昆虫的栖息地的鉴定方法

摘要

一种用于鉴定同一种类的昆虫的栖息地的标记的制作方法，该方法含以下工序：(a)确定来自2个以上的栖息地的1种以上的昆虫的DNA碱基序列；(b)对(a)中确定的碱基序列进行比对；(c)根据(b)的结果，将供给比对的碱基序列中的保守的1个以上的碱基形成的位点从上述碱基序列中去除；(d)根据(c)的结果，将剩余位点的全部或一部分作为类型识别位点；(e)对于(d)的类型识别位点，比较相互对应的碱基，将完全一致的类型识别位点分类为同一类型，不完全一致的类型识别位点分类为其他的1个以上的类型；和(f)对于(e)中的各个类型，通过确定属于各类型的昆虫的栖息地，将各类型的类型识别位点作为标记。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于通过DNA分析来鉴定同一种类的昆虫中的昆虫的栖息地的标记(Merkmal)的制作方法。

背景技术

日本是世界上最大的食物进口国。在这些食物中，除食品以外，还包含大豆等的食品原料、玉米等的饲料用谷物等。作为这些食物运送到日本的途径，从出口国向日本的运送途径可例举利用飞机的空运、利用船舶的海上运输、以及在出口国内的陆路运输。

可是，进口的食物在国内仓库内保管时，有时会出现害虫。作为其原因，可认为有保管仓库内栖息的昆虫混入的情况和在出口地或经由地栖息的昆虫混入的情况。追踪究竟是在哪一个途径上混入了害虫在采取安全措施上是非常重要的。但是由于昆虫的分布区域分散在世界各地，因此，同一形态的昆虫在各地栖息时，难以判断发生的害虫究竟是在何处混入，也即，难以从形态特征上判断该害虫的栖息地，从而也难以查明该害虫混入的原因。

发明内容

发明要解决的课题

本发明提供一种用于通过DNA分析来鉴定同一种类的昆虫中的昆虫的栖息地的标记(Merkmal)的制作方法。

如上所述，例如，将食物保管在港湾仓库期间发生了赤拟谷盗的情况下，目前的现状是还没有一种能够鉴定是在国内栖息的昆虫在港湾仓库混入食物还是在出口地或经由地栖息的昆虫混入食物的方法，所以强烈希望开发出能够鉴定害虫的混入场所的技术。

解决课题的方法

本发明人为了解决上述课题进行了锐意研究。在分析来自日本国内及世界各地的赤拟谷盗的来自线粒体的COI基因及ND5基因的碱基序列时，发现各碱基序列中存在栖息地所特有的多态性，从而完成了本发明。

即，本发明如下：

(1)一种方法，其是用于鉴定同一种类的昆虫中的昆虫的栖息地的标记(Merkmal)的制作方法，该方法包含下述工序：

(a)确定来自2个以上的栖息地的1种以上的昆虫的DNA碱基序列的工序；

(b)对上述工序(a)中确定的碱基序列进行比对的工序；

(c)根据上述工序(b)的比对结果，将供给比对的全部上述碱基序列中保守的1个或其以上的碱基形成的位点从上述碱基序列中去除的工序；

(d)根据上述工序(c)中的去除的结果，将剩余位点的全部或一部分作为类型识别位点的工序；

(e)对于上述工序(d)中得到的类型识别位点，比较相互对应的碱基，将完全一致的类型识别位点分类为同一类型，将不完全一致的类型识别位点分类为其他的1个以上的类型的分类工序；和

(f)对于上述工序(e)中分类的各个类型，由属于各类型的昆虫栖息地确定各类型的栖息地，从而将各类型的类型识别位点作为标记(Merkmal)的工序。

(2)一种方法，其特征在于，其是用于鉴定同一种类的昆虫中的昆虫的栖息地是否是某地区的地区识别标记(Merkmal)的制作方法，该方法在上述(1)中所述的工序的基础上进一步包含下述工序：

(g)对于(1)中所述的工序(f)中得到的标记(Merkmal)，比较相互对应的碱基，选取只在1个类型中存在而在该类型以外的类型中不存在的碱基的工序；和

(h)将上述工序(g)中选取的1个或其以上的碱基单独或多个组合后作为地区识别标记(Merkmal)的工序。

(3)根据(1)或(2)中所述的方法，其中，昆虫为属于鞘翅目的昆虫。

(4)根据(1)～(3)中任一项所述的方法，其中，昆虫为属于拟步甲科的昆虫。

(5)根据(1)～(4)中任一项所述的方法，其中，昆虫为赤拟谷盗。

(6)根据(1)～(5)中任一项所述的方法，其中，DNA为来自线粒体的DNA。

(7)根据(6)中所述的方法，其中，来自线粒体的DNA为COI基因和/或ND5基因。

(8)一种用于鉴定被测昆虫的栖息地的方法，该方法由下述步骤构成：

比较具有根据(1)～(7)中任一项所述的方法得到的标记(Merkmal)的区域的碱基序列、和从被测昆虫中得到的碱基序列中的与具有所述标记(Merkmal)的区域的碱基序列相对应的碱基序列，

分析被测体的所述碱基序列中的与标记(Merkmal)对应的位点的碱基是否与标记(Merkmal)的碱基一致，从而鉴定被测体的栖息地。

(9)一种用于鉴定被测昆虫的栖息地的方法，其包含下述步骤：

将包含表示根据(1)～(7)中任一项所述的方法得到的标记(Merkmal)的碱基的数据、和表示所述碱基的碱基序列位置的数据的标记表(MerkmalTable)存入运行分析用计算机程序的计算机内的步骤；

将包含表示从被测昆虫中得到的碱基的数据的被测体碱基序列表存入所述计算机内的步骤；和

参照所述标记表(Merkmal Table)的表示所述碱基序列位置的数据，用所述计算机对表示位于被测体碱基序列表和所述标记表(Merkmal Table)之间相对应的碱基序列位置上的碱基的数据进行比较的步骤。

(10)根据(8)或(9)所述的方法，其中，昆虫为属于鞘翅目的昆虫。

(11)根据(8)～(10)中任一项所述的方法，其中，昆虫为属于拟步甲科的昆虫。

(12)根据(8)～(11)中任一项所述的方法，其中，昆虫为赤拟谷盗。

(13)根据(8)～(12)中任一项所述的方法，其中，DNA为来自线粒体的DNA。

(14)根据(13)所述的方法，其中，来自线粒体的DNA为COI基因和/或ND5基因。

(15)一种用于鉴定被测昆虫的栖息地的分析用计算机程序，其具备包含表示根据(1)～(7)中任一项所述的方法得到的标记(Merkmal)的碱基的数据、和表示所述碱基的碱基序列位置的数据的标记表(Merkmal Table)。

(16)根据(15)所述的用于鉴定被测昆虫的栖息地的分析用计算机程序，其作为包含下述单元的单元使计算机执行功能：

存入包含表示从被测昆虫中得到的碱基的数据的被测体碱基序列表的单元；和

参照标记表(Merkmal Table)的表示所述碱基序列位置的数据，比较表示位于被测体碱基序列表和所述标记表(Merkmal Table)之间相对应的碱基序列位置上的碱基的数据的单元。

(17)一种计算机可读取记录介质，其记录了(15)或(16)所述的分析用计算机程序。

(18)一种标记(Merkmal)，其通过(1)～(7)中任一项所述的方法获得。

(19)一种地区识别标记(Merkmal)，其是用于鉴定赤拟谷盗的栖息地是否为日本本州的通过(2)的制作方法得到的地区识别标记(Merkmal)，该地区识别标记(Merkmal)是序列号1所示的来自赤拟谷盗COI基因的碱基序列的5’末端开始的第229位的碱基为G、第253位的碱基为T、第298位的碱基为G中的任一项或2项以上和/或是序列号8所示的来自赤拟谷盗ND5基因的碱基序列的5’末端开始的第248位的碱基为A。

(20)一种引物，其包含构成通过(1)～(7)中任一项所述的方法制作的标记(Merkmal)的碱基中的至少1个碱基。

(21)一种探针，其包含构成通过(1)～(7)中任一项所述的方法制作的标记(Merkmal)的碱基中的至少1个碱基。

(22)根据(20)中所述的引物，其包含用于鉴定赤拟谷盗的栖息地是否为日本本州的序列号17～29所示的核酸。

(23)一种方法，其是使用(20)所述的引物和/或(21)所述的探针鉴定昆虫的栖息地的方法，该方法包含下述工序：

(a)提取被测昆虫DNA的工序；

(b)使所述工序(a)中提取的DNA与(20)所述的引物和/或(21)所述的探针接触的工序；

(c)扩增DNA片段的工序；和

(d)鉴定被测昆虫的栖息地的工序。

(24)一种方法，其是使用(20)所述的引物和(21)所述的探针鉴定昆虫栖息地的方法，该方法包含下述工序：

(a)提取被测昆虫DNA的工序；

(b)使所述工序(a)中提取的DNA与(20)所述的引物和(21)所述的探针接触的工序；

(c)使用实时PCR扩增DNA片段的工序；

(d)检测预先用探针标记了的荧光物质的工序；和

(e)鉴定被测昆虫的栖息地的工序。

(25)一种方法，其是使用(22)所述的引物识别赤拟谷盗的栖息地是否为日本本州的方法，该方法包含下述工序：

(a)提取被测赤拟谷盗的DNA的工序；

(b)使所述工序(a)中提取的DNA与(22)所述的引物接触的工序；

(c)扩增DNA片段的工序；和

(d)识别被测赤拟谷盗是在日本本州栖息的赤拟谷盗还是在日本本州以外的地区栖息的赤拟谷盗的工序。

(26)一种方法，其是使用(21)所述的探针及夹有所述探针并可使其扩增的一对引物鉴定昆虫的栖息地的方法，该方法包含下述工序：

(a)提取被测昆虫的DNA的工序；

(b)使所述工序(a)中提取的DNA与(21)所述的探针及夹有所述探针并可使其扩增的一对引物接触的工序；

(c)使用实时PCR使DNA片段扩增的工序；

(d)检测预先用探针标记了的荧光物质的工序；及

(e)鉴定被测昆虫的栖息地的工序。

发明效果

由于可识别赤拟谷盗的栖息地，可期待当在食物中混入了赤拟谷盗时通过推断其混入地区而查明混入原因，从而能迅速建立起更有效的安全措施。

此外，使用构成通过本发明的方法制作的标记(Merkmal)的碱基的信息，可制作用于识别栖息地的引物、探针。例如，使用用于鉴定本发明的赤拟谷盗是否为日本本州栖息的赤拟谷盗的本州产用引物及海外产用引物时，以从栖息地不明的赤拟谷盗中提取的DNA为模板进行PCR扩增时，例如，如果本州产用引物为阳性、海外产用引物为阴性，即可判断该赤拟谷盗为本州产。如此进行，该引物及探针还有助于简便地识别昆虫的栖息地。

此外，在加工食品等中，混入的昆虫的DNA大多成了片段。因为DNA成为片段后，PCR扩增区域有可能被分割，此时不能进行PCR扩增，也无法进行DNA分析，所以，无法判断混入的昆虫的栖息地。因此，希望预先将作为分析对象的DNA区域的PCR扩增片段设定为短片段。为此，本发明的引物等，可将去除引物区域后的PCR扩增产物的大小设定为1～200碱基(bp)、优选1～100碱基(bp)、进一步优选10～50碱基(bp)的短片段。如此进行，如使用本发明的引物等，即可极度减少上述DNA片段化的影响，因而优选。

本发明中，即使在通过加热或加压处理人为使赤拟谷盗的DNA劣化时、或通过γ射线照射人为使赤拟谷盗的DNA劣化时，也可观察到PCR扩增或可通过实时PCR法识别栖息地。而且，即使对于在饲养中自然死亡、其后在室温下经过了5个月保管的赤拟谷盗，也可观察到PCR扩增。由上述结果可知，本发明的应用范围极其广泛。

附图说明

图1为表示泰国产1和冲绳产1的赤拟谷盗的线粒体COI基因区域的DNA的电泳条带照片。

图2为表示加拿大产1的赤拟谷盗的线粒体COI基因区域的DNA的电泳条带照片。

图3为表示千叶产1、浦和产1和冈山产1的赤拟谷盗的线粒体COI基因区域的DNA的电泳条带照片。

图4为表示泰国产2和泰国产3的赤拟谷盗的线粒体COI基因区域的DNA的电泳条带照片。

图5为表示加拿大产2、加拿大产3、冲绳产2、冲绳产3、千叶产2、千叶产3、冈山产2和冈山产3、浦和产2、浦和产3的赤拟谷盗的线粒体COI基因区域的DNA的电泳条带照片。

图6为表示泰国产4、泰国产5、冲绳产4、冲绳产5、加拿大产4和加拿大产5的赤拟谷盗的线粒体COI基因区域的DNA的电泳条带照片。

图7为表示宝冢产1、宝冢产2和宝冢产3的赤拟谷盗的线粒体COI基因区域的DNA的电泳条带照片。

图8为表示泰国产1的赤拟谷盗的线粒体ND5基因区域的DNA的电泳条带照片。

图9为表示冲绳产1的赤拟谷盗的线粒体ND5基因区域的DNA的电泳条带照片。

图10为表示泰国产2、泰国产3、冈山产1、浦和产1、千叶产1和加拿大产1的赤拟谷盗的线粒体ND5基因区域的DNA的电泳条带照片。

图11为表示浦和产2、浦和产3、冈山产2、冈山产3、千叶产2、千叶产3、冲绳产2、冲绳产3、加拿大产2和加拿大产3的赤拟谷盗的线粒体ND5基因区域的DNA的电泳条带照片。

图12为表示宝冢产1、宝冢产2和宝冢产3的赤拟谷盗的线粒体ND5基因区域的DNA的电泳条带照片。

图13为表示泰国产4、泰国产5、冲绳产4、冲绳产5、加拿大产4和加拿大产5的赤拟谷盗的线粒体ND5基因区域的DNA的电泳条带照片。

图14为表示使用不同引物组合的宝冢产1和加拿大产1的赤拟谷盗的线粒体区域的DNA的电泳条带照片。

图15为表示使用不同引物组合的宝冢产1和加拿大产1的赤拟谷盗的线粒体区域的DNA的电泳条带照片。

图16为表示使用不同引物组合的宝冢产1和加拿大产1的赤拟谷盗的线粒体区域的DNA的电泳条带照片。

图17为表示在实时PCR的数据分析中本州产的标记中使用的荧光色素(VIC)的检测结果图。

图18为表示在实时PCR的数据分析中本州产的标记中使用的荧光色素(VIC)的检测结果图。

图19为表示在实时PCR的数据分析中海外产的标记中使用的荧光色素(FAM)的检测结果图。

图20为表示在实时PCR的数据分析中海外产的标记中使用的荧光色素(FAM)的检测结果图。

图21为本发明的用于鉴定昆虫的栖息地的分析用计算机程序的概要图。

图22为用于鉴定昆虫的栖息地的分析用计算机程序中使用的计算机的概要图。

图23为表示与用于鉴定昆虫的栖息地的分析用计算机程序有关的计算机运行状况的图。

图24为表示在用于鉴定昆虫的栖息地的分析用计算机程序中使用的标记表(Merkmal Table)的图。

图25为表示来自通过加热或加压处理而人为劣化的赤拟谷盗的DNA的电泳条带照片。左侧照片表示方法A的PCR(扩增大小为435bp)的结果，右侧照片表示方法B的PCR(扩增大小为179bp)的结果。

图26为表示来自自然死亡的赤拟谷盗的DNA的电泳条带照片。

图27为表示来自通过γ射线照射而人为劣化的赤拟谷盗的DNA的电泳条带照片。

具体实施方式

下面，具体说明本发明，但本发明不限定于这些内容。本发明涉及一种制作用于鉴定同一种类的昆虫中的昆虫的栖息地的标记(Merkmal)的方法、该标记(Merkmal)、使用该标记(Merkmal)鉴定昆虫栖息地的方法、用于鉴定所述昆虫栖息地的引物及探针及用于鉴定昆虫栖息地的分析用计算机程序。

<本发明的概要>

本发明的特征在于使用标记(Merkmal)来鉴定同一种类的昆虫的栖息地。具体地说，提取被测昆虫的DNA，分析对应于本发明的标记(Merkmal)的碱基序列的区域的碱基序列，分析该碱基序列是否与标记(Merkmal)所对应的碱基序列一致，一致的情况下，将被测昆虫的栖息地鉴定为来自标记(Merkmal)的栖息地。

<本发明的昆虫>

本发明的“同一种类的昆虫”是指不具有栖息地的特征性的形态上的差异的昆虫，不只限于同一种的昆虫，只要是不具有栖息地的特征性的形态上的差异的昆虫，任何昆虫均可作为制作标记(Merkmal)的对象。因现在的分类学主要以形态上的差异将种进行分类，所以，属于同一种的昆虫具有同一形态。当具有同一形态的昆虫分布于世界各地时，由其形态特征来鉴定这些昆虫的栖息地则很困难。本发明的特征在于，将不能从形态特征上容易地鉴定栖息地的昆虫从分子生物学的角度出发迅速且简便地鉴定其栖息地。本发明的昆虫是属于占节肢动物门中昆虫纲的大部分的有翅亚纲的昆虫，优选属于鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目、半翅目、直翅目、蜻蛉目的昆虫，但不限于此。更加具体地说，如上所述，可例举独角仙等的鞘翅目(Coleoptera)；蝇、蚊、虻等的双翅目(Diptera)蜂、蚁等的膜翅目(Hymenoptera)蝶、蛾等的鳞翅目(Lepidoptera)蝉、椿象等的半翅目(Hemiptera)；蝗虫、蟋蟀等的直翅目(Orthoptera)(等的同类)；蜻蜒等的蜻蛉目(Odonata)等，但不限于此。

属于鞘翅目中拟步甲科(Tenebrionidae)的赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)，是小麦粉等的谷物粉、以及点心、面包类等二次加工品中最为熟知的害虫，是在家庭或食品店、制粉厂或饲料工厂中屡屡发生的昆虫，除美洲大陆北部、西伯利亚、英国等年平均气温为15℃以下的寒冷地区以外，几乎分布于全世界。而且不论日本国内外，不具有栖息地的特征性的形态上的差异，因此，优选作为本发明的昆虫。

制作本发明的标记(Merkmal)时使用的昆虫，例如可由昆虫销售商、昆虫代理商处零售买入或购买，也可使用在仓库、工厂、房屋、杂树林或草丛等的野外采集的昆虫或混入食物中的昆虫。通过分售、购入或采集等获得的昆虫要按各自的来源以隔离状态饲养，不能使来自各处的昆虫混合。

<本发明的昆虫的栖息地>

本发明的“昆虫的栖息地”是指昆虫栖息的地区。昆虫栖息地不一定与国家一致，即使在同一国家内但在被海隔离的地方，或即使是相邻的地区但在被河、山脉等隔离的地区，也有出现昆虫多样性的情况。另一方面，即使国家不同，但属于同一大陆时，也有分子生物学上同一的昆虫跨越多个国家生长发育的情况。而且，世界性运输手段发达的结果，在机场、港湾等物资的经由地，也有装货时混入的来自装货地的昆虫栖息的情况。此外，此种来自装货地的昆虫混入了的货物在运送到工厂等后进行拆包的结果，也有在该工厂等的周边地区栖息的情况。因此，本发明的“地区”是指在以国家为基准的基础上，也包含大陆、同一国内的地方和地区、机场和港湾等的物资的经由地及如上所述的仓库和工厂等。

<本发明的标记(Merkmal)>

本发明的“标记(Merkmal)”是指用于鉴定昆虫栖息地的指标，如以下的详细说明，按照基于单核苷酸多态性分类的各个类型，确定相应的栖息地。且相当于1个类型的栖息地可为1个地区，也可为2个以上的地区。例如，装货时混入的来自装货地区的昆虫在经由地栖息时，认为在装货地区栖息的昆虫与在经由地栖息的昆虫的类型识别位点属于同种类型，此时，1个类型相当于装货地区和经由地的2个地区。此外，如以下实施例、表1所示，1个地区中也可存在多个类型。具体地说，根据如下所示的表1，显示出除了来自日本本州的碱基，各个地区分别存在2种单倍型。在此，单倍型，是指虽然是同种生物体，但在相同的DNA上显示不同的多态性，表示包含多个单核苷酸多态性(SNP)的碱基序列的不同的位置的全部的模式。例如，如下所示的表1中，日本2类型的冲绳产2～5和日本3类型的冲绳产1、海外1类型的泰国产1及3～5和海外2类型的泰国产2、海外3类型的加拿大产1、4及5和海外4类型的加拿大产2及3为单倍型的关系。此时，在1个地区中存在多个类型。

在本发明的标记(Merkmal)制作中使用的昆虫的DNA碱基序列(以下也称为“测序数据”)，可以来自线粒体DNA，也可以来自核DNA。特别是为线粒体DNA时，考虑到与核DNA相比，碱基置换发生的速度快，大量发现各栖息地间的差异的可能性大，且单位细胞的数量多、可大量制作，所以分析容易，为优选。

作为本发明的标记(Merkmal)的例子，可例举如下表l中所示的标记(Merkmal)。表1表示赤拟谷盗的2个线粒体基因COI区及ND5区中的单核苷酸多态性的碱基分析的结果，作为各个栖息地的特征性的多态性在COI区有15个及在ND5区有5个，现在被分类为7个类型。使用该标记(Merkmal)时，例如，通过分析被测赤拟谷盗的线粒体DNA的COI区(379个碱基长)和ND5区(473个碱基长)，判定属于哪个类型，即可鉴定该赤拟谷盗栖息的地区。作为现在可判定的地区，可例举日本本州、冲绳、泰国、加拿大，但通过进一步分析来自其他栖息地的赤拟谷盗的线粒体DNA、调查其多态性，可增加标记(Merkmal)的种类，判定更多的地区。

<本发明的标记(Merkmal)的制作方法>

本发明涉及一种用于鉴定同一种类的昆虫中的昆虫的栖息地的标记(Merkmal)的制作方法，具体地说，包含以下工序：

(a)确定来自2个或其以上地区的1种或其以上的昆虫的DNA碱基序列的工序；

(b)对上述工序(a)中确定的碱基序列进行比对的工序；

(c)根据上述工序(b)的比对结果，从上述碱基序列中将全部的上述碱基序列中保守的1个或其以上的碱基形成的位点去除的工序；

(d)上述工序(c)的去除的结果，将剩余位点的全部或一部分作为类型识别位点的工序；

(e)对于上述工序(d)中得到的类型识别位点，比较相互对应的碱基，将完全一致的类型识别位点分类为相同类型，将不完全一致的类型识别位点分类为其他1个或其以上的类型的分类工序；和

(f)对于上述工序(e)中分类的类型，由属于各类型的昆虫的栖息地确定各类型的栖息地，从而将各类型的类型识别位点作为标记(Merkmal)的工序。

但是，本发明不限于这些方法，也可将通常已知的其他方法适当改变使用。

(a)确定来自2个以上的栖息地的1种以上的昆虫的DNA碱基序列的工序

本发明的标记(Merkmal)的制作使用来自2个或其以上的栖息地的1种或其以上的昆虫的DNA。

本发明的“来自2个或其以上的栖息地的DNA”是指使用2个或其以上、优选5个以上、进一步优选7个以上的具有相同形态、且相互之间栖息地不同的昆虫的测序数据。所使用的昆虫的栖息地可根据标记(Merkmal)的利用目的适当选择，但为了能看出各栖息地间的差异，可尽量选择认为是地理上相隔离的每个地区。此外，“1种或其以上的昆虫的DNA”是指使用1种或其以上、优选3种以上、更优选5种以上的来自上述各栖息地的昆虫的测序数据。由此，即可制作栖息地的特异性的、且可靠性高的标记(Merkmal)。

本发明的标记(Merkmal)制作中使用的昆虫的测序数据可以是独自按照通常的方法确定的从昆虫中提取的DNA的碱基序列。以下例举独自从昆虫中提取DNA并确定碱基序列的方法。

(1)昆虫的获得

首先，本发明中使用的“DNA”可通过从昆虫的整体或一部分(触角、胸部、翅、足等)中提取DNA来进行。优选对于蚤蝇等的小型昆虫，使用1只或数只个体的整体，对于家蝇或具有其以上的身长的大型昆虫，使用昆虫身体的一部分(触角、胸部(或其肌肉)、前翅、后翅、足等的任何部分)。

(2)DNA的提取

DNA的提取可使用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵(Cetyl trimethyl ammoniumbromide))法、市售试剂盒的Qiagen DNeasy Tissue Kit(QIAGEN公司)、ISOPLANTII(日本基因公司(NIPPON GENE CO.，LTD.))等本领域中公知的方法进行提取。从操作性和经济性方面考虑，优选CTAB法。

(3)DNA片段的扩增

将如上所述提取的DNA通过PCR法扩增。本发明中使用的PCR法无特别限定，不仅包含公知的PCR法，还包含各种改良方法。以下为其中一例。即除了引物组、模板DNA以外，将Tris-HCl、KCl、MgCl₂、各dNTP、TaqDNA聚合酶等的试剂类混合后作为PCR反应液。PCR的1个循环由热变性、退火、通过DNA聚合酶的DNA链的延伸(合成)反应的3个步骤构成。各步骤各自不同，有时需要相同的反应温度和反应时间，这些根据应扩增的DNA区域的碱基序列、其长度等适当确定。此种操作可使用市售的基因扩增仪(thermal cycler)进行。

作为本发明中使用的引物的一例，如实施例中所记载，可使用昆虫的系统分析中使用的已有的来自线粒体细胞色素氧化酶亚基(cytochrome oxidasesubunit)I(COI)基因的引物组(L6625/H7005(序列号13及14))和/或来自NADH脱氢酶亚基(dehydrogenase subunit)5(ND5)基因的引物组(F6999/R7495(序列号15及16))。

此外，对于一部分的昆虫种，有时已有的引物不能扩增出目的条带，这种情况下，以夹有标记(Merkmal)的碱基的形态，即夹有含有标记(Merkmal)的碱基的区域的形态设计、使用适当的引物。上述引物优选选择可扩增更多昆虫种中目的条带的引物。

(4)PCR扩增的确认

作为PCR的结果(PCR产物)的评价方法，使用可鉴定特定的DNA片段的任意方法、例如电泳、凝胶过滤、杂交来确认目的大小的DNA片段是否被扩增。例如，使用来自上述线粒体COI基因的引物组时，确认出扩增了435个碱基长的大小，同样使用来自ND5基因的引物组时，确认出扩增了513个碱基长的大小。

(5)PCR产物的纯化

经扩增的PCR产物为了作为循环测序反应的模板使用，与剩余的引物等反应中使用的成分分离。此纯化例如可使用市售的QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN公司)，根据其产品中附带的实验方法进行。

(6)循环测序反应及测序产物的纯化

为进行如上所述的纯化的PCR产物的测序，以其为模板，进行循环测序反应。此方法与PCR法类似，使用基因扩增仪(thermal cycler)，重复进行热变性、退火、通过DNA聚合酶的DNA链延伸反应的3个步骤，使用任1种的引物，合成在用各个碱基不同的4种荧光色素标记的终止子存在下长度不同的各种单链DNA的方法。循环测序的方法，例如可使用市售的BigDye Terminator vl.1Cycle Sequencing Kit(ABI公司)。具体地说，可根据该试剂盒的日语版实验方法(p.22“单链DNA、双链DNA的循环测序”、p.25“GeneAmpPCR System9700，9600，2700，2400中的循环测序”及用p.38-40“旋转柱(或旋转板(Spin Plate))的纯化法”)来进行。且所使用的引物的碱基序列可与目的DNA片段在通过PCR进行的扩增中所使用的引物相同。即在将PCR产物的纯化液根据需要用灭菌蒸馏水稀释后的产物中加入规定物质，制作循环测序反应液。将该反应液加入到PCR用微管(microtube)中，放入PCR装置，进行变性(例如，96℃、1分钟)后，将变性(例如，96℃、10秒)、退火(例如，50℃、5秒)、链延伸(例如，60℃、4分钟)的反应例如重复25次。且在反应终止后，不立刻取出样品时，可降低样品块(block)的温度进行保存。

其后，从上述中得到的反应液中纯化测序产物、即单链DNA的混合液，制作供给以后步骤的测序仪的试样。作为该方法的一例，可例举使用CENTRISEPSpin Column(ABI公司)的方法，根据附带的实验方法进行操作，得到目的试样。

(7)DNA片段的测序

对于用上述终止法测序(Dye Terminator)得到的测序产物进行测序。作为方法一般使用电泳法，作为一例，使用ABI PRISM 310Genetic Analyzer进行电泳，利用标记中使用的荧光物质因各个碱基不同而不同的现象，通过激光荧光检测器，按顺序确定碱基序列。

(8)碱基序列的分析

分析己确定的碱基序列，得到测序数据。例如为来自线粒体COI基因及ND5基因的引物组时，分别得到从5’端(引物L6625、或F6999端)和3’端(引物H7005、或R7495端)开始的300～600个碱基长度的测序数据。将分别得到的测序数据进行核对以确定正确的碱基序列。

本发明的标记(Merkmal)中使用的昆虫的测序数据可以使用如上所述的独自根据通常的方法确定的从昆虫中提取的DNA的碱基序列，还可使用从公开数据库得到的已知的测序数据。作为已知的测序数据，例如可使用GeneBank(NIHgenetic sequence database)、DDBJ(DNA Data Bank of Japan)等的数据库中登记的昆虫的测序数据。从这些数据库中检索、下载的测序数据可直接或提出连续的一定区域后供给比对(多重序列比对分析)。此时，也可使用数据库中登记的已确认过测序数据来源的昆虫的采集地等的其栖息地的数据。

(b)对碱基序列进行比对的工序

对于如上所述得到的实际分析的结果或已知数据，对于每2个以上的栖息地，选择至少1个昆虫个体的测序数据，以进行上述比对。

本发明的比对是指将每个个体中得到的多个碱基序列横向排列，纵列使相同的位点对齐排列，以分析碱基序列相互之间的异同。此种操作也称为多重序列比对，是在分子生物学领域中，在某碱基序列中的基序的提取、具有特定碱基序列的结构或功能的预测、系统进化树的制作中常用的方法。因此，本发明的比对也包含使用DNAspace(日立软件(Hitachisoft)公司制)等的分析用计算机程序等、这些分析中通常使用的任何操作。作为本发明中供比对的测序数据，可使用20个碱基以上、优选50个碱基以上、更优选20～10000个碱基、进一步优选50～5000个碱基长度的碱基序列。

且因本发明中使用的来自多种昆虫的测序数据如上所述供给比对，所以必须含有共有的区域(以下称“共有区”)。因此，例如将实际分析中得到的测序数据、即使用所需引物扩增、测序的区域定为共有区，从公开数据库中选择含有该区域的测序数据，直接或提出连续的一定区域来使用。更具体地说，将种、亚种的名称和由基因编码的蛋白质(酶等)的名称等作为关键词检索、或基于实际分析中得到的测序数据进行同源性检索(BLAST检索)，从具有实际分析中得到的测序数据区域的测序数据中选择、下载。下载的测序数据可直接或提出连续的一定区域后在比对(多重序列比对分析)中使用。对于此共有区的选择无特别限制，可以是表达线粒体ND5基因等的特定功能或结构的区域，也可以是作为基因不发挥功能的区域。在预先已知是各栖息地间有多数差异的区域时，优选选择该区域。例如，因线粒体基因组其自身拷贝数多，而且还不具有修复功能，进化速度快，所以认为可大量发现各栖息地间的差异的可能性大，且是母系遗传，可更好地反映出系统关系，因而优选。而且，认为线粒体COI基因及ND5基因的进化速度快，可大量发现各栖息地间差异的可能性大，所以作为标记(Merkmal)的共有区特别优选。此外，优选该区域是可用PCR法扩增的区域。例如，可例举使用实施例中记载的引物进行扩增的区域。且共有区的大小为测序可靠性高的约20～2000碱基、约50～1000碱基、优选100～700碱基、进一步优选100～500碱基。

且用于制作标记(Merkmal)的共有区不限于1个区域，也可选择多个区域。通过选择多个区域，可制作栖息地特性更高的标记(Merkmal)。具体地说，如以下实施例中记载，将赤拟谷盗的COI基因区域内及ND5基因区域内的序列在互联网上使用EMBL-EBI的ClustalW2等分析用计算机程序进行多重序列比对分析，确认出各区域中存在单核苷酸多态性(SNP)，通过将这些组合，即可制作赤拟谷盗的栖息地所特有的标记(Merkmal)。

(c)将全部的上述碱基序列中保守的碱基去除的工序

如此，根据比对的结果，从上述碱基序列中将全部的上述碱基序列中保守的1个或其以上的碱基形成的位点去除。这样，通过将全部的上述碱基序列中保守的碱基的区域去除，可明确地确认出单核苷酸多态性的存在，且在其以后的工序中可容易地进行基于单核苷酸多态性的分类。

具体地说，从通过比对得到的数据中，选取全部个体的碱基序列中碱基保守的位点。“碱基保守”是指所得到的比对数据的纵列为全部个体的碱基序列中完全相同的碱基。将所选取的位点全部去除。将保守的位点全部去除的理由如下。

即比较同一形态的昆虫的碱基序列时，可认为大部分的碱基在全部个体中共有存在。但是，本发明的特征在于着眼于去除了全部个体中共有部分的单核苷酸多态性的部分，发现了该单核苷酸多态性与栖息地具有相关性，并且基于该发现来制作标记(Merkmal)。

选取方法只要是可选取出全部个体的碱基序列中保守的碱基的方法，可使用目视、机械运行等的任何方法。

(d)制作类型识别位点的工序

将进行了上述去除后剩余的位点的全部或一部分作为类型识别位点。本发明的类型识别位点由同一形态且来自栖息地互不相同的昆虫的碱基序列的全部中非保守的碱基位点的全部或一部分组成。“非保守的碱基”是指所得到的比对数据的纵列为在全部个体的碱基序列中的不完全相同的碱基，即使是来自1个个体的碱基不相同时，也不能判断为保守。本发明的标记(Merkmal)中的类型识别位点由该非保守的碱基构成，但在有可靠性显著低下的位点或判断为几乎与栖息地特性无关的位点等存在时，也可从类型识别位点中将该位点去除。类型识别位点中所包含的碱基数为1个以上、优选3～50个、更优选5～30个、进一步优选15～30个。

(e)分类工序

其后，比较全部个体的上述类型识别位点中相互对应的碱基，进行分类。即，将完全一致的类型识别位点分类成同一类型，而将不完全一致的类型识别位点分类成其他的1个或其以上的类型。在此，“完全一致的类型识别位点”是指构成类型识别位点的全部碱基完全相同之意，“不完全一致的类型识别位点”是指构成类型识别位点的全部碱基中的一处以上有不同的碱基之意。此结果，其他的类型也可以是1个或其以上。

(f)制作标记(Merkmal)的工序

最后，对于被分类的各个类型，通过由属于各类型的昆虫所来源的栖息地来确定各类型的栖息地，从而可将各类型的类型识别位点作为标记(Merkmal)。具体地说，在综合判断与属于某种类型的昆虫所来源的栖息地及属于其他类型的昆虫所来源的栖息地之间的地理关系、及属于某种类型的昆虫的获得方法等的来源等的基础上，来确定认为是相当于某种类型的栖息地。

例如，如以下表1所示的赤拟谷盗的标记(Merkmal)时，作为一例，属于日本1类型的昆虫所来源的栖息地为浦和、冈山、千叶、宝冢，属于日本2类型的昆虫所来源的栖息地为冲绳，此外，属于日本3类型的昆虫所来源的栖息地也为冲绳，属于海外1类型的昆虫所来源的栖息地为泰国。由此，认为是相当于日本1类型的栖息地确定为以海相隔的日本本州，可将日本1类型的类型识别位点确定为日本本州的标记(Merkmal)。此外，可将日本2类型及日本3类型的类型识别位点确定为冲绳的标记(Merkmal)。

且本发明的标记(Merkmal)通过在至今为止积累的测序数据中追加新的测序数据，进行制作上述标记(Merkmal)的工序(b)以后的工序，从而可改良为精度更高的标记(Merkmal)。例如，通过追加在日本本州的上述浦和、冈山、千叶、宝冢以外的地区栖息的昆虫的测序数据而制作标记(Merkmal)，根据情况，也可追加与日本1类型不同的其他本州的标记(Merkmal)。还可通过追加在泰国周边的地理上未隔离的地区栖息的昆虫的测序数据而制作标记(Merkmal)，而将相当于海外1类型的地区从泰国变更为泰国及其周边地区。

<本发明的地区识别标记(Merkmal)>

本发明也可制作用于鉴定昆虫栖息的地区是否是某地区的地区识别标记(Merkmal)。

本发明的“地区识别标记(Merkmal)”是指如上所述的用于鉴定昆虫栖息的地区是否是某地区的标记(Merkmal)，例如，作为一例，是指可判断出被测昆虫是以日本本州内为栖息地的赤拟谷盗还是在其以外的地区栖息的赤拟谷盗的标记(Merkmal)。

本发明的“地区识别标记(Merkmal)”可如下制作。即，是包含下述工序的方法：对于用上述<本发明的标记(Merkmal)的制作方法>中记载的方法得到的标记(Merkmal)，比较相互对应的碱基，选取只在1个类型中存在而在其以外的类型中不存在的碱基的工序；和将上述工序中选取的1个或其以上的碱基单独或多个组合后以作为地区识别标记(Merkmal)的工序。且只要是只在1个类型中存在，而在其以外的类型中不存在的碱基，均可作为本发明的地区识别标记(Merkmal)，而且在其以外的类型的碱基相同时，可进行更高精度的识别。

作为本发明的地区识别标记(Merkmal)的例子，在如下表1所示的标记(Merkmal)中，例如COI区的第229位的碱基在日本1类型中为G，而在其以外的类型中为A，“第229位的碱基为G”即可作为用于将日本1类型与其他类型识别的指标、即可作为地区识别标记(Merkmal)。同样，第253位的碱基为T、及第298位的碱基为G、ND5区的第248位的碱基为A，也分别为日本1类型所固有的碱基，从而可作为将日本1类型与其他类型识别的指标。此外，例如COI区的第22位的碱基在加拿大类型(海外3类型及海外4类型)中为T，在其以外的类型中为A，“第22位的碱基为T”即可作为用于将加拿大类型与其以外的类型识别的指标、即可作为地区识别标记(Merkmal)。同样，第142位的碱基为G也为加拿大类型所固有的碱基，可作为将加拿大类型与其以外的类型识别的指标。表1表示赤拟谷盗的2个线粒体基因COI区及ND5区中单核苷酸多态性的碱基分析的结果。使用该标记(Merkmal)时，例如，只要被测赤拟谷盗的(1)COI区的第229位的碱基为G、第253位的碱基为T、第298位的碱基为G中的任一个或2个以上、和/或(2)ND5区的第248位的碱基为A，即可知该赤拟谷盗为以日本本州为栖息地的赤拟谷盗。此外，只要被测赤拟谷盗的COI区的第22位为T和/或第142位的碱基为G，即可知该赤拟谷盗为以加拿大为栖息地的赤拟谷盗。

本发明的地区识别标记(Merkmal)中，鉴定1个地区的标记(Merkmal)不只限于1个地区识别标记(Merkmal)，也可为多个地区识别标记(Merkmal)。

<使用本发明的标记(Merkmal)鉴定昆虫的栖息地的方法>

本发明还提供用于鉴定昆虫的栖息地的方法。具体地为如下形成的用于鉴定被测昆虫的栖息地的方法：比较具有上述本发明的标记(Merkmal)的区域的碱基序列、和从被测昆虫中得到的碱基序列中的与具有所述标记(Merkmal)的区域的碱基序列相对应的碱基序列，分析被测体的所述碱基序列中的与标记(Merkmal)相对应的位点的碱基是否与标记(Merkmal)的碱基一致，从而鉴定被测体的栖息地。

(a)碱基序列的比较

在使用本发明的标记(Merkmal)鉴定昆虫的栖息地的方法中，首先，比较具有上述本发明的标记(Merkmal)的区域的碱基序列、和从被测昆虫中得到的碱基序列中的与具有所述标记(Merkmal)的区域的碱基序列相对应的碱基序列。

比较可通过视觉检查、数学计算进行。或者也可使用计算机程序进行。

以下，具体的比较方法例举使用分析用计算机程序时的方法。即，将包含表示通过上述方法得到的标记(Merkmal)的碱基的数据、和表示所述碱基的碱基序列位置的数据的标记表(Merkmal Table)预先存入运行SeqScape(ABI公司)等的分析用计算机程序的计算机内。存入的标记表(Merkmal Table)可以为1个，也可以为多个。而且，将包含表示从被测昆虫中得到的碱基的数据的被测体碱基序列表存入所述计算机内。对于来自被测体的碱基序列，可通过用与上述<本发明的标记(Merkmal)的制作方法>中的“(a)确定来自2个以上的栖息地的1种以上的昆虫的DNA碱基序列的工序”中记载的方法同样的方法提取DNA、分析被测体的碱基序列来获得。此时，制作被测体的碱基序列为含有与作为标准的标记(Merkmal)相同的区域的序列。而且，参照所述标记表(Merkmal Table)表示的所述碱基序列位置的数据，将表示位于被测体碱基序列表和所述标记表(Merkmal Table)之间相对应的碱基序列位置上的碱基的数据用所述计算机进行比较。比较可通过所述分析用计算机程序将两者的碱基序列进行比对来进行。

(b)标记(Merkmal)和被测体的碱基的分析

在使用本发明的标记(Merkmal)鉴定昆虫的栖息地的方法中，在进行了上述(a)的比较后，通过分析被测体的所述碱基序列中的与标记(Merkmal)相对应的位点的碱基是否与标记(Merkmal)的碱基一致，从而鉴定被测体的栖息地。

具体地说，分析被测体的碱基序列中相当于标记(Merkmal)的位点的碱基与所述标记(Merkmal)的碱基是否完全一致，完全一致时，即可说明被测体是来自所述标记(Merkmal)所属的栖息地的昆虫。此外，即使不完全一致时，也可预测被测体的栖息地。例如，即使标记(Merkmal)的碱基中1个或多个不一致而其以外的碱基一致时，也有时可从其标记(Merkmal)的栖息地在某种程度上预测地区。

如此，使用本发明的标记(Merkmal)时，即可鉴定被测昆虫的栖息地。使用计算机进行分析时，预先记录具有与多个栖息地有关的标记(Merkmal)的区域的碱基序列的情况下，通过将被测体的碱基序列与各栖息地的碱基序列按顺序进行比较、分析，从而可简单且迅速地鉴定被测昆虫的栖息地。

通过将作为标记(Merkmal)而确定的特定碱基进行标示(marking)等的标识，也可容易地实行上述比较。即，首先，对具有已着色的对照碱基(标记(Merkmal))的碱基序列、和来自被测体的碱基序列进行比对后，只将已着色的碱基选出并制成两者进行比较的表。由此，即可容易地识别碱基的种类和存在的位置是否完全一致，进而可容易地识别被测昆虫是否属于其标记(Merkmal)的栖息地。因为此方法也可对多个被测体同时进行分析，所以优选。

<用于鉴定昆虫的栖息地的分析用计算机程序>

本发明也可提供在计算机上实行用于鉴定本发明的昆虫的栖息地的方法的分析用计算机程序。

使用本发明的标记(Merkmal)用于鉴定昆虫的栖息地的分析用计算机程序，具备包含表示标记(Merkmal)的碱基的数据、及表示所述碱基的碱基序列位置的数据的标记表(Merkmal Table)。具体地说，是将分析中使用的主机作为包含如下存储单元(1)和比较单元(2)的单元，为了实行上述昆虫的栖息地的鉴定而使其硬件资源相互协调而发挥功能的计算机用的程序(图21)，其中，所述存储单元(1)存入包含表示从被测昆虫中得到的碱基的数据的被测体碱基序列表，所述比较单元(2)参照所述标记表(Merkmal Table)表示的所述碱基序列位置的数据，比较表示位于被测体碱基序列表和所述标记表(MerkmalTable)之间相对应的碱基序列位置上的碱基的数据。与本发明有关的上述计算机具备输入装置(3)、输出装置(4)、存储装置(5)及CPU(6)等一般性的硬件资源(图22)。本发明的单元可通过该硬件资源的组合而实现，这一点本领域技术人员应很清楚。

为了使用上述本发明的分析用计算机程序来鉴定昆虫的栖息地，希望具备与昆虫的各栖息地有关的多个标记表(Merkmal Table)。在此，1个标记表(Merkmal Table)可以只与1个栖息地有关，也可与2个以上的栖息地有关。此外，本发明的分析用计算机程序存入可与网络连接的计算机可存取的信息存储单元(ROM、RAM等)，从而可使计算机作为鉴定上述栖息地的必需单元而发挥作用、进行必要的处理。因此，本发明的分析用计算机程序可用本发明中使用的计算机或通过网络可利用的任意的程序语言记载。具体地说，也可使用在运行SeqScape(ABI公司)等的分析用计算机程序的计算机中存入有各昆虫的各栖息地的标记(Merkmal)的程序。此外，本发明的分析用计算机程序还可以是使计算机如下工作的程序(图23)。即，存在至少1个以上标记表(Merkmal Table)时，在预先存入计算机的存储装置时或可进行存储(SO)时，可各自编号进行区分。而且，标记表(Merkmal Table)包含作为第1列的表示碱基序列中的标记(Merkmal)的碱基的数据、作为第2列的表示所述碱基的碱基序列位置的数据(图24)。例如，碱基A、T、G、C可分别作为被编码成ASCII代码(美国国家信息交换标准代码)“A”“T”“G”“C”的数据来表示。且在本说明书及图中，将m号的标记表(Merkmal Table)的第r行第c列的数据记为“标记(Merkmal)m[c][r]”。

(i)在存储装置中存入被测体碱基序列表(S1)。且被测体碱基序列表包含表示从被测昆虫中得到的碱基的数据(图24)。且n号的数据对应碱基序列位置n的碱基。将被测体碱基序列表的n号的数据记为“被测体碱基序列[n]”。

(ii)从存储装置中存储的1个以上的标记表(Merkmal Table)中选择1个。该处理，例如可通过在程序上，在表示比较的标记表(Merkmal Table)编号的变量m中代入适当的值(在此值为1)来实现(S2)。

(iii)比较m号的标记表(Merkmal Table)全部行的第l列的数据、和与其对应的被测体碱基序列表的数据。此对应关系可通过参照标记表(MerkmalTable)的第2列来解决(图24)。该处理，例如在程序上，可使用表示应参照的标记表(Merkmal Table)的行的变量r，通过循环(loop)处理来实现(S3～S8)。

(iv)在(iii)中，比较m号的标记表(Merkmal Table)的全部行后，比较的数据完全一致时，可将与此标记表(Merkmal Table)相关的地区鉴定为被测昆虫的栖息地。此时，进行可鉴定栖息地的情况下的处理(S10)。该处理是通过输出装置进行与此标记表(Merkmal Table)相关的地区的通知等。

(v)在(iii)中，在相对于m号的标记表(Merkmal Table)的比较中，即使有一次存在不一致的数据时，也需相对于其他标记表(Merkmal Table)重复进行(iii)的处理(S12)。已对于全部的标记表(Merkmal Table)进行了重复处理时(S11)，进行没有完全一致的标记表(Merkmal Table)时的处理(S13)。该处理是通过输出装置来进行适当的信息通知等。

如<使用本发明的标记(Merkmal)鉴定昆虫的栖息地的方法>(b)中的说明，即使标记(Merkmal)的碱基序列和与被测昆虫的标记(Merkmal)所对应的区域的碱基序列不完全一致时，也可预测被测体的栖息地。例如，即使在标记(Merkmal)的碱基中1个或多个不一致而其以外的碱基一致的情况下，有时也可由其标记(Merkmal)的栖息地在某种程度上预测地区。因此，本发明的上述分析用计算机程序中，不是对于标记表(Merkmal Table)进行处理，而是通过对于包含表示标记(Merkmal)中的仅在某栖息地的昆虫中保守的碱基的数据、和表示所述碱基的碱基序列位置的数据的保守区域表(Table)进行上述的处理，也可鉴定被测昆虫的栖息地。此保守区域表(Table)的数据结构与标记表(Merkmal Table)相同。

为使本发明的分析用计算机程序在计算机上运行，除使用本发明的分析用计算机程序以外，也可使用通过通常的计算机网络利用时的必要的程序，例如众所周知的操作系统(OS)、互联网浏览器程序等。在众所周知的操作系统中，可例举Windows(注册商标)、Mac OS、Linux、FreeBSD、Solaris等，但不限于此。

此外，本发明的分析用计算机程序，可将各种昆虫、各个栖息地等的标记(Merkmal)的标准数据及使用该数据进行鉴定的程序按各个分类存储保存。由此，可迅速地进行被测体栖息的地区的鉴定，所以优选。

<计算机可读取记录介质>

本发明的分析用计算机程序，可在计算机可读取记录介质或可与计算机连接的存储单元上记录，并且根据需要进行读取，从而可在计算机上运行、使用。因此，含有本发明的分析用计算机程序的计算机用记录介质或存储单元也包含在本发明中。此种记录介质或存储单元中有软盘、硬盘、记忆存储装置等的磁性介质，CD、DVD等的光学介质，MO、MD等的磁光介质等，但不限于此。

此外，本发明的分析用计算机程序，可通过信息传输介质或用无线方式从与网络连接的其他计算机上根据需要下载，从而在计算机上运行、使用。信息传输介质，是指用于将本发明的分析用计算机程序、程序信息作为载波而传送供给的计算机网络系统中的通信介质，作为此种信息传输介质，可例举10BASE-T电缆、100BASE-TX电缆、1000BASE-TX电缆等，但不限于此。

本发明的分析用计算机程序，可通过信息传输介质或用无线方式在与网络连接的其他计算机上运行，并由计算机上运行的客户端程序进行访问来使用。作为计算机网络系统，可例举局域网(LAN(Local Area Network))、因特网等的广域网(WAN(Wide Area Network))、城域网(MAN(Metropolitan AreaNetwork))、企业内部网、存储区域网络(SAN(Storage Area Network))、无线通信网络等的系统，但不限于此。作为通信介质，可例举光纤、无线电路等，但不限于此。作为客户端程序，可例举WEB浏览器、终端软件、本分析用计算机程序专用的客户端软件等，但不限于此。

<鉴定昆虫的栖息地的方法中使用的引物及探针>

本发明还提供鉴定昆虫栖息地的方法中使用的引物及探针。

在具有本发明的标记(Merkmal)的单核苷酸多态性的碱基中，可选择某栖息地的特异性碱基，以该碱基为中心设计引物及探针。使用此引物及探针，以来自被测昆虫的DNA为模板进行PCR扩增时，可将进行了扩增的情况(阳性)鉴定为来自其栖息地的昆虫，而未经扩增的情况(阴性)即可知不是来自该栖息地的昆虫。某栖息地的特异性碱基具体地说可用上述<本发明的地区识别标记(Merkmal)>中记载的方法选择。

例如，在表1的赤拟谷盗的COI基因的分析区域中，可确认从5’末端开始的第229位和298位的碱基具有单核苷酸多态性。即在日本1类型中，这些碱基为G，而日本本州以外的地区栖息的昆虫(以后也有时记载为“海外产”)的这些碱基为A。着眼于此不同，如以下实施例所记载，例如，可设计日本1类型的特异性引物(以后也有时记载为“本州产用引物”)及海外产的特异性引物(以后也有时记载为“海外产用引物”)。具体地说，可设计以下实施例中所示的含有序列号17～24所示的核酸的引物。这样，因本发明的上述单核苷酸多态性中碱基的不同在于A及G，所以可更高精度地鉴定出在本州产用引物中显示阳性，而在海外产用引物中显示阴性的昆虫即为日本本州栖息的昆虫，因而优选。即只要是只在1个类型中存在，而在其以外的类型中不存在的碱基，即可作为本发明的引物，而且在其以外的类型的碱基相同的情况下，可进行更高精度的识别。

具体地说，本发明的引物可鉴定出赤拟谷盗是否为在日本本州栖息的赤拟谷盗。具体地说，通过适当组合上述引物对或通过改变各引物中所含有的碱基等，可制作鉴定赤拟谷盗是否为日本本州栖息的赤拟谷盗的引物。例如，如表1所示，在赤拟谷盗的ND5基因的分析区域中，从5’末端开始第248位的碱基在日本1类型中为A，在海外产中为G，可设计如以下实施例中所记载的包含序列号25～29所示的核酸的引物及共有引物(3’端)。使用此种引物及探针，即可制作只有日本1类型、即来自日本本州栖息的昆虫的DNA为阳性，而来自其以外的地区的昆虫的DNA为阴性的引物及探针。例如，通过使用只给此日本1类型带来阳性结果的引物，即可鉴定被测昆虫是否为日本本州栖息的昆虫。

<使用本发明的引物、探针鉴定昆虫栖息地的方法>

本发明提供使用上述引物、探针鉴定昆虫栖息地的方法。具体地说，为包含以下工序的方法：(a)提取被测昆虫的DNA的工序；(b)使所述工序(a)中提取的DNA与本发明的引物和/或探针接触的工序；(c)扩增DNA片段的工序；及(d)鉴定被测昆虫的栖息地的工序。以下，具体说明各工序。

(a)提取被测昆虫的DNA的工序，可用与上述<本发明的标记(Merkmal)的制作方法>中的“(a)确定来自2个以上栖息地的1种以上的昆虫的DNA碱基序列的工序”中的“(2)DNA的提取”中记载的方法同样的方法提取DNA。

(b)使提取的DNA与本发明的引物和/或探针接触的工序

只要是在适合PCR的扩增反应的条件下使其接触，可使用任何方法，也可使用市售的试剂盒等。例如，可使用PerfectShot Ex Taq(Loading dye mix)(TAKARA BIO株式会社)，根据附带的使用手册配制PCR反应液(50μl；0.2ml容量的微管)，添加引物和/或探针和模板(模板DNA)，使其为适当的最终浓度，从而制成PCR反应液。

(c)扩增DNA片段的工序

DNA片段的扩增可使用公知的方法。例如，也可使用实时PCR。作为PCR的扩增条件，只要是应为阳性的引物和/或探针和模板扩增的条件，也可使用任何条件。例如，可以使用上述的PCR反应液，在进行94℃、3分钟的变性后，在重复40次变性(94℃、30秒)、退火(55℃、45秒)、链延伸(72℃、60秒)的反应的PCR条件下进行。

(d)鉴定被测昆虫的栖息地的工序

鉴定被测昆虫的栖息地时，确认有无上述(c)中进行的PCR的扩增，分析该结果。

具体地说，将上述得到的PCR反应液的适量在适当的条件下供给琼脂糖凝胶电泳后，在溴化乙锭溶液中染色，在UV照射下对扩增产物拍摄照片，确认目的DNA片段是否已被扩增。例如，赤拟谷盗的COI基因的希望大小为110个碱基长，ND5基因的希望大小为139个碱基长。因被扩增时可看见目的DNA片段的条带，所以，可看见条带时证明来自被测体的DNA相对于该引物为阳性，从而可鉴定被测昆虫是来自该引物的栖息地的昆虫。

作为工序(c)的扩增DNA片段的工序，本发明还可使用实时PCR法。此时，可使用在具有本发明的标记(Merkmal)的单核苷酸多态性的碱基中，选择某栖息地的特异性碱基，并以该碱基为中心设计、合成的探针及引物。例如，引物及探针的设计及合成也可利用ABI公司的Custom TaqMan(R)基因表达/单核苷酸基因类型分析服务(Gene Expression/SNP Genotyping Assays)。使用该ABI公司的TaqMan(注册商标)MGB探针时的原理如下说明。

首先，准备可扩增基因组上含有SNP的区域的PCR引物1组和与基因组DNA的1碱基突变相对应的Taqman(注册商标)MGB探针2种。基本上，混合该引物和具有与等位基因1和等位基因2互补的序列的2种Taqman(注册商标)MGB探针及模板DNA，进行PCR，检测出2种等位基因的SNP。具体地说，本发明中使用的探针除了将5’末端用FAM或VIC的荧光报告基团标记以外，还在3’末端附加非荧光淬灭基团(NFQ)和小型凹槽结合物(Minor Groove Binder(MGB))。即，此探针以单体存在时，照射报告基团激发光(488nm)时荧光报告基团激发而发出荧光(530-560nm左右)，但因此报告基团的荧光波长被荧光淬灭基团吸收，且荧光淬灭基团不发出荧光，所以，报告基团的荧光被抑制。将此TaqMan(注册商标)MGB探针用于PCR反应时，在延伸步骤中与PCR引物同时与模板DNA杂交后的该探针因Ampl iTaq DNA聚合酶的5’一3’核酸外切酶活性而水解。其结果，不仅荧光报告基团游离，报告基团的荧光强度增加，而且与NFQ相连的MGB掺入到探针和模板DNA杂交后的小沟(间隙)中结合。由此，探针和模板DNA的结合力增高，Tm值上升。Tm值上升时，即使是短序列，也可更加明确地识别出1碱基的差别。PCR的结果，也可通过使用检测预先用探针标记的荧光物质的检测器、确认有无扩增从而获得。

以下，通过实施例进一步具体地说明本发明。但本发明不限于实施例。

实施例1

1.来自昆虫的测序数据

(a)昆虫

DNA提取中使用的昆虫是属于鞘翅目拟步甲科的赤拟谷盗，作为在包含日本在内的世界各地栖息的同一形态的昆虫、并且作为小麦粉等的谷物粉的重大害虫而最为熟知。本实施例中使用的赤拟谷盗采集了7个地区栖息的赤拟谷盗，分别个别饲养。其具体为从千叶县内的新建房屋采集的千叶产、从浦和的野外采集的浦和产、从冈山县内的非新建房屋采集的冈山产、购入SumikaTechnoservice公司在宝冢采集并饲养的宝冢产、在冲绳县内采集的冲绳产、混入2006年5月在泰国购入的腰果中的泰国产、混入从加拿大出口香港的小麦粉中的加拿大产。DNA的提取通常使用这些昆虫的全部。

(b)DNA提取

在DNA提取中，如以下说明，将使用CTAB法提取的DNA用PCR扩增，进行测序，得到测序数据。

通过CTAB法的DNA的提取方法如下：

配制以2％(w/v)CTAB(Calbiochem公司制)、100mM Tris-HCl(pH8.0)、20mM EDTA(pH8.0)、1.4M NaCl、1％(w/v)PVP(聚乙烯吡咯烷酮：Polyvinylpyrrolidone)为组成的CTAB液。将该CTAB液650μl与被测昆虫同时放入微量均质器。而后，将加入了该被测体和CTAB液的微量均质器浸入65℃的恒温水槽中孵育10分钟以使内部的试样浸渍。之后，用与微量均质器的玻璃管(底部为磨砂玻璃状)配套的顶端为球状的磨砂玻璃制玻璃棒(加工成与玻璃管的底部相配)研磨被测体后，加入lmg/ml RNaseA溶液2μl，65℃、孵育1小时后破碎昆虫的细胞。将其移入1.5ml容量的微管中，加入等量(650μl)的苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，用手颠倒混和3分钟。进行短时间的离心分离(Beckman Allegra 21R Centrifuge F2402H；15,000rpm(约15,000×g)、进行1～5分钟))，分离成有机溶剂层(下层)和水层(上层)，将水层(约400μl)移入新的微管中。加入等量的异丙醇，颠倒混和后，与上述同样进行离心分离。弃上清，将沉淀用70％乙醇淋洗、干燥，将干燥后的产物溶解于20～50μl的TE缓冲液中作为DNA试样。

(c)PCR

DNA片段的扩增使用PerfectShot Ex Taq(Loading dye mix)(TAKARA BIO株式会社)，根据附带的使用手册配制PCR反应液(50μl；0.2ml容量的微管)。其中，引物和模板(模板DNA)的添加量(最终浓度)、及PCR条件如下。

1)线粒体COI基因的分析

引物组；

L6625 5’-CCGGATCCTTYTGRTTYTTYGGNCAYCC-3’(序列号13)1μM

H7005 5’-CCGGATCCACANCRTARTANGTRTCRTG-3’(序列号14)1μM

模板；1μl/50μl反应液

将该微管放入PCR装置(DNA thermal cycler GeneAmp PCR System 9600；旧Perkin Elmer公司制，或TaKaRa PCR thermal cycler PERSONAL)，在以下条件下进行PCR扩增：

变性：94℃、1分钟

退火：60℃、1分钟

链延伸：70℃、2分钟

上述反应重复50次。且在反应终止后不立刻取出样品时，将样品块(block)的温度降至4℃保存。

2)线粒体ND5基因的分析

引物组；

F6999 5’-AAACAGTTAAAMCARTWGAA-3’(序列号15)1μM

R7495 5’-CCTGTWTCWDCTTTAGTWCA-3’(序列号16)1μM

模板；1μl/50μl反应液

将该微管放入PCR装置(DNA thermal cycler GeneAmp PCR System 9600；旧Perkin Elmer公司制，或TaKaRa PCR thermal cycler PERSONAL)，在以下条件下进行PCR扩增：

预变性：94℃、3分钟

变性：94℃、30秒

退火：45℃、45秒

链延伸：72℃、60秒

将除预变性以外的上述反应重复进行40次。且在反应终止后不立刻取出样品时，将样品块(block)的温度降至4℃保存。

(d)PCR扩增的确认

将上述得到的PCR反应液的5μl供给琼脂糖凝胶电泳。此时，使用微型凝胶电泳系统“Mupid”进行电泳(凝胶；3％NuSieve3：1琼脂糖(FMC BioProducts公司制、或Cambrex Bio Science Rockland公司制、电泳条件；100V、30分钟)，在2μg/ml溴化乙锭溶液中约染色40分钟后，在UV照射下对扩增产物进行拍摄照片，确认出目的DNA片段(大小为COI；435个碱基长、ND5；513个碱基长)已被扩增(在图1～7(COI)、图8～13(ND5)中分别圈出的条带)。

图1中分别为：泳道1表示泰国产赤拟谷盗-1，泳道2表示冲绳产赤拟谷盗-1，泳道B表示不添加模板的空白，泳道M表示100个碱基长的梯型标记(ladder marker)(100-bp ladder))。图2中分别为：泳道1表示加拿大产赤拟谷盗-1，泳道B表示不添加模板的空白，泳道M表示大小标准参照物(SizeMarker)(100-bp ladder)。图3中分别为：泳道1表示千叶产赤拟谷盗-1，泳道2表示浦和产赤拟谷盗-1，泳道3表示冈山产赤拟谷盗-1，泳道B表示不添加模板的空白，泳道M表示大小标准参照物(Size Marker)(100-bpladder)。图4中分别为：泳道1表示泰国产赤拟谷盗-2，泳道2表示泰国产赤拟谷盗-3，泳道B表示不添加模板的空白，泳道M表示大小标准参照物(SizeMarker)(100-bp ladder)。图5中分别为：泳道1～10分别表示赤拟谷盗的加拿大产-2、-3、冲绳产-2、-3、千叶产-2、-3、冈山产-2、-3、浦和产-2、-3，泳道B表示不添加模板的空白，泳道M表示大小标准参照物(SizeMarker)(100-bp  ladder)。图6中分别为：泳道1～6分别表示泰国产赤拟谷盗-4、-5、冲绳产赤拟谷盗-4、-5、加拿大产赤拟谷盗-4、-5、泳道B表示不添加模板的空白，泳道M表示大小标准参照物(Size Marker)(100-bpladder)。图7中分别为：泳道1表示宝冢产赤拟谷盗-1，泳道2表示宝冢产赤拟谷盗-2，泳道3表示宝冢产赤拟谷盗-3，泳道B表示不添加模板的空白，泳道M表示大小标准参照物(Size Marker)(100-bp ladder)。图8中分别为：泳道1表示泰国产赤拟谷盗-1，泳道B表示不添加模板的空白，泳道M表示大小标准参照物(Size Marker)(100-bp ladder)。图9中分别为：泳道1表示冲绳产赤拟谷盗-1，泳道M表示大小标准参照物(Size Marker)(100-bp ladder)。图10中分别为：泳道1～6表示泰国产赤拟谷盗-2、-3、冈山产赤拟谷盗-1、浦和产赤拟谷盗-1、千叶产赤拟谷盗-1、加拿大产赤拟谷盗-1，泳道M表示大小标准参照物(Size Marker)(100-bp ladder)。图11中分别为：泳道1～10表示赤拟谷盗的浦和产-2、-3、冈山产-2、-3、千叶产-2、-3、冲绳产-2、-3、加拿大产-2、-3，泳道B表示不添加模板的空白，泳道M表示大小标准参照物(Size Marker)(100-bp ladder)。图12中分别为：泳道1～3表示宝冢产赤拟谷盗-1、-2、-3，泳道B表示不添加模板的空白，泳道M表示大小标准参照物(Size Marker)(100-bp ladder)。图13中分别为：泳道1～6表示赤拟谷盗的泰国产-4、-5、冲绳产-4、-5、加拿大产-4、-5，泳道B表示不添加模板的空白，泳道M表示大小标准参照物(Size Marker)(100-bp ladder)。

(e)PCR产物的纯化

上述PCR产物的纯化使用QIAquick PCR Purification Kit(50)(QIAGEN公司)，基于实验方法(protocol)按以下的方法进行。即在PCR反应液(剩余量约45μl)中加入PBI缓冲液5倍量(225μl)混和。而后，将此液放入QIAquickspin中，用13,000rpm(约11,000×g)离心分离1分钟。弃滤液，添加750μlPE缓冲液后，用13,000rpm离心分离1分钟。弃滤液，再次用14,000rpm(约13,000×g)离心分离1分钟。弃滤液，将旋转柱移入新的1.5ml容量的微管中，添加30μlEB缓冲液，放置1分钟后，用13,000rpm离心分离2分钟，将滤液作为样品。

(f)循环测序反应及测序产物的纯化

使用Big Dye Terminator vl.l Cycle Sequencing Kit(ABI公司)，基于其日语版实验方法(第22页“单链DNA、双链DNA的循环测序”、第25页“用GeneAmp PCR System 9700、9600、2700、2400的循环测序”及第38～40页“用旋转柱(或旋转板(Spin Plate))的纯化法”)如下进行。且使用的引物的碱基序列与目的DNA片段在通过PCR的扩增中使用的序列相同。即，将PCR产物的纯化液用灭菌蒸馏水稀释到5～20ng/μl，在其中的2μl中，添加测序预混料(Sequence premix(Big dye))8μl和分别单独添加稀释到1μM的上述引物L6625、H7005(COI区分析用)、或F6999、R7495(ND5区分析用)3.2μl，得到用灭菌蒸馏水调整到最终为20μl的循环测序反应液。将其加入到0.2ml容量的微管(PCR用)中，放入PCR装置(DNA基因扩增仪GeneAmp PCR System9600；旧Perkin Elmer公司制)，进行变性(96℃、1分钟)后，重复进行变性(96℃、10秒)、退火(50℃、5秒)、链延伸(60℃、4分钟)的反应25次。且在反应终止后，不立刻取出样品时，将样品块(block)的温度降至4℃保存。

测序产物用CENTRI-SEP SpinColumn(ABI公司)纯化。即，在使填充剂在室温下膨胀2小时以上进行预处理后的CENTRI-SEP SpinColumn的中心部添加上述测序产物(约20μl)，使其负载于柱上，将1.5ml容量的微管接在下部，用2,700rpm(约500×g)进行2分钟离心分离，将微管内收集到的溶液作为纯化DNA回收。使该溶液在减压下干燥后，添加20μl的TSR或Hi-Di甲酰胺，放置10分钟左右后充分混和。将此溶液移入0.2ml容量的微管(PCR用)中，用DNA基因扩增仪GeneAmp PCR System 9600进行变性(95℃、2分钟)，立即插入冰中急速冷却，放置10分钟以上。

(g)DNA测序

使用310型遗传分析仪(ABIPRISM 310Genetic Analyzer)，根据“310型遗传分析仪操作指南(ABI PRISM 310Genetic Analyzer操作指南)”进行。即，将上述急速冷却后的试样移入样品管中，盖上样品管塞(tube septa)，装到48孔样品盘中。其后根据操作指南通过终止法测序进行测序。

(h)碱基序列的分析

对照从5’端(引物L6625、或F6999端)和3’端(引物H7005、或R7495端)分别得到的测序数据以确定正确的碱基序列。将如此得到的序列数据如下表示。

1)COI区(全长379碱基)

日本1类型(序列号1)：浦和产(1～3)、冈山产(1～3)、千叶产(1～3)、宝冢产(1～3)

式1

AGAAGTGTACATTCTAATTCTACCAGGATTTGGCATAATCTCCCACATTATTAGACAAGAAAGAGGAAAGAAAGAAGCATTTGGAACACTA

GGAATAATTTATGCAATAATAGCAATTGGGCTCTTAGGTTTTGTTGTATGAGCCCATCACATATTTACCGTAGGAATAGACGTTGATACTC

GAGCCTATTTCACTTCAGCCACAATAATTATTGCTGTCCCAACCGGGATTAAAATTTTTAGATGACTAGCTACTCTTCACGGCACTCAAAT

TAATTATAGTCCTTCTATAATATGGGCACTAGGATTTGTATTCCTATTTACAGTGGGAGGACTAACAGGAGTAATCTTAGCAAATTCATCA

ATTGATATTATACTT

日本2类型(序列号2)：冲绳产(2～5)

式2

AGAGGTATACATTCTAATTCTACCAGGATTTGGTATAATCTCCCACATTATTAGACAAGAAAGAGGAAAGAAAGAAGCATTTGGAACACTA

GGAATAATTTATGCAATAATAGCAATTGGGCTCTTAGGTTTTGTTGTATGAGCCCATCACATATTTACCGTAGGAATAGACGTTGATACTC

GAGCCTATTTCACTTCAGCCACAATAATTATTGCTGTCCCAACCGGAATTAAAATTTTTAGATGACTAGCCACTCTTCACGGCACTCAAAT

TAATTATAGTCCTTCTATAATATGAGCACTAGGATTTGTATTCCTATTTACAGTGGGGGGACTAACAGGAGTAATCTTAGCAAATTCATCA

ATTGATATTATACTT

日本3类型(序列号3)：冲绳产(1)

式3

AGAAGTGTACATTCTAATTCTACCAGGATTTGGCATAATCTCCCACATTATTAGACAAGAAAGAGGAAAGAAAGAAGCATTTGGAACACTA

GGAATAATTTATGCAATAATAGCAATTGGGCTCTTAGGTTTTGTTGTATGAGCCCACCACATATTTACCGTAGGAATAGACGTTGATACTC

GAGCCTATTTCACTTCAGCCACAATAATTATTGCTGTTCCAACCGGAATTAAAATTTTTAGATGACTAGCCACTCTTCACGGCACTCAAAT

TAATTATAGCCCTTCTATAATATGAGCACTAGGATTTGTATTCCTATTTACAGTGGGAGGACTAACAGGAGTAATCTTAGCAAATTCATCA

ATTGACATTATACTT

海外1类型(序列号4)：泰国产(1、3～5)

式4

AGAGGTATACATTCTAATTCTACCAGGATTTGGTATAATCTCCCACATTATTAGACAAGAAAGAGGAAAGAAAGAAGCATTTGGAACACTA

GGAATAATTTATGCAATAATAGCAATTGGACTCTTAGGTTTTGTTGTATGAGCCCATCACATATTTACCGTAGGAATAGACGTTGATACTC

GAGCCTATTTCACTTCAGCCACAATAATTATTGCTGTCCCAACCGGAATTAAAATTTTTAGATGACTAGCCACTCTTCACGGCACTCAAAT

TAATTATAGTCCTTCTATAATATGAGCACTAGGATTTGTATTCCTATTTACAGTGGGGGGACTAACAGGAGTAATCTTAGCAAATTCATCA

ATTGATATTATACTT

海外2类型(序列号5)：泰国产(2)

式5

AGAAGTGTACATTCTAATTCTACCAGGATTTGGCATAATCTCCCACATTATTAGACAAGAAAGAGGAAAGAAAGAAGCATTTGGAACACTA

GGAATAATTTATGCAATAATAGCAATTGGGCTCTTAGGTTTTGTTGTATGAGCCCACCACATATTTACCGTAGGAATAGACGTTGATACTC

GAGCCTATTTCACTTCAGCCACAATAATTATTGCTGTTCCAACCGGAATTAAAATTTTTAGATGACTAGCCACTCTTCACGGCACTCAAAT

TAATTATAGCCCTTCTATAATATGAGCACTAGGATTTGTATTCCTATTTACAGTGGGAGGACTAACAGGAGTAATCTTAGCAAATTCATCA

ATTGACATTATACTT

海外3类型(序列号6)：加拿大产(1，4，5)

式6

AGAGGTGTACATTCTAATTCTTCCAGGATTTGGTATAATCTCCCACATTATTAGACAAGAAAGAGGAAAGAAAGAAGCATTTGGAACACTA

GGAATAATTTATGCAATAATAGCAATTGGGCTCTTAGGTTTTGTTGTATGGGCCCACCACATATTTACCGTAGGAATAGACGTTGATACTC

GAGCCTATTTCACTTCAGCCACAATAATTATTGCTGTTCCAACCGGAATTAAAATTTTTAGATGACTAGCCACTCTTCACGGCACTCAAAT

TAATTATAGCCCTTCTATAATATGAGCACTAGGATTTGTATTCCTATTTACAGTGGGAGGACTAACAGGAGTAATCTTAGCAAATTCATCA

ATTGATATTATACTT

海外4类型(序列号7)：加拿大产(2，3)

式7

AGAGGTGTACATTCTAATTCTTCCAGGATTTGGCATAATCTCCCACATTATTAGACAAGAAAGAGGAAAGAAAGAAGCATTTGGAACACTA

GGAATAATTTATGCAATAATAGCAATTGGGCTCTTAGGTTTTGTTGTATGGGCCCACCACATATTTACCGTAGGAATAGACGTTGATACTC

GAGCCTATTTCACTTCAGCCACAATAATTATTGCTGTTCCAACCGGAATTAAAATTTTTAGATGACTAGCCACTCTTCACGGCACTCAAAT

TAATTATAGCCCTTCTATAATATGAGCACTAGGATTTGTATTCTTATTTACAGTGGGAGGACTAACAGGAGTAATCTTAGCAAATTCATCA

ATTGATATTATACTT

2)ND5区(全长473个碱基)

日本1类型(序列号8)：浦和产(1～3)、冈山产(1～3)、千叶产(1～3)、宝冢产(1～3)

式8

TATAAAATCTTAAGTAACCTATTCTTATAATTTCGGCAACCAAATCCTTTGAATAAAATCCTCTTAAAAATGGTAATCCGCACAAAGATAA

ATTTCTAATATTAAAATAAACACAAGTTAAAGGTAAAAACTTAACTAAGCCCCCTATATACCGAATATCCTGAAAATCACCAACTCTATGA

ATAATATTCCCAGCACATATAAACAACAAAGCCTTGAATAAAGCATGAGTCAATAAATGGAAGAAAGCTAGTTCATATCTTCCTAAAGACA

AAATCATTATTATTAAACCAAGCTGTCTTAAAGTAGACAAAGCAATAATTTTCTTCAAATCAAATTCAAATCTCGCCCCTAACCCGGACAT

AAACATTGTCATTCTAGAAATAAATAATAAAAAATATATTAACCACTCATTAAAGCAAAAATTAAAACGAATTAATAAATATACCCCTGCC

GTTACTAAAGTAGAAGAA

日本2类型及海外1、2类型(序列号9)：冲绳产(2～5)及泰国产(1～5)

式9

TATAAAATCTTAAGTAACCTATTCTTATAATTTCGGCAACCAAATCCTTTGAATAAAATCCTCTTAAAAATGGTAATCCGCACAAAGATAA

ATTTCTAATATTAAAATAAACACAAGTTAAAGGTAAAAACTTAACTAAGCCCCCTATATACCGAATATCCTGAAAATCACCAACTCTATGA

ATAATATTCCCAGCACATATAAACAACAAAGCCTTGAATAAAGCATGAGTCAATAAATGGAAGAAGGCTAGTTCATATCTTCCTAAAGACA

AAATCATTATTATTAAACCAAGCTGTCTTAAAGTAGACAAAGCAATAATTTTCTTCAAATCAAATTCAAATCTCGCCCCTAACCCGGACAT

AAACATTGTCATTCTAGAAATAAATAATAAAAAATATATTAACCACTCATTAAAGCAAAAATTAAAACGAATTAATAAATATACCCCTGCC

GTTACTAAAGTAGAAGAA

日本3类型(序列号10)：冲绳产(1)

式10

TATAAAATCTTAAGTAACCTATTCTTATAATTTCGGCAACCAAATCCTTTGAATAAAATCCTCTTAAAAATGGTAATCCGCACAAAGATAA

ATTTCTAATATTAAAATAAACACAAGTTAAAGGTAAAAACTTAACTAAGCCCCCTATATACCGAATATCCTGAAAATCACCAACTCTATGA

ATAATATTCCCAGCACATATAAACAACAAAGCCTTGAATAAAGCATGAGTCAATAAATGGAAGAAGGCTAGTTCATATCTTCCTAAAGACA

AAATCATTATTATTAAACCAAGCTGTCTTAAAGTCGACAAAGCAATAATTTTCTTCAAATCAAATTCAAATCTCGCCCCTAACCCAGACAT

AAACATTGTCATTCTAGAAATAAATAATAAAAAATATATTAACCACTCATTAAAACAAAAATTAAAACGAATTAATAAATATACCCCTGCC

GTTACTAAAGTAGAAGAA

海外3类型(序列号11)：加拿大产(1、4、5)

式11

TATAAAATCTTAAGTAACCTATTCTTATAATTTCGGCAACCAAATCCTTTGAATAAAATCCTCTTAAAAATGGTAATCCGCACAAAGATAA

ATTTCTAATATTAAAATAAACACAAGTTAAAGGTAAAAACTTAACTAAGCCCCCTATATACCGAATATCCTGAAAATCACCAACTCTATGA

ATAATATTCCCAGCACATATAAACAACAAAGCCTTGAATAAAGCATGAGTCAATAAATGGAAGAAGGCTAGTTCATATCTTCCTAAAGACA

AAATCATTATTATTAAACCAAGCTGTCTTAAAGTCGACAAAGCAATAATTTTCTTCAAATCAAATTCAAATCTCGCCCCTAACCCGGACAT

AAACATTGTCATTCTAGAAATAAATAATAAAAAATATATTAACCACTCATTAAAGCAAAAATTAAAACGAATTAATAAATATACCCCTGCC

GTTACTAAAGTAGAAGAA

海外4类型(序列号12)：加拿大产(2、3)

式12

TATAAAATCTTAAGTAACCTATTCTTATAATTTCGGCAACCAAATCCTTTGAATAAAATCCTCTTAAAAATGGTAATCCGCACAAAGATAA

ATTTCTAATATTAAAATAAACACAAGTTAAAGGTAAAAACTTAACTAAGCCCCCTATATACCGAATATCCTGAAAATCACCAACTCTATGA

ATAATATTCCCAGCACACATAAACAACAAAGCCTTGAATAAAGCATGAGTCAATAAATGGAAGAAGGCTAGTTCATATCTTCCTAAAGACA

AAATCATTATTATTAAACCAAGCTGTCTTAAAGTCGACAAAGCAATAATTTTCTTCAAATCAAATTCAAATCTCGCCCCTAACCCGGACAT

AAACATTGTCATTCTAGAAATAAATAATAAAAAATATATTAACCACTCATTAAAGCAAAAATTAAAACGAATTAATAAATATACCCCTGCC

GTTACTAAAGTAGAAGAA

对于上述碱基序列，将各个区域内(COI、或ND5)的序列在互联网上使用EMBL-EBI的ClustalW2等的分析用计算机程序进行比较(多重序列比对分析)。其结果，上述序列中用阴影表示的COI区中有15处、ND5区中有5处为单核苷酸多态性(SNP)。通过组合这些多态性，可分类为7个类型，由属于各类型的昆虫的来源地等综合判断，将与各类型对应的栖息地鉴定为日本本州、冲绳、泰国、加拿大。即，确定日本1类型(浦和、冈山、千叶、宝冢的各地区的各3个个体共计12个个体；单倍型I-1(按COI-ND5的顺序，以下相同))主要对应于日本的本州地区；日本2类型(冲绳地区4个个体；II-2)及日本3类型(冲绳地区1个个体；III-3(类型L))主要对应于冲绳，海外1类型(泰国地区4个个体；IV-2)及海外2类型(泰国地区1个个体；III-2)主要对应于泰国，海外3类型(加拿大地区3个个体；V-4)及海外4类型(加拿大地区2个个体；VI-5)主要对应于加拿大(表1)。而且，除了来自日本本州的碱基，显示出各个地区分别存在2种单倍型。例如，在如下所示的表1中，为日本2类型的冲绳产2～5和日本3类型的冲绳产1、海外1类型的泰国产1及3～5和海外2类型的泰国产2、海外3类型的加拿大产1、4及5和海外4类型的加拿大产2及3。

且进一步详细分析的结果，明确显示出如下的各地区的特征。日本1类型是指主要在日本国内栖息地为本州地区的类型，其特征在于，从COI基因区域的5’末端开始数第229、298位为G，第253位为T，ND5区的第248位为A。日本2类型及日本3类型是指栖息地主要在冲绳周边的类型，显示出与来自以泰国周边为其栖息地的海外1类型的DNA极为类似，从地理关系上来看，也证明相互为近缘。对于海外1类型及海外2类型，除了ND5基因区域的第248位为G以外，其他均与日本1类型一致。海外3类型及海外4类型是指主要以加拿大周边为其栖息地的类型，其特征在于，COI基因区域的第22位为T、第142位为G。

2.用于鉴定赤拟谷盗的栖息地是否为日本本州的方法中使用的引物的开发

在COI的分析区域中，可看出从5’-末端开始229位和298位的碱基不同。即，在日本1类型中，这些碱基为G，而海外产的包括冲绳在内的海外栖息的昆虫的这些碱基为A。着眼于这些不同，在下述碱基序列中用方框圈出的位置上分别设计特异性引物。

式13

CO I区(全长379个碱基；5’→3’方向记载)

日本1类型：(浦和产(1～3)、冈山产(1～3)、千叶产(1～3)、宝冢产(1～3))

AGAAGTGTACATTCTAATTCTACCAGGATTTGGCATAATCTCCCACATTATTAGACAAGAAAGAGGAAAGAAAGAAGCATTTGGAACACTA

GGAATAATTTATGCAATAATAGCAATTGGGCTCTTAGGTTTTGTTGTATGAGCCCATCACATATTTACCGTAGGAATAGACGTTGATACTC

GAGCCTATTTCACTTCAGCCACAATDTTAAAATTTTTAGATGACTAGCTACTCTTCACGGCACTCAAAT

TAATTATAGTCCTTCTATAATATGTATTTACAGTGGGAGGACTAACAGGAGTAATCTTAGCAAATTCATCA

ATTGATATTATACTT

所设计的引物如下记录。

KN识别用引物及改良引物

Honndo-F    AATTATTGCTGTCCCAACCGGG(序列号17)

Honndo-F2   AATTATTGCTGTCCCAACCGAG(序列号18)

Honndo-R    GGAATACAAATCCTAGTGCC(序列号19)

Honndo-R2   GGAATACAAATCCTAGTGAC(序列号20)

Kaigai-F    AATTATTGCTGTYCCAACCGGA(序列号21)

Kaigai-F2   AATTATTGCTGTYCCAACCGAA(序列号22)

Kaigai-R    RGAATACAAATCCTAGTGCT(序列号23)

Kaigai-R2   RGAATACAAATCCTAGTGAT(序列号24)

此外，在ND5的分析区域内，同样第248位的碱基在日本1类型中为A，而在海外产中为G，在用方框圈出的位置上设计特异性引物及共有引物(3’-端)(下述ND5区的碱基序列)。

式14

ND5区(全长473个碱基；5’→3’的方向记载)

日本1类型：(浦和产(1～3)、冈山产(1～3)、千叶产(1～3)、宝冢产(1～3))

TATAAAATCTTAAGTAACCTATTCTTATAATTTCGGCAACCAAATCCTTTGAATAAAATCCTCTTAAAAATGGTAATCCGCACAAAGATAA

ATTTCTAATATTAAAATAAACACAAGTTAAAGGTAAAAACTTAACTAAGCCCCCTATATACCGAATATCCTGAAAATCACCAACTCTATGA

ATAATATTCCCAGCACATATAAACAACAAAGCCTTGAATAAAGCATGCTAGTTCATATCTTCCTAAAGACA

AAATCATTATTATTAAACCAAGCTGTCTTAAAGTAGACAAAGCAATAATTTTCTTCAAATCAAATTCAAATCATTGTCATTCTAGAAATAAATAATAAAAAATATATTAACCACTCATTAAAGCAAAAATTAAAACGAATTAATAAATATACCCCTGCC

GTTACTAAAGTAGAAGAA

ND-Honndo-F    GAGTCAATAAATGGAAGAAA(序列号25)

ND-Honndo-F2   GAGTCAATAAATGGAAGATA(序列号26)

ND-Kaigai-F    GAGTCAATAAATGGAAGAAG(序列号27)

ND-Kaigai-F2   GAGTCAATAAATGGAAGATG(序列号28)

ND-Kyoutsuu-R  TTTATGTCCGGGTTAGGGGCGAG(序列号29)

PCR

DNA片段的扩增使用PerfectShot Ex Taq(Loading dye mix)(TAKARA BIO株式会社)，根据附带的使用手册配制PCR反应液(50μl；0.2ml容量的微管)。其中，引物和模板(模板DNA)的添加量(最终浓度)及PCR条件如下所示。

引物；

作为正义(Forward)引物(1μM)/反义(Reverse)引物(1μM)的组合，为

1.Honndo-F/Honndo-R

2.Kaigai-F/Kaigai-R

3.ND-Honndo-F/ND-Kyoutsuu-R

4.ND-Kaigai-F/ND-Kyoutsuu-R

模板；1μl/50μl反应液

1.作为日本本州产的代表，从浦和产(1)中提取的DNA

2.作为海外产的代表，从加拿大产(1)中提取的DNA

将此微管放入PCR装置(DNA基因扩增仪GeneAmp PCR System 9600；旧Perkin Elmer公司制、或TaKaRa PCR基因扩增仪(thermal cycler)PERSONAL)上，在以下条件下进行PCR扩增：

预变性：94℃、3分钟

变性：94℃、30秒

退火：45℃、45秒

链延伸：72℃、60秒

将预变性以外的上述反应重复进行40次。

且在反应终止后不立刻取出样品时，将样品块(block)的温度降至4℃保存。

3.有无PCR扩增的确认和结果的分析

将上述得到的PCR反应液的5μl供给琼脂糖凝胶电泳。此时，使用微型凝胶电泳系统“Mupid”进行电泳(凝胶；3％NuSieve 3：1琼脂糖(FMC BioProducts公司制、或Cambrex Bio Science Rockland公司制)、电泳条件；100V、30分钟)，在2μg/ml溴化乙锭溶液中染色约40分钟后，在UV照射下对扩增产物拍摄照片，确认目的DNA片段(期待的大小，COI；110个碱基长、ND5；139个碱基长)是否已被扩增(图14)。图14中，各泳道的说明如下：

表2

结果在泳道1、5、7、11中，可看出所期待的扩增产物，但期待为阴性的泳道2、4、8、10中也可看出类似的条带。

因此，在上述PCR条件中，将退火的温度从45℃变更为55℃进行PCR时，泳道4和8的条带变浅，泳道2和10可看出与阳性条带(泳道1、11)同等程度的深度的条带(图15)。图15中，各泳道的说明与表2相同。

于是，如上所述将3’-末端的相邻的碱基置换为其他的A、T，合成特异性略微减少了的引物。同样将这些以如下组合使用进行PCR。

作为正义引物(1μM)/反义引物(1μM)的组合，为

1.Honndo-F2/Honndo-R2

2.Kaigai-F2/Kaigai-R2

3.ND-Honndo-F2/ND-Kyoutsuu-R

4.ND-Kaigai-F2/ND-Kyoutsuu-R

其结果，泳道2的条带消失，与泳道1的对比变得明确(图16)。即，可发现日本1类型为阳性、海外产为阴性的条件。图16中，各泳道的说明如下表。

表3

使用实时PCR法进行赤拟谷盗的栖息地的识别鉴定

(a)昆虫

本实施例中使用的赤拟谷盗是从埼玉县(浦和)的野外采集的赤拟谷盗(浦和产2)、在从加拿大出口到香港的小麦粉中混入的赤拟谷盗(加拿大产4)。

(b)DNA提取

与实施例1同样提取DNA。

(c)TaqMan(注册商标)MGB探针的合成

从COI基因的5’末端开始数第229位的碱基在本州产中为G，而在海外产中为A，对这一点重点关注，合成了以下的MGB探针。

本州产用(KN_CO1-C229V1；荧光报告基团VIC)

CAACCGGGATTAAAA(序列号30)

海外产用(KN_CO1-C229M1；荧光报告基团FAM)

CAACCGGAATTAAAA(序列号31)

而且还合成了如下PCR用的引物。

KN_CO1-C229F：

AGCCTATTTCACTTCAGCCACAAT(序列号32)

KN_CO1-C229R：

ATGAATTTGCTAAGATTACTCCTGTTAGTCC(序列号33)

这些的位置关系如下。即，以下的序列中，下划线部分相当于引物，双下划线部分相当于MGB探针。以下的序列相当于包含引物组在内的179个碱基长的扩增片段。

表4

AGANGTNTACATTCTAATTCTNCCAGGATTTGGNATAATCTCCCACATTATTAGACAAGAAAGAGGAAAGAAAGAAGCATTTGGAACACTA

GGAATAATTTATGCAATAATAGCAATTGGNCTCTTAGGTTTTGTTGTATGNGCCCANCACATATTTACCGTAGGAATAGACGTTGATACTC

GAGCCTATTTCACTTCAGCCACAATAATTATTGCTGTNCTTTTTAGATGACTAGC [T/C]ACTCTTCACGGC

ACTCAAATTAATTATAGNCCTTCTATAATATG[G/A]GCACTAGGATTTGTATTCNTATTTACAGTGGGNGGACTAACAGGAGTAATCTTA

GCAAATTCATCAATTGANATTATACTT

且上述探针及引物的设计及合成采用ABI公司的Custom TaqMan(R)基因表达/单核苷酸基因类型分析服务(Gene Expression/SNP Genotyping AssaysService)。

(d)PCR

按照通过Custom TaqMan(R)基因表达/单核苷酸基因类型分析服务(GeneExpression/SNP Genotyping Assays Service)(TaqMan MGB探针，FAM和VIC荧光标记)制作的引物及探针中附带的实验方法进行PCR。即将12.5μl TaqManUniversal PCR Master Mix、0.625μl 40xAssay Mix与所述溶解在20μl中的DNA试样0.5或1μl单独或混合后添加，用纯水调整到最终的25μl。将这些配制液加入MicroAmp Optical 8-Tube Strip(0.2ml)中，使用7500实时PCR系统根据规定的条件(95℃-10分钟、(92℃-15秒及60℃-1分钟)×40循环)进行实时PCR。

(e)结果

图17及18为本州产用的检测(VIC)的结果，为浦和产2的DNA的情况下，可看出表示扩增的曲线上扬(A，B)。相对于此，为加拿大产4的DNA的情况下，未看出扩增(C，D)。在此，图17表示1μl的数据，A表示浦和产2、C表示加拿大产4、E表示空白。图18表示0.5μl的数据，B表示浦和产2、D表示加拿大产4、E表示空白。另一方面，图19，20为海外产用的检测(FAM)的结果，为加拿大产4的情况下可看出显著的曲线上扬(C，D)。另一方面，为浦和产2的情况下未看出PCR扩增(A，B)。在此，图19表示1μl的数据，A表示浦和产2、C表示加拿大产4、E表示空白。图20表示0.5μl的数据，B表示浦和产2、D表示加拿大产4、E表示空白。如此，可明确地区分来自日本本州和其以外(来自海外)的情况。

实施例3

1.来自昆虫的测序数据

(a)昆虫

DNA提取中使用的昆虫为属于鞘翅目长蠹科的谷蠹，作为在包含日本在内的世界各地栖息的同一形态的昆虫，与作为危害米、麦等禾本科谷物的玉米象类并称为重大害虫。本实施例中使用的谷蠹，采集在日本国内及中国国内栖息的昆虫，并分别饲养。

(b)DNA提取～(h)碱基序列的分析

用与实施例1同样的操作提取COI区的DNA，实施PCR，进行测序，得到测序数据。得到的序列数据如下所示。

1)COI区(全长379个碱基)

日本1类型为序列号34，中国1类型为序列号35，如下表示。

数15

国产   AGAAGTTTAC ATTTTAATCC TACCAGGATT TGGTATAATT TCTCATATTA TTAGACATGA AAGAGGAAAA AAGGAAACCT    80

中国产 AGAAGTTTAG ATTTTAATCC TACCAGGATT TGGTATAATT TCTCATATTA TTAGACATGA AAGAGGAAAA AAGGAAACCT    80

       ********** ********** ********** ********** ********** ********** ********** **********

********** ********** ********** ********** ********** ********** ********** **********

国产   GTAGGAATAG ACGTAGATAC CCGAGCATAT TTTACTTCAG CAACAATAAT TATTGCAGTT CCAACCGGAA TTAAAGTATT    240

中国产 GTAGGAATAG ACGTAGATAC CCGAGCATAT TTTACTTCAG CAACAATAAT TATTGCAGTT CCAACCGGAA TTAAAGTATT    240

       ********** ********** ********** ********** ********** ********** ********** **********

国产   TAGATGATTA GCTACCCTCC ACGGAACAGA AATAAATTAT TCACCTTCAA TAATATGATC ATTAGGATTT GTCTTTCTAT    320

中国产 TAGATGATTA GCTACCCTCC ACGGAACACA AATAAATTAT TCACCTTCAA TAATATGATC ATTAGGATTT GTCTTTCTAT    320

       ********** ********** ********** ********** ********** ********** ********** **********

国产   TTACCGTAGG AGGATTAACA GGAGTAGTAT TAGCAAATTC ATCCATTGAT ATTATTCTA    379

中国产 TTACCGTAGG AGGATTAACA GGAGTAGTAT TAGCAAATTC ATCCATTGAT ATTATTCTA    379

       ********** ********** ********** ********** ********** **********

上述的序列中，记载为“国产”的昆虫为序列号34的日本1类型，记载为“中国产”的昆虫为序列号35的中国1类型。

对于上述碱基序列，通过与实施例1同样的操作进行分析。其结果，可看出所得到的379个碱基中从5’末端开始数第160位的碱基在日本1类型中为“T”，在中国1类型中为“C”的SNP(单核苷酸多态性)。

实施例4

来自加热或加压处理后的被测体的DNA的PCR扩增的确认

探讨由加热或加压处理使赤拟谷盗的DNA人为劣化时PCR扩增的有无、及通过实时PCR法可否识别栖息地。

(a)昆虫

本实施例中，使用实施例1中记载的从Sumika Technoservice公司购入的赤拟谷盗(宝冢产；日本1类型)。

(b)被测体的处理

A.在超纯水(Milli-Q水)1ml中(微管中)放入2只上述昆虫，煮沸(使用电磁加热机)30分钟或60分钟后在冰中急速冷却。

B.在100ml高型烧杯中放入超纯水(Milli-Q水)约30ml和2只上述昆虫，在121℃、15分钟的条件下进行高压灭菌器处理，50℃左右取出，自然放置冷却。

(c)DNA提取

与实施例1(b)同样提取DNA。

(d)TaqMan(注册商标)MGB探针

使用实施例2(c)中记载的探针。

(e)PCR

用如下3种方法实施。

A.使用实施例1(c)中记载的线粒体COI基因分析中使用的引物组(L6625/H7005、扩增大小为435bp)，与实施例1(c)同样进行。

B.使用实施例2(c)中记载的引物组(KN_CO1-C229F/KN_CO1-C229R、扩增大小为179bp)，使用ABI公司的Veriti 96Well Thermal Cycler，在规定条件(95℃-1min、(92℃-15sec+60℃-lmin)x 40循环)下进行PCR。

C.与实施例2同样，进行使用MGB探针的实时PCR。

(f)结果

在煮沸30分钟处理后的被测体中，在上述A的方法中，可看出作为可比较全部标记(Merkmal)的区域的435bp大小的扩增条带(图25左侧照片泳道2；箭头、表5)。但是，在煮沸60分钟或用高压灭菌器(121℃、15分钟)处理后的被测体中，未看出此条带(图25左侧照片泳道3，4、表5)。但是，在实施上述B的方法时，在任何情况下均可看出作为可鉴定日本1类型的区域的179bp的条带(图25右侧照片；箭头、表5)。进一步进行使用MGB探针的实时PCR(上述C的方法)时，即使使用任何被测体时，也可明确地确认出作为这些被测体的特征的日本1(本州)类型的赤拟谷盗(表6)。如此，作为被测昆虫的DNA成为片段时，比较标记(Merkmal)全部而鉴定栖息地很困难，但通过选择某栖息地的特异性的碱基并使用以该碱基为标准设计的引物及探针，即使是成为片段的DNA，也可进行栖息地的识别鉴定。

表5

表6

*A/C：高压灭菌器(121℃、15分钟)处理

**()内：第一次检测出荧光色素的循环次数

实施例5

来自自然死亡个体的DNA的PCR扩增的确认

探讨自然死亡的赤拟谷盗DNA的PCR扩增的有无。

(a)昆虫

本实施例使用在饲养过程中自然死亡的、其后在室温保管下经过了5个月的赤拟谷盗(栖息地不明)。

(b)DNA提取和PCR

从上述昆虫的2个个体中，与实施例1同样提取DNA，与实施例4的(e)A中记载的方法同样进行PCR。

(c)结果

上述2个个体均可看出作为可比较全部标记(Merkmal)的区域的435bp的扩增条带(图26、箭头)。

实施例6

来自γ射线照射被测体的DNA的PCR扩增的确认

探讨由γ射线照射使赤拟谷盗的DNA人为劣化后通过PCR有无扩增、及探讨通过实时PCR法可否识别栖息地。

(a)昆虫

在本实施例中，使用在筑波市的精米所捕捉的赤拟谷盗(日本1类型和非日本1类型混合存在)。

(b)被测体的处理

对上述昆虫(日本1类型和非日本1类型混合存在)用γ射线照射装置(Nordion公司制的Gamma Cell 220)以60-Co γ射线为射线源照射，以制作被测体。作为射线量(Gy)，设定1.5K、2K的2个水平，照射时间分别为810秒、18分钟。使用丙氨酸剂量计(Allanine Pellet Dosimeter ES200-2106，BrukerBiospin)制成的标准曲线求出该照射条件的正确的射线量时，分别为1623、2142Gy。

(c)DNA提取和PCR

如上所述，在设定标准为1.5KGy和2KGy的条件下，对于受到损伤的被测体(将各个条件下的2个被测体供给试验。图27及表7中分别标记为1.5K-1，1.5K-2，2K-1，2K-2)，与实施例1同样提取DNA，与实施例4的(e)A及C中记载的方法同样进行PCR。

(d)结果

对于供给试验的4个被测体(分别为1.5K-1，1.5K-2，2K-1，2K-2)提取DNA，在进行以其为模板时的通常的PCR(实施例4、(e)A中记载的方法)时，4个被测体中，除去照射了2KGy的1个被测体，3个被测体中未确认出作为目的435bp大小的扩增条带，认为DNA进行了片段化(图27、箭头)。因此，对于相同模板DNA，在进行使用了MGB探针的实时PCR(实施例4(e)C中记载的方法)时，4个被测体中均可看出PCR反应，进一步可知2K-1、2K-2、1.5K-2为本州类型，只有1.5K-1为非本州类型，从而可进行明确的栖息地识别(表7)。

表7

*()内：第一次检测出荧光色素的循环次数

序列表(SEQUENCE LISTING)

<110>三得利株式会社(suntory Ltd.，)

<120>昆虫栖息地的鉴定(Identification of habitat ofinsect)

<130>S-144-841

<160>35

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>379

<212>DNA

<213>赤拟谷盗(Tribolium castaneum)

<400>1

agaagtgtac attctaattc taccaggatt tggcataatc tcccacatta ttagacaaga    60

aagaggaaag aaagaagcat ttggaacact aggaataatt tatgcaataa tagcaattgg    120

gctcttaggt tttgttgtat gagcccatca catatttacc gtaggaatag acgttgatac    180

tcgagcctat ttcacttcag ccacaataat tattgctgtc ccaaccggga ttaaaatttt    240

tagatgacta gctactcttc acggcactca aattaattat agtccttcta taatatgggc    300

actaggattt gtattcctat ttacagtggg aggactaaca ggagtaatct tagcaaattc    360

atcaattgat attatactt                                                 379

<210>2

<211>379

<212>DNA

<213>赤拟谷盗(Tribolium castaneum)

<400>2

agaggtatac attctaattc taccaggatt tggtataatc tcccacatta ttagacaaga    60

aagaggaaag aaagaagcat ttggaacact aggaataatt tatgcaataa tagcaattgg    120

gctcttaggt tttgttgtat gagcccatca catatttacc gtaggaatag acgttgatac    180

tcgagcctat ttcacttcag ccacaataat tattgctgtc ccaaccggaa ttaaaatttt    240

tagatgacta gccactcttc acggcactca aattaattat agtccttcta taatatgagc    300

actaggattt gtattcctat ttacagtggg gggactaaca ggagtaatct tagcaaattc    360

atcaattgat attatactt                                                 379

<210>3

<211>379

<212>DNA

<213>赤拟谷盗(Tribolium castaneum)

<400>3

agaagtgtac attctaattc taccaggatt tggcataatc tcccacatta ttagacaaga    60

aagaggaaag aaagaagcat ttggaacact aggaataatt tatgcaataa tagcaattgg    120

gctcttaggt tttgttgtat gagcccacca catatttacc gtaggaatag acgttgatac    180

tcgagcctat ttcacttcag ccacaataat tattgctgtt ccaaccggaa ttaaaatttt    240

tagatgacta gccactcttc acggcactca aattaattat agcccttcta taatatgagc    300

actaggattt gtattcctat ttacagtggg aggactaaca ggagtaatct tagcaaattc    360

atcaattgac attatactt                                                 379

<210>4

<211>379

<212>DNA

<213>赤拟谷盗(Tribolium castaneum)

<400>4

agaggtatac attctaattc taccaggatt tggtataatc tcccacatta ttagacaaga    60

aagaggaaag aaagaagcat ttggaacact aggaataatt tatgcaataa tagcaattgg    120

actcttaggt tttgttgtat gagcccatca catatttacc gtaggaatag acgttgatac  180

tcgagcctat ttcacttcag ccacaataat tattgctgtc ccaaccggaa ttaaaatttt  240

tagatgacta gccactcttc acggcactca aattaattat agtccttcta taatatgagc  300

actaggattt gtattcctat ttacagtggg gggactaaca ggagtaatct tagcaaattc  360

atcaattgat attatactt                                               379

<210>5

<211>379

<212>DNA

<213>赤拟谷盗(Tribolium castaneum)

<400>5

agaagtgtac attctaattc taccaggatt tggcataatc tcccacatta ttagacaaga  60

aagaggaaag aaagaagcat ttggaacact aggaataatt tatgcaataa tagcaattgg  120

gctcttaggt tttgttgtat gagcccacca catatttacc gtaggaatag acgttgatac  180

tcgagcctat ttcacttcag ccacaataat tattgctgtt ccaaccggaa ttaaaatttt  240

tagatgacta gccactcttc acggcactca aattaattat agcccttcta taatatgagc  300

actaggattt gtattcctat ttacagtggg aggactaaca ggagtaatct tagcaaattc    360

atcaattgac attatactt                                                 379

<210>6

<211>379

<212>DNA

<213>赤拟谷盗(Tribolium castaneum)

<400>6

agaggtgtac attctaattc ttccaggatt tggtataatc tcccacatta ttagacaaga    60

aagaggaaag aaagaagcat ttggaacact aggaataatt tatgcaataa tagcaattgg    120

gctcttaggt tttgttgtat gggcccacca catatttacc gtaggaatag acgttgatac    180

tcgagcctat ttcacttcag ccacaataat tattgctgtt ccaaccggaa ttaaaatttt    240

tagatgacta gccactcttc acggcactca aattaattat agcccttcta taatatgagc    300

actaggattt gtattcctat ttacagtggg aggactaaca ggagtaatct tagcaaattc    360

atcaattgat attatactt                                                 379

<210>7

<211>379

<212>DNA

<213>赤拟谷盗(Tribolium castaneum)

<400>7

agaggtgtac attctaattc ttccaggatt tggcataatc tcccacatta ttagacaaga    60

aagaggaaag aaagaagcat ttggaacact aggaataatt tatgcaataa tagcaattgg    120

gctcttaggt tttgttgtat gggcccacca catatttacc gtaggaatag acgttgatac    180

tcgagcctat ttcacttcag ccacaataat tattgctgtt ccaaccggaa ttaaaatttt    240

tagatgacta gccactcttc acggcactca aattaattat agcccttcta taatatgagc    300

actaggattt gtattcttat ttacagtggg aggactaaca ggagtaatct tagcaaattc    360

atcaattgat attatactt                                                 379

<210>8

<211>473

<212>DNA

<213>赤拟谷盗(Tribolium castaneum)

<400>8

tataaaatct taagtaacct attcttataa tttcggcaac caaatccttt gaataaaatc    60

ctcttaaaaa tggtaatccg cacaaagata aatttctaat attaaaataa acacaagtta    120

aaggtaaaaa cttaactaag ccccctatat accgaatatc ctgaaaatca ccaactctat  180

gaataatatt cccagcacat ataaacaaca aagccttgaa taaagcatga gtcaataaat  240

ggaagaaagc tagttcatat cttcctaaag acaaaatcat tattattaaa ccaagctgtc  300

ttaaagtaga caaagcaata attttcttca aatcaaattc aaatctcgcc cctaacccgg  360

acataaacat tgtcattcta gaaataaata ataaaaaata tattaaccac tcattaaagc  420

aaaaattaaa acgaattaat aaatataccc ctgccgttac taaagtagaa gaa         473

<210>9

<211>473

<212>DNA

<213>赤拟谷盗(Tribolium castaneum)

<400>9

tataaaatct taagtaacct attcttataa tttcggcaac caaatccttt gaataaaatc  60

ctcttaaaaa tggtaatccg cacaaagata aatttctaat attaaaataa acacaagtta  120

aaggtaaaaa cttaactaag ccccctatat accgaatatc ctgaaaatca ccaactctat  180

gaataatatt cccagcacat ataaacaaca aagccttgaa taaagcatga gtcaataaat  240

ggaagaaggc tagttcatat cttcctaaag acaaaatcat tattattaaa ccaagctgtc  300

ttaaagtaga caaagcaata attttcttca aatcaaattc aaatctcgcc cctaacccgg  360

acataaacat tgtcattcta gaaataaata ataaaaaata tattaaccac tcattaaagc  420

aaaaattaaa acgaattaat aaatataccc ctgccgttac taaagtagaa gaa         473

<210>10

<211>473

<212>DNA

<213>赤拟谷盗(Triboliurn castaneum)

<400>10

tataaaatct taagtaacct attcttataa tttcggcaac caaatccttt gaataaaatc  60

ctcttaaaaa tggtaatccg cacaaagata aatttctaat attaaaataa acacaagtta  120

aaggtaaaaa cttaactaag ccccctatat accgaatatc ctgaaaatca ccaactctat  180

gaataatatt cccagcacat ataaacaaca aagccttgaa taaagcatga gtcaataaat  240

ggaagaaggc tagttcatat cttcctaaag acaaaatcat tattattaaa ccaagctgtc  300

ttaaagtcga caaagcaata attttcttca aatcaaattc aaatctcgcc cctaacccag  360

acataaacat tgtcattcta gaaataaata ataaaaaata tattaaccac tcattaaaac  420

aaaaattaaa acgaattaat aaatataccc ctgccgttac taaagtagaa gaa        473

<210>11

<211>473

<212>DNA

<213>赤拟谷盗(Tribolium castaneum)

<400>11

tataaaatct taagtaacct attcttataa tttcggcaac caaatccttt gaataaaatc  60

ctcttaaaaa tggtaatccg cacaaagata aatttctaat attaaaataa acacaagtta  120

aaggtaaaaa cttaactaag ccccctatat accgaatatc ctgaaaatca ccaactctat  180

gaataatatt cccagcacat ataaacaaca aagccttgaa taaagcatga gtcaataaat  240

ggaagaaggc tagttcatat cttcctaaag acaaaatcat tattattaaa ccaagctgtc  300

ttaaagtcga caaagcaata attttcttca aatcaaattc aaatctcgcc cctaacccgg  360

acataaacat tgtcattcta gaaataaata ataaaaaata tattaaccac tcattaaagc  420

aaaaattaaa acgaattaat aaatataccc ctgccgttac taaagtagaa gaa         473

<210>12

<211>473

<212>DNA

<213>赤拟谷盗(Tribolium castaneum)

<400>12

tataaaatct taagtaacct attcttataa tttcggcaac caaatccttt gaataaaatc    60

ctcttaaaaa tggtaatccg cacaaagata aatttctaat attaaaataa acacaagtta    120

aaggtaaaaa cttaactaag ccccctatat accgaatatc ctgaaaatca ccaactctat    180

gaataatatt cccagcacac ataaacaaca aagccttgaa taaagcatga gtcaataaat    240

ggaagaaggc tagttcatat cttcctaaag acaaaatcat tattattaaa ccaagctgtc    300

ttaaagtcga caaagcaata attttcttca aatcaaattc aaatctcgcc cctaacccgg    360

acataaacat tgtcattcta gaaataaata ataaaaaata tattaaccac tcattaaagc    420

aaaaattaaa acgaattaat aaatataccc ctgccgttac taaagtagaa gaa           473

<210>13

<211>28

<212>DNA

<213>引物(primer)

<220>

<221>misc_feature

<222>(23)..(23)

<223>N表示任意碱基(N means any bases)

<400>13

ccggatcctt ytgrttytty ggncaycc    28

<210>14

<211>28

<212>DNA

<213>引物(primer)

<220>

<221>misc_feature

<222>(12)..(12)

<223>n表示任意碱基(n means any bases)

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(20)

<223>n表示任意碱基(n means any bases)

<400>14

ccggatccac ancrtartan gtrtcrtg    28

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>引物(primer)

<400>15

aaacagttaa amcartwgaa      20

<210>16

<211>20

<212>DNA

<213>引物(primer)

<400>16

cctgtwtcwd ctttagtwca      20

<210>17

<211>22

<212>DNA

<213>引物(primer)

<400>17

aattattgct gtcccaaccg gg   22

<210>18

<211>22

<212>DNA

<213>引物(primer)

<400>18

aattattgct gtcccaaccg ag    22

<210>19

<211>20

<212>DNA

<213>引物(primer)

<400>19

ggaatacaaa tcctagtgcc       20

<210>20

<211>20

<212>DNA

<213>引物(primer)

<400>20

ggaatacaaa tcctagtgac      20

<210>21

<211>22

<212>DNA

<213>引物(primer)

<400>21

aattattgct gtyccaaccg ga    22

<210>22

<211>22

<212>DNA

<213>引物(primer)

<400>22

aattattgct gtyccaaccg aa    22

<210>23

<211>20

<212>DNA

<213>引物(primer)

<400>23

rgaatacaaa tcctagtgct       20

<210>24

<211>20

<212>DNA

<213>引物(primer)

<400>24

rgaatacaaa tcctagtgat    20

<210>25

<211>20

<212>DNA

<213>引物(primer)

<400>25

gagtcaataa atggaagaaa    20

<210>26

<211>20

<212>DNA

<213>引物(primer)

<400>26

gagtcaataa atggaagata    20

<210>27

<211>20

<212>DNA

<213>引物(primer)

<400>27

gagtcaataa atggaagaag      20

<210>28

<211>20

<212>DNA

<213>引物(primer)

<400>28

gagtcaataa atggaagatg      20

<210>29

<211>23

<212>DNA

<213>引物(primer)

<400>29

tttatgtccg ggttaggggc gag  23

<210>30

<211>15

<212>DNA

<213>探针(probe)

<400>30

caaccgggat taaaa            15

<210>31

<211>15

<212>DNA

<213>探针(probe)

<400>31

caaccggaat taaaa             15

<210>32

<211>24

<212>DNA

<213>引物(primer)

<400>32

agcctatttc acttcagcca caat    24

<210>33

<211>31

<212>DNA

<213>引物(primer)

<400>33

atgaatttgc taagattact cctgttagtc c                                  31

<210>34

<211>379

<212>DNA

<213>谷蠹(Rhyzopertha dominica)

<400>34

agaagtttac attttaatcc taccaggatt tggtataatt tctcatatta ttagacatga    60

aagaggaaaa aaggaaacct ttggttctct agggataatt tacgcaataa tagcaattgg    120

actattagga tttattgtat gagcacatca catatttact gtaggaatag acgtagatac    180

ccgagcatat tttacttcag caacaataat tattgcagtt ccaaccggaa ttaaagtatt    240

tagatgatta gctaccctcc acggaacaca aataaattat tcaccttcaa taatatgatc    300

attaggattt gtctttctat ttaccgtagg aggattaaca ggagtagtat tagcaaattc    360

atccattgat attattcta                                                 379

<210>35

<211>379

<212>DNA

<213>谷蠹(Rhyzopertha dominica)

<400>35

agaagtttac attttaatcc taccaggatt tggtataatt tctcatatta ttagacatga    60

aagaggaaaa aaggaaacct ttggttctct agggataatt tacgcaataa tagcaattgg    120

actattagga tttattgtat gagcacatca catatttacc gtaggaatag acgtagatac    180

ccgagcatat tttacttcag caacaataat tattgcagtt ccaaccggaa ttaaagtatt    240

tagatgatta gctaccctcc acggaacaca aataaattat tcaccttcaa taatatgatc    300

attaggattt gtctttctat ttaccgtagg aggattaaca ggagtagtat tagcaaattc    360

atccattgat attattcta                                                 379