江某企业生产,吐温-80,9-methylanthracene、Ethylchloroformate(Sigma),低温中速离心机(日立公司),气质联用分析仪(GC-MS):Agilent,毛细管分析柱:(DB-WAX15×0.25mm内径,0.25μm膜厚),所用试剂均为分析纯。
2、实验分组
(1)正常组:空白对照组:P815细胞10%FBS MEM培养液
(2)I组:P815细胞+浙江某企业生产鱼腥草注射液(500mmol/L)
(3)II组:P815细胞+0.5%吐温-80鱼腥草注射液(500mmol/L)
每组各三个复孔。
3、细胞上清处理方法
药物作用30分钟后,分别吸取上清100μL加入1350μL的反应液,于涡旋仪上涡旋3s后加入550μL衍生化液,连续涡旋10s;加入3.5mL水再涡旋5s,1500转离心5分钟,取有机相置一干净瓶中,加入10mg无水硫酸钠脱水后,置于有内衬管的GC自动采样瓶中供分析用。
4、结果
正常组、鱼腥草注射液组以及含吐温-80的鱼腥草注射液组的细胞上清中均能检测出组胺。I组、II组与正常组比较,均有显著差异(P<0.01)。参见表6和图6。
表6P815细胞上清中组胺含量测定结果(x±s)
上述实验证明,所确定的含量测定方法能够确定中药注射剂引起类过敏反应后机体或细胞分泌微量组胺的含量。
本发明涉及的参考文献
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