白念珠菌毒力相关基因CaMSS11及其用途

摘要

本发明公开了一种白念珠菌的毒力相关基因(CaMSS11)及其用途，CaMSS11基因在白念珠菌中是一个重要的毒性因子。本发明还公开了一种白念珠菌减毒株，所述的减毒株中CaMSS11基因基本上不表达。本发明还公开了一种含有CaMss11蛋白和CaFlo8蛋白的复合物，所述的复合物可以用于调控白念珠菌的菌丝发育和毒性表现，以及用于筛选抑制白念珠菌菌丝发育和毒性的物质。

说明书

技术领域

本发明属于微生物学领域，具体涉及一种白念珠菌菌丝生长和毒力相关基因及其用途。

背景技术

白念珠菌(Candida albicans)是一种临床上分离到的机会性人体致病真菌，是一种人体机会性致病真菌，能引起广泛的深部和浅部感染，但是其真正的致病因子和致病机理没有完全研究清楚。

在免疫下调的病人中，如器官移植病人，艾滋病毒感染者等，可以引起广泛的浅部和深部系统感染，感染部位包括口腔，女性阴道等，引起鹅口疮，阴道炎等疾病，也可以侵入表皮和内皮细胞进入血液到达内脏器官，如肾脏，脑部等，导致败血症，严重可以导致死亡(Odds，F.C.1994.J Am Acad Dermatol.31：S2-S5)。白念珠菌在不同的生长条件下，呈现不同的生长形态，包括菌体(yeastform)，假菌丝(pseudohyphae)和菌丝(hyphae)。各种形态之间的相互转化能力直接影响白念珠菌的致病能力(Odds，F.C.1985.Crit Rev Microbiol.12：45-93；Brown，A.J.P.et al.1999.Trends Microbiol.7：334-338)，而形态转换缺陷的菌株其系统感染能力下降或消失(Lo，H.J.et al，1997.Cell.90：939-949；Braun，B.R.et al.2001.EMBO J.20：4753-61；Hwang，C.S.et al.2003.Mol Microbiol.47：1029-43)。最近有些实验室利用减毒菌株作为疫苗来免疫小鼠，取得了比较好的效果，并对其进行了深入的生物化学分析，为疫苗的研制提供了理论基础(Elena FA et al，Proteomics 2004，4，3007-3020；Elena FA et al，Proteomics 2004，4，1204-1215)。许多培养条件可以引起白念珠菌的形态转换，包括血清，温度，pH值，氮源利用以及氧压等等。细胞内调节白念珠菌形态转换的分子机制主要有MAPK途径(mitogen-activaied protein kinase pathway)和cAMP/PKA途径(cAMP-dependent protein kinase A pathway)。同时还发现Cph2介导的，Efg1介导的以及pH应答的信号途径也都和白念珠菌的形态发生相关(Lane，S.et al.2001.Mol Cell Biol.21：6418-28；Stoldt，V.R.，et al.1997.EMBO J.16：1982-1991；El Barkani，A.et al.2000.Mol Cell Biol.20：4635-4647)。在白念珠菌中还存在具有抑制作用的信号途径，主要是由Tup1介导的信号转导途径，依靠特异性DNA结合抑制因子Rfg1，Nrg1等来发挥作用(Kadosh，D.et al.2001.Mol Cell Biol.21：2496-2505；Braun，B.R.et al.2001.EMBO J.20：4753-4761)。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中。

目前对于白念珠菌真正的致病因子和致病机理没有完全研究清楚，因此本领域还有必要研究白念珠菌的致病因子。

发明内容

本发明的目的在于提供一种白念珠菌减毒株(无毒株)。

本发明的另一目的在于提供一种筛选抑制白念珠菌的毒性的潜在物质的方法。

本发明的另一目的在于提供白念珠菌毒性相关的复合物，所述的复合物含有CaMss11蛋白和CaFlo8蛋白。

在本发明的第一方面，提供一种白念珠菌减毒株，所述的减毒株中CaMSS11基因基本上不表达。

在另一优选例中，所述的减毒株中CaMSS11基因或基因片段缺失。

在另一优选例中，相对于野生型白念珠菌，所述的减毒株中菌丝生长相关基因表达下降。

在另一优选例中，所述的菌丝生长相关基因包括：HWP1基因或ECE1基因。

在另一优选例中，所述的减毒株通过同源重组的方法从野生型白念珠菌染色体中敲除CaMSS11基因或基因片段获得。

在另一优选例中，所述的CaMSS11的基因：

(1)具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；或

(2)截短的SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，且该基因不编码CaMss11蛋白或编码降低活性(优选活性降低50％，更优选降低80％，更优选无活性)的CaMss11蛋白或蛋白片段。

在另一优选例中，所述的组合物是疫苗。

在本发明的第二方面，提供一种组合物，所述的组合物含有有效量的所述的白念珠菌减毒株和药学上可接受的载体。

在本发明的第三方面，提供一种筛选抑制白念珠菌的毒性的潜在物质的方法，所述方法包括：

(a)在测试组中，向表达CaMss11蛋白的体系中添加待筛选的候选物，并检测CaMss11蛋白的表达或活性；并且，在对照组中，在不添加所述候选物的、表达CaMss11蛋白的体系中，检测CaMss11蛋白的表达或活性；

(b)将步骤(a)测试组中CaMss11蛋白的表达或活性与对照组中CaMss11蛋白的表达或活性进行比较，

如果测试组中CaMss11蛋白的表达或活性在统计学上低于(优选显著低于，较佳的低20％或更低；更佳的低40％或更低；进一步更佳的低60％或更低)对照组，就表明该候选物是抑制白念珠菌的毒性的潜在物质。

在本发明的第四方面，提供一种白念珠菌毒性相关的复合物，所述的复合物含有CaMss11蛋白和CaFlo8蛋白，两种蛋白相互结合。

在本发明的第五方面，提供所述的复合物的用途，用于筛选抑制白念珠菌的毒性的物质。

在本发明的第六方面，提供一种利用所述的复合物筛选抑制白念珠菌的毒性的潜在物质的方法，所述方法包括：

(a)在测试组中，向CaMss11蛋白和CaFlo8蛋白相互作用的反应体系中添加待筛选的候选物，并检测CaMss11蛋白和CaFlo8蛋白相互作用情况；并且，在对照组中，在不添加所述候选物的、CaMss11蛋白和CaFlo8蛋白相互作用的反应体系中，检测CaMss11蛋白和CaFlo8蛋白的相互作用情况；

(b)将步骤(a)测试组中CaMss11蛋白和CaFlo8蛋白的相互作用情况与对照组中CaMss11蛋白和CaFlo8蛋白的相互作用情况进行比较，

如果测试组中CaMss11蛋白和CaFlo8蛋白的相互作用在统计学上弱于(优选显著弱于，较佳的弱20％或更弱；更佳的弱40％或更弱；进一步更佳的弱60％或更弱)对照组，就表明该候选物是抑制白念珠菌的毒性的潜在物质。

在另一优选例中，所述的相互作用是结合。

在另一优选例中，所述的CaMss11蛋白和CaFlo8蛋白的相互作用的反应体系为酵母双杂交体系或免疫共沉淀体系；或为含有重组的CaMss11蛋白和CaFlo8蛋白的溶液。

在本发明的第七方面，提供一种白念珠菌CaMSS11基因或蛋白的拮抗剂的用途，用于制备抑制白念珠菌的毒性的组合物。

另一方面，提供一种CaMSS11基因的用途，用于鉴定待测白念珠菌的毒性。

在另一优选例中，所述的鉴定待测白念珠菌毒性的方法包括：检测待测白念珠菌中CaMSS11基因的表达，

若相对于野生型白念珠菌，待测白念珠菌CaMSS11基因正常表达或超表达，则该白念珠菌具有一般毒性或高的毒性；

若相对于野生型白念珠菌，待测白念珠菌CaMSS11基因低表达或不表达，则该白念珠菌具有低的毒性或无毒性。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1A.在白念珠菌中敲除CaMSS11基因的策略及其染色体上的酶切图谱。

图1B.在白念珠菌CaMSS11基因的敲除过程中各个菌株的Southern杂交图谱。

图2.白念珠菌camss11/camss11缺失株在菌丝诱导条件下，在固体培养基和液体培养基中的形态(图2A)以及对菌丝特异性基因表达的影响(图2B)。培养条件在Agar+Serum(血清)固体培养基37℃培养5天；在YPD+Serum液体培养基37℃诱导3h。

图3.在小鼠系统感染试验中，CaMSS11基因的敲除使白念珠菌毒力降低。注射液浓度为5×10⁶细胞/毫升(图3A)或1×10⁶细胞/毫升(图3B)，每只小鼠尾静脉注射100μl菌液，共注射8只小鼠。

图4.利用白念珠菌体内免疫共沉淀检测到CaMss11与CaFlo8的相互作用。

图5.CaMss11的转录激活作用。

具体实施方式

本发明人经过广泛的研究，首次在白念珠菌中分离出一种白念珠菌毒性相关的基因，本发明人将之命名为CaMSS11基因。利用同源重组原理，本发明人在白念珠菌中构建了camss11/camss11缺失株，并证明CaMSS11基因的表达与白念珠菌的菌丝发育和毒性表现密切相关。利用酵母双杂交以及免疫共沉淀方法，证明了CaMss11蛋白通过协同作用与CaFlo8蛋白共同调控白念珠菌的菌丝发育和毒性表现，因此CaMss11蛋白与CaFlo8蛋白的相互作用体系可以用作筛选抑制白念珠菌毒性的药物的理想的筛选模型。

除非另外说明，所述的“白念珠菌MSS11基因”，“CaMSS11基因”，“CaMSS11”，“MSS11”可互换使用，都是指白念珠菌的MSS11基因。“白念珠菌Mss11蛋白”，“CaMss11蛋白”，“CaMss11”，“Mss11”蛋白可互换使用，都是指白念珠菌的Mss11蛋白。

除非另外说明，白念珠菌的减毒株(无毒株)用camss11/camss11表示，或用camss11/camss11缺失株表示，或用mss11/mss11表示，或用-/-表示。白念珠菌的单拷贝缺失株用MSS11/mss11表示，或用CaMSS11/camss11表示，或用+/-表示。白念珠camss11/camss11缺失株导入空载体的用mss11/mss11(V)表示，或用-/-(V)表示。白念珠菌的回复菌株用mss11/mss11(MSS11)，或用camss11/camss11(CaMSS11)表示，或用-/-(+)表示。白念珠菌的野生型菌株用WT表示，或用+/+表示。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

根据白念珠菌基因组序列(http://www.candidagenome.org/)，利用生物信息学比较分析，本发明人在白念珠菌的基因组序列中发现一个功能未知的新基因，该基因编码的产物与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Mss11蛋白具有较高的同源性，因此命名为白念珠菌CaMSS11基因。利用同源重组原理，本发明人在白念珠菌中构建了camss11/camss11缺失株。CaMSS11的缺失部分阻断白念珠菌的菌丝生长，而高表达CaMSS11基因则激活菌丝的生长。在小鼠系统感染实验中，camss11/camss11缺失株的毒性明显降低。这些结果表明CaMss11正向调控白念珠菌的丝状生长同时也影响该致病菌的毒性表现。从结构分析CaMss11具有一个能够形成稳定二聚体结构的LUFS结构域，免疫共沉淀实验表明，CaMss11能够和另一个具有LUFS结构域的毒力因子CaFlo8存在相互作用，说明CaMss11通过协同作用与CaFlo8共同调控白念珠菌的菌丝发育和毒性表现。因此，CaMSS11基因可以作为白念珠菌减毒的靶标。

通过建立转录激活测活系统，本发明人还发现CaMss11是一种转录调控因子，具有转录激活的作用，可通过筛选阻断CaMss11转录激活功能的物质，筛选抑制白念珠菌毒力或菌丝生长的物质。

作为本发明的优选方式，所述的CaMSS11的基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；CaMss11蛋白具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。所述的CaMSS11的基因也包括截短形式的CaMSS11的基因(或称为CaMSS11基因片段)，只要该基因片段在被敲除后可导致CaMss11蛋白不表达或表达异常，或其表达的CaMss11蛋白片段活性降低或没有活性。

所述的CaMSS11的基因可以作为一种白念珠菌毒性鉴定的标志物。例如可通过检测待测白念珠菌中CaMSS11基因的表达情况来确定白念珠菌的毒性；若相对于野生型白念珠菌，待测白念珠菌CaMSS11基因正常表达或超表达(即相对于野生型白念珠菌，待测白念珠菌中CaMSS11基因的表达高20％或更高，更佳的高50％或更高)，则该白念珠菌具有一般毒性或高的毒性；若相对于野生型白念珠菌，待测白念珠菌CaMSS11基因低表达或不表达，则该白念珠菌具有低的毒性或无毒性。

本发明还提供一种白念珠菌减毒株，该减毒株中CaMSS11基因基本上不表达。所述的“基本上不表达”是指白念珠菌减毒株中CaMSS11基因不表达或低表达。其中，CaMSS11基因低表达是指该减毒株中CaMSS11基因的表达量低于野生型白念珠菌的20％；较佳的是低于野生型白念珠菌的10％；更佳的是低于野生型白念珠菌的5％或更低，最佳的低于2％。CaMSS11基因基本上不表达的菌株可以通过各种基因抑制、基因沉默、基因敲除等技术来构建。例如，可以通过基于同源重组的基因敲除技术来将CaMSS11基因从染色体上敲除，从而使得CaMSS11基因缺失；可以针对CaMSS11基因设计干扰性RNA或反义核苷酸来使CaMSS11基因表达抑制或沉默。

一种使得CaMSS11基因缺失的方法是基因敲除技术，在本发明的优选实施方式中，体外构建CaMSS11基因敲除质粒，通过同源重组的方法，把白念珠菌染色体CaMSS11基因中的1.9kb DNA同源片段用HisG-URA3-HisG替换，从而敲除染色体上的CaMSS11基因。在含5-氟乳清酸平板上，通过压力筛选，使两个同向HisG同源序列得以重组，从而环出筛选标志基因URA3和一个拷贝HisG序列，丢失了URA3筛选标志基因的重组子可在5-FOA平板上筛选得到。通过进行第二轮的转化进而敲除第二条染色体上的CaMSS11基因。

所述的白念珠菌减毒株可以用于研究CaMSS11基因基本上不表达对于白念珠菌中其它基因表达情况的影响，以及研究CaMSS11基因基本上不表达后白念珠菌的菌丝生长情况以及毒性情况。

所述的白念珠菌减毒株可以用于制备疫苗，来免疫动物，从而在不对动物造成危害的情况下使得动物对白念珠菌感染产生免疫力。

本发明还提供一种白念珠菌毒性相关的复合物，所述的复合物含有CaMss11蛋白和CaFlo8蛋白，两种蛋白相互结合。本发明人通过酵母双杂交以及免疫共沉淀技术证明，CaMss11与CaFlo8在白念珠菌内能够相互结合，这种结合不受生长方式的调控，也即CaMss11通过协同作用与CaFlo8共同调控白念珠菌的菌丝发育和毒性表现。因此，所述的复合物可以作为筛选抑制白念珠菌毒性的药物的筛选模型。

作为本发明的优选方式，所述的CaFlo8的氨基酸序列可以与orf19.1093所示的序列基本上相同，其核苷酸序列可以与orf19.1093所示的序列基本上相同。

因此，本发明还提供了一种筛选抑制白念珠菌的毒性的潜在物质的方法，所述方法包括：向CaMss11蛋白和CaFlo8蛋白相互作用(相互结合)的反应体系中添加待筛选的候选物，并检测CaMss11蛋白和CaFlo8蛋白相互作用情况；如果CaMss11蛋白和CaFlo8蛋白的相互作用在统计学上减弱，就表明该候选物是抑制白念珠菌的毒性的潜在物质。在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到CaMss11蛋白和CaFlo8蛋白相互作用的变化，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物的、CaMss11蛋白和CaFlo8蛋白相互作用的反应体系。

作为本发明的另一种优选方式，还提供了一种筛选抑制白念珠菌的毒性的潜在物质的方法，所述方法包括：向表达CaMss11蛋白的体系中添加待筛选的候选物，并检测CaMss11蛋白的表达情况；如果CaMss11蛋白的表达情况在统计学上减弱，就表明该候选物是抑制白念珠菌的毒性的潜在物质。

在本发明中，检测蛋白与蛋白之间相互作用以及相互作用的强弱可采用多种本领域技术人员熟知的技术，比如GST沉降技术、噬菌体展示技术、酵母双杂交系统或免疫共沉淀技术。其中，酵母双杂交是一种大规模快速研究蛋白-蛋白间相互作用的方法，具有简单、稳定的优点。在本发明的一个优选例中，采用了酵母双杂交系统来鉴定CaMss11蛋白和CaFlo8蛋白的相互作用。更具体的，在酵母细胞中，一种与DNA-结构域融合的诱饵蛋白与一种与活化域融合的猎物蛋白相互作用。相互作用的成对分子结合于专一的序列模式，从而活化两个独立的报道基因的转录。

在本发明的一种优选方式中，采用免疫沉淀技术来验证蛋白与蛋白之间的特异性相互作用。所述的免疫共沉淀技术的原理是：在保持蛋白-蛋白相互作用的条件下，收获和裂解细胞，从细胞提取液中特异性地免疫沉淀目的蛋白，然后通过电泳等方法分离免疫沉淀物。具有已知特性的蛋白的共沉淀，可采用抗该蛋白的抗体，通过比如Western印迹来检测。此外，如果细胞在裂解前已经用标记物进行过标记，则可通过放射自显影或其它免疫学技术来观察共沉淀的蛋白。

作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的白念珠菌毒性抑制或菌丝生长抑制试验，以进一步选择和确定对于抑制白念珠菌毒性有用的物质。

本发明还提供一种白念珠菌CaMSS11基因或蛋白的拮抗剂的用途，用于抑制白念珠菌的毒性。所述的白念珠菌CaMSS11的拮抗剂例如是针对于CaMSS11基因的干扰性RNA或反义核苷酸，其能够特异性感染CaMSS11的表达；或是特异性抗CaMss11蛋白的抗体；或是特异性结合CaMss11蛋白的配体等。

作为本发明的一种方式，提供一种组合物，其含有有效量(如0.0001-10wt％；较佳的0.001-5wt％)的所述的白念珠菌减毒株以及药学上可接受的载体。优选的，所述的组合物是疫苗。所述的组合物对于动物没有可见的毒性和副作用。

所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。对于疫苗，所述的药学上可接受的载体例如包括一种佐剂。所述组合物在用于给药时，通常1×10³-1×10⁹个细胞/kg体重，较佳的1×10⁴-1×10⁸个细胞/kg体重是适合的；优选的可进行多次给药，以产生良好的免疫效果，例如可间隔1-3周进行重复给药。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

I.材料和方法

1.白念珠菌基因组DNA抽提

白念珠菌培养过夜用ddH₂O洗1次，悬浮在500μl溶液A中(1M山梨醇，100mM EDTA，pH8.0)，加入5μl 20mg/ml的Zymolyase，37℃放置1小时后，高速离心去上清，细胞用500μl TE缓冲液(20mM Tris·HCl pH7.5，1mM EDTA)洗一次，悬浮在350μl TE缓冲液中，并加入90μl的溶液B(250mM EDTA pH8.0，400mM Tris·HCl pH8.0，2％SDS)，65℃放置30分钟，加入80μl的5M KAc，冰上放置1小时，高速离心5分钟，吸取上清并加入1ml的无水乙醇，-20℃放置20分钟，高速离心5分钟，沉淀用70％乙醇洗一次，离心后烘干。

2.Southern分析

白念珠菌基因组DNA抽提后，基因组DNA用HindIII完全酶切，电泳完成后的琼脂糖胶分别用变性液和中和液浸泡45min，尼龙膜用双蒸水或10×SSC浸透，搭好转膜平台，胶与膜间用Parafilm封闭，加一个500g砝码。以10×SSC为转膜液转移过夜，第二天漂洗晾干交联。交联后的膜装入杂交管，加入10ml预杂交液(6×SSC，5×denhardt’s Reagent，0.5％SDS，100μg/ml鱼精DNA)，于42℃预杂交12h，探针在100℃变性5min，加入150μl(约1/3所标记的探例)42℃杂交10-16h。0.1×SSC，0.1％SDS洗两到三次，每次40min，取出膜，晾干，室温或-70℃压片。探针标记用Invitrogen的随机引物标记试剂盒，照其说明操作。将含25ng DNA的溶液于100℃加热变性5-10min，置于冰浴中，再依次加入Random Primers Buffer Mixture，2μl dCTP，2μl dGTP，2μl dTTP，3μl[α-³²P]-dATP(10μCi/μl)，混匀后加入1μl Klenow酶，于25℃保温1h，以Sephadex G-25柱以3000rpm离心4min，收集离心液，即为纯化后的探针溶液。探针于100℃变性5min冰上冷却后加入杂交体系中。

3.白念珠菌的转化

准备PEG/LiAc溶液(pH 7.5)10ml；在1.5mI Eppendof管中依次加入质粒5μg，10μl 10mg/ml鱼精DNA，混匀；加入0.1ml感受态细胞和0.6ml PEG/LiAc，振荡混匀；30℃ 200rpm培养30min；加入70μl DMSO，轻轻混匀；42℃热冲击15min，期间不时轻轻摇匀；冰浴2min：高速离心15s，吸掉上清，用0.2ml TE重悬细胞；涂布于适当的营养筛选SD平板上。

4.Northern分析

各菌株在YPD，30℃中培养至对数生长期后期，转接至YPD起始OD＝0.05，并在相应温度下培养指定时间，用热酚法抽提白念珠菌总RNA。20μl上样量包括RNA样品12μl(25μg)，4μl甲醛，2μl 10×MOPS，2μl上样缓冲液、65℃加热10min，0℃冷却2min，离心5s，上样。电泳在含甲醛的变性胶上进行(1g琼脂糖，10ml 10×MOPS，87ml DEPC处理水，加热融化稍冷后加入2.7ml 37％甲醛)。电泳条件为100mA，50-70V，5-7h电泳完成后同样用毛细法转膜，转膜液用5×SSC。转膜过夜后，取出膜，不能使膜干透，用Bio-Ra GS Gene Linker C3protocol紫外交联，加入10ml预杂交液，65℃，2h后更换为10ml杂交液，加入探针65℃杂交过夜，用2×SSC，0.1％SDS，65℃洗膜两次，每次30min。杂交好的膜不要晾干，用保鲜膜包好后-70℃压片。重杂交洗膜用0.5％SDS，90-100℃加热5-10min，或按照Clontech推荐用0.5％SDS，90-100℃加热10min后让其自然冷却10min后取出备用，若不立即位用，用保鲜膜包好后置于-20℃保存。

5.小鼠系统感染实验

以体重在16-18g ICR雄性小鼠为实验对象，通过尾静脉注射100μl白念珠菌各种菌株，并培养观测25天。各个菌株注射浓度为5×10⁶细胞/毫升或1×10⁶细胞/毫升。

6.免疫共沉淀与Western杂交

白念珠菌表达菌株在YPD培养基中于30℃培养至饱和，按A₆₀₀ 0.05转接于YPD培养基中于25℃培养6h，至A₆₀₀为0.6-1.0或在YPD+10％Serum培养基中于37℃培养3.5h，50ml培养物离心收集，10ml无菌水洗一次。以下步骤均在4℃进行。细胞重悬于0.5ml酵母细胞裂解液(200mM Tris-HCl pH 8.0，400mM(NH₄)₂SO₄，10mM MgCl₂，1mM EDTA，10％甘油，7mM β-巯基乙醇，2mM苯甲脒，1mM PMSF，2μg/ml抑肽素A，2μg/ml亮肽素(leupeptin)，4μg/ml antipain)，加入0.4g酸洗玻璃珠(425-600μm，Sigma)。在振荡器FP120上振3次，每次30s，间隔冰浴5min。裂解液12,000rpm离心5min，上清再离心5min，收集上清并测定蛋白浓度，-70℃保存。

取500μl细胞抽提物，与等体积的IP缓冲液混合，加入10μl床体积的protein G琼脂糖珠，在4℃旋转混合1小时后低速离心，吸取上清加入5μg的FLAG单抗，在4℃旋转混合1小时，然后加入30μl床体积的protein G琼脂糖珠，继续混合2小时。用IP缓冲液洗免疫共沉淀物五次，然后重悬在2×蛋白质电泳上样缓冲液中，进行SDS-PAGE电泳。用湿法将蛋白条带转移到硝酸纤维素膜上，用含5％脱脂奶粉的TBS-T溶液封闭膜2-3小时，一抗4℃结合过夜。用TBS-T室温洗膜1次，5分钟。用相应的二抗于室温结合1小时，再用TBS-T洗膜四次，每次5分钟，用ECL试剂显色。

II.实施例

实施例1、白念珠菌中CaMSS11基因的敲除

为了研究白念珠菌CaMSS11基因在白念珠菌形态发生和毒性表现中的功能，首先在白念珠菌中敲除CaMSS11基因。

图1A显示了基因敲除的策略。体外构建CaMSS11基因敲除质粒，通过同源重组的方法，把染色体CaMSS11基因中的1.9kb DNA同源片段用HisG-URA3-HisG替换，从而敲除染色体上的CaMSS11基因。在含5-氟乳清酸(5-fluoro-orotic acid，5-FOA)平板上，通过压力筛选，使两个同向HisG同源序列得以重组，从而环出筛选标志基因URA3和一个拷贝HisG序列，丢失了URA3筛选标志基因的重组子可以在5-FOA平板上筛选得到(Boeke et al.1984.Mol Gen Genet.197：345-346)，该重组子可以进行第二轮的转化进而敲除第二条染色体上的CaMSS11基因。

具体方法如下：

利用5’引物(SEQ ID NO：3)：

gca ctgcag GTTGCAATATGGAGATAAGAA；和

3’引物(SEQ ID NO：4)：

gcc tctaga AATAAGTTCCCTTACAACTTG；

从野生型白念珠菌株SC5314(参见Fonzi，W.A.，and Irwin，M.Y.(1993).Genetics 134，717-728)基因组DNA中用PCR的方法扩增大约0.7kb的片段，连接到质粒YEplac195(参见Gietz，R.D.，and A.Sugino.1988.Gene 74：527-534)的Pst I/Xba I位点，获得质粒YEplac195-MSS11(N)；

利用5’引物gca ggtacc GTATGCCACCTAATCAGAATC(SEQ ID NO：5)；和3’引物gca gagctc TTATATTAAGCGGTTGTGCGA(SEQ ID NO：6)；从野生型白念珠菌株基因组DNA中用PCR的方法获得扩增产物，继续连接到质粒YEplac195-MSS11(N)的KpnI/SstI位点，获得质粒YEplac195-MSS11(NC)。将质粒PCUB6(参见N.A.R.Gow et al.，Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America，Vol.91，No.13(Jun.21，1994)，pp.6216-6220)中的hisG-URA3-hisG的片段插入YEplac 195-MSS11(NC)的BamH I位点，从而体外构建了CaMSS11基因敲除质粒，在此质粒中CaMSS11开放阅读框(open reading frame，ORF)中约1.9kb DNA片段被HisG-URA3-HisG替代。质粒YEplac195-MSS11(NC)用PstI/SstI酶切并转化白念珠菌ura^-营养缺陷型菌株(CAI4野生型菌株，参见CN200510030585.2)，在缺少尿嘧啶的合成培养基上可以筛选到转入质粒的转化子。通过0.7kb和0.8kb两个同源片段和基因组上的CaMSS11同源片段重组，可以把染色体上的CaMSS11基因中的1.9kb DNA同源片段用HisG-URA3-HisG给替换掉，从而破坏染色体上的CaMSS11基因，正确插入的转化子通过Southern杂交分析确定。然后将正确插入的转化子涂在含5-氟乳清酸(5-fluoro-orotic acid，5-FOA)平板上，由于5-氟乳清酸对含有URA3的菌株来说是具有毒性的，所以可以通过两个同向HisG同源序列在同一条染色体上的重组而将URA3环出，那么在含5-氟乳清酸(5-fluoro-orotic acid，5-FOA)平板上长出的都是丢失了URA3筛选标记的重组菌。利用丢失了URA3筛选标记的重组菌可以进行下一轮的转化进而敲除另一条染色体上的CaMSS11基因。

所得重组子的基因型用Southern杂交技术检测确定。这些菌株的基因组DNA用SstI/XhoI酶切，与含0.7kb CaMSS11 DNA片段的探针杂交。杂交结果表明，CAI4野生型菌株显示一条2.1kb杂交条带，CaMSS11单拷贝缺失株显示2.1kb和9.0kb两条杂交带(CaLm2)，在5-FOA平板上将一份拷贝的HisG和URA3环出后，呈现一条较小的6.0kb杂交带(CaLm6)，通过两轮转化和环出，得到CaMSS11双拷贝缺失的菌株camss11/camss11(CaLm14)。图1B显示了CaMSS11基因敲除过程中各个菌株Southern杂交分析的图谱。

实施例2、CaMSS11基因的敲除对白念珠菌菌丝发育的影响

通过同源重组的方法在白念珠菌中敲除CaMSS11基因，Southern杂交分析证明敲除是成功的。为了检测CaMSS11基因的缺失是否会影响白念珠菌的菌丝发育，本发明人在液体YPD+10％血清和37℃菌丝诱导条件下，检测以下各个菌株的形态。野生型菌株(+/+)会形成长长的菌丝，CaMSS11/camss11单拷贝缺失株(+/-)也可以形成菌丝，但是菌丝的长度比野生型菌株短，而camss11/camss11缺失株(-/-)无法形成较长的菌丝，并且所形成的菌丝大部分是假菌丝，同时有部分细胞形成酵母形态。

因为单拷贝敲除的CaMSS11/camss11缺失株对菌丝形成已有明显影响，因此本发明人构建了CaMSS11基因在1kb自身启动子控制下表达的质粒BES116-CaMSS11，构建方法如下：以GTCCTGCAGGTATTATCGATTACAG(SEQ ID NO：7)和CTAGGTACCAGTACATAAGAAGAGC(SEQ ID NO：8)引物从野生型白念珠菌株基因组中扩增出CaMSS11序列，以PstI/KpnI酶切后插入到BES116载体(Feng，Q.，Summers，E.，Guo，B.，and Fink，G.(1999).J.Bacteriol.181，6339-6346)，获得BES116-CaMSS11。将BES116-CaMSS11导入camss11/camss11缺失株，发现获得的菌株(-/-(+)MSS11P)只能回复到单拷贝敲除菌株的水平。

接着，建立ADH1启动子控制的CaMSS11表达质粒，以CTAAGATCTGAGATGTCTAAACCACCACCT(SEQ ID NO：9)和CTGATCGATATCAAGAATACCCTCTACCTC(SEQ ID NO：10)引物从野生型白念珠菌株基因组中扩增出CaMSS11序列，以Bgl II/Cla I酶切后插入到BA1载体(参见Cao et al.，Molecular Biology ofthe Cell，Vol.17，295-307，January2006，自带ADH1启动子)，获得BA1-CaMSS11。将所述质粒导入camss11/camss11缺失株，发现ADH1启动子控制的CaMSS11基因导入camss11/camss11缺失株，获得的菌株(-/-(+)ADH1P)可以完全回复到野生型水平。

结果表明，CaMSS11基因对菌丝形成的影响是剂量依赖的。在含血清的2％琼脂的平板上培养5天，野生型菌株产生丝状菌落，CaMSS11/camss11单拷贝缺失菌株产生中间状态的丝状菌落，菌落边缘的丝减少，camss11/camss11缺失株产生的菌落边缘的丝则大大减少。将自身启动子诱导和ADH1启动子诱导的CaMSS11基因导入可以不同程度的回复丝状菌落的形成缺陷，见图2A。该结果说明，CaMSS11基因的缺失会影响白念珠菌的菌丝形成，并且这种影响是剂量依赖的。

白念珠菌从酵母态到菌丝态的转变伴随着一些菌体特异基因表达的关闭和菌丝特异基因表达的开放。HWP1基因编码一个细胞壁蛋白，作为白念珠菌细胞表面一个重要的黏附因子，是哺乳细胞谷胺酰氨转移酶的底物，而且HWP1mRNA在菌丝形成的过程中被不断诱导合成。Northern杂交实验表明，在YPD菌体培养条件下野生型菌株和其它菌株不表达HWP1，而在含血清培养基的菌丝诱导条件下，野生型菌株中HWP1被诱导大量表达，而camss11/camss11缺失株中HWP1的表达量大大下降，见图2B。在单拷贝缺失株中，HWP1的表达也有一定程度的降低。转入自身启动子调控的CaMSS11基因可以将HWP1的表达回复到单拷贝缺失株水平，而转入ADH1启动子调控的CaMSS11基因，HWP1的表达大量被诱导。与HWP1相似，另外一个菌丝特异性基因ECE1在各个菌株中也呈现出相似的表达模式。

实施例3、CaMSS11基因的敲除对白念珠菌毒力的影响

酵母-菌丝形态之间的转换能力与白念珠菌的致病能力密切相关，不能形成菌丝的菌株会丧失毒力，而组成型形成菌丝的菌株也会丧失或大幅下降其毒力。

本发明人构建的camss11/camss11缺失株菌丝发育有缺陷，于是本发明人通过小鼠系统感染试验来检测缺失株的感染能力或者毒力。以野生型菌株SC5314为阳性对照，crk1/crk1双拷贝缺失株(参见Mol Cell Biol.2000Dec；20(23)：8696-708)为阴性对照，检测camss11/camss11缺失株的毒性。

将18-20克的ICR雄性小鼠作为实验对象，通过小鼠的存活率曲线来分析这些缺失株的毒性变化。各菌株在YPD培养基中培养过夜，转接到新鲜的YPD培养基中再培养4小时，取适量菌液离心后重悬于生理盐水中，在显微镜下计数后稀释成所需浓度。每只小鼠通过尾静脉注射0.1ml白念珠菌悬液，每个菌种注射两个不同浓度，分别为5×10⁵细胞/只(高浓度)和1×10⁵细胞/只(低浓度)，每种浓度注射8只小鼠。观察小鼠在注射后25天中的死亡情况。

与野生型菌株相比，camss11/camss11缺失株的毒力明显下降。野生型菌株SC5314的毒力非常强，高浓度下在约天左右实验小鼠就全部死亡，低浓度下小鼠也在15天左右全部死亡。而camss11/camss11缺失株在第25天上，注射高浓度菌液的实验小鼠存活率约为60％(图3A)，注射低浓度菌液的实验小鼠存活率约90％，都明显低于野生型菌株的毒力(图3B)。

因此，由结果可见，CaMss11调控白念珠菌的毒性表现，是一个重要的毒力因子。

实施例4、CaMss11能与CaFlo8相互作用

CaFlo8是一个转录激活因子，在调控白念珠菌的菌丝发育和致病过程中发挥至关重要的作用，同CaMss11相似，它也含有一个保守的LUFS结构域，能够形成稳定的同源或者异源二聚体。为了检测CaMss11对白念珠菌菌丝的调控是否与CaFlo8相关联，本发明人利用白念珠菌体内的免疫共沉淀实验来检测CaMss11能否与CaFlo8发生相互作用。

以CGGGATCCCATGAATCATAAACAAGTACTACCAG(SEQ ID NO：11)和GGCGACGCGTCGATCGCCATTTTCAATTGGATCTGC(SEQ ID NO：12)为引物，以野生型菌株SC5314基因组DNA为模板扩增获得CaFLO8全长片段，用BamHI/MluI酶切后将CaFLO8全长片段插入到pPR673(参见Lu et al.MolecularBiology of the Cell，2008 Aug 6)的相应位点内，得到ACT1启动子控制下表达C端融合13Myc tag的CaFlo8表达质粒。用BamHI和StuI切去ACT1启动子，将剩余片段补平后连接，获得质粒p13Myc-CaFLO8。该质粒在转化前用SpeI酶进行线性化，可以在CaFLO8自身启动子控制下表达C端融合13Myc tag的CaFlo8。

pFLAG-MSS11质粒的构建如下：以GCA ggatcc ATACCACATAGATGTCTAAAC(SEQ ID NO：13)和ACATGCATGCCTTGTCATCGTCATCCTTGTAATCGATGTCATGATCTTTATAATCACCGTCATGGTCTTTGTAGTCttcataacctggacctgatcccat(SEQ ID NO：14)为引物，以野生型菌株SC5314基因组DNA为模板扩增获得CaMss11片段，用BamHI/SphI酶切后将该片段插入到pFLAG-ACT1-CaHIS1载体(参见Yeast，2002；19：611-618)的相应位点中，获得pFLAG-MSS11质粒。该质粒在转化前用StuI酶进行线性化。

将含13myc-CaFlo8的质粒导入野生型菌株RM1000(ura-，his-)(A.Negredo，L.Monteoliva，C.Gil，J.Pla and C.Nombela Microbiology(1997)，143，297-302)，经Western检测蛋白表达无误后，用该菌株作为受体菌再次转化线性化的pFLAG-MSS11质粒DNA。免疫共沉淀结果表明，CaMss 11与CaFlo8在白念珠菌体内存在相互作用，见图4。这种结合不受生长方式的调控，在酵母和菌丝形态的细胞中都能检测到它们的相互结合，说明CaMss11通过协同作用与CaFlo8共同调控白念珠菌的菌丝发育和毒性表现，抑制它们之间的相互作用可抑制白念珠菌的菌丝发育和毒性表现。

实施例5、转录调控因子Mss11转录激活测活系统的建立

本发明人将CaMss11全长基因克隆于带有LexA DNA结合结构域的质粒pEG202(购自Clontech)，并转化EGY48酵母(购自Clontech)，利用酵母系统检测LexA-Mss11是否具有转录激活作用。

pEG202-MSS11质粒的构建如下：以CTAGGATCCGAATACCACATGAGATG(SEQ ID NO：15)和CTGCCATGGTAGTACATAAGAAGAGC(SEQ IDNO：16)为引物，以野生型菌株SC5314基因组DNA为模板扩增获得CaMSS11片段，用BamHI/NcoI酶切后将该片段插入到pEG202的相应位点中，获得pEG202-MSS11质粒。

酵母转化子β-半乳糖苷酶活力的测定如下：

取一张Whatman滤纸，覆盖于相应的选择性培养基上(碳源为半乳糖)，用灭菌牙签从选择性培养基平板上挑取酵母转化子菌落(直径1～2mm)点到滤纸上，30℃培养2天，然后取出小心浸入液氮中(菌落面朝上)，约半分钟后取出，置室温几分钟，将滤纸(菌落面朝上)放于用Z buffer/X-gal溶液(100ml Z buffer中加入1.67ml 20g/L的X-gal，0.27mlβ-巯基乙醇；Z buffer含60mM Na₂HPO₄，40mM NaH₂PO₄，10mM KCl，1mM MgSO₄)预湿的滤纸上，30℃培养0.5～8h，检验菌落是否显蓝色，8h内显蓝色的菌落β-半乳糖苷酶活性为阳性。

在β半乳糖苷酶测活试验中，转化pEG202-MSS11和空质粒pJG4-5(购自Clontech)的酿酒酵母菌株显蓝色，说明Mss11具有转录激活作用，见图5。

进一步可利用lacZ作为报告基因分析Mss11各结构域的转录激活功能。同时建立Mss11的转录激活测活系统，用于筛选可以阻断Mss11转录激活功能的化学小分子，同时利用Mss11在白念珠菌菌丝生长中的重要功能，进一步用阻断菌丝发育的检测方法，评价化学小分子药物的药效。

实施例6、筛选方法1

如实施例4的方法，基于酵母双杂交技术，建CaMss11与CaFlo8的相互作用系统，并将所述系统分为：

对照组：不给予候选物质；和

测试组：给予候选物质。

检测对照组和测试组酵母细胞中情况，若相对于对照组，测试组中CaMss11与CaFlo8相互作用在统计学上有减弱，则说明候选物质是抑制白念珠菌的毒性的潜在物质。

实施例7、筛选方法2

以引物CTAGGATCCATGTCTAAACCACCACCTCAA(SEQ ID NO：17)和GATAAGCTTTTATTCATAACCTGGACCTGA(SEQ ID NO：18)从野生型菌株SC5314基因组DNA中扩增CaMSS11全长片段，用BamHI/HindIII酶切后连入pET28(a)(购自MERCK)载体的相应位点。导入大肠杆菌表达菌株BL21，建立表达CaMss11蛋白的系统，并将所述系统分为：

对照组：不给予候选物质；和

测试组：给予候选物质。

检测对照组和测试组细胞中情况，若相对于对照组，测试组中CaMss11蛋白的表达在统计学上减弱30％以上，则说明候选物质是抑制白念珠菌的毒性的潜在物质。

实施例8、抗CaMss11蛋白抗体的制备

以引物CTAGGATCCATGTCTAAACCACCACCTCAA(SEQ ID NO：19)和GATAAGCTTTTATTCATAACCTGGACCTGA(SEQ ID NO：20)从野生型菌株SC5314基因组DNA中扩增CaMSS11全长片段，用BamHI/HindIII酶切后连入pET28(a)(购自MERCK)载体的相应位点。导入大肠杆菌表达菌株BL21，1.0mM IPTG诱导3h之后，镍柱纯化His-CaMss11蛋白，然后常规方法免疫兔子，获得CaMss11蛋白的抗体，作为CaMss11蛋白的一种拮抗剂。验证发现，该抗体结合CaMss11的特异性良好，抑制CaMss11活性显著。

实施例9、利用减毒菌株制备疫苗

本实施例中，本发明人检测camss11/camss11缺失株作为减毒菌株能否可以使小鼠产生免疫力。

本发明人采用注射过camss11/camss11缺失株(将1×10⁵个白念珠菌camss11/camss11缺失株溶解于0.1ml的生理盐水溶液中，用于注射)15天后的存活小鼠，向其体内注射5×10⁶野生型的白念珠菌，再过25天后，发现10只小鼠有8只依然存活。事先未注射过camss11/camss11缺失株而仅注射过生理盐水的小鼠，15天后注射5×10⁶野生型的白念珠菌后，7天之后10只小鼠全部死亡。说明camss11/camss11缺失株能使小鼠对野生型的白念珠菌产生免疫力，因此本发明的减毒菌株可以作为一种有效的免疫疫苗。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>白念珠菌毒力相关基因CaMSS11及其用途

<130>086124

<160>20

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1914

<212>DNA

<213>白念珠菌(Candida albicans)

<400>1

atgtctaaac caccacctca acatcaactg aagaatgcta ataattcatt atcactgccg    60

gtatcagata aacaatctaa tgattctcga caattattat tagctcattt atataattat   120

ttcaaaacta atggattaga agaaactgct caagcattat taatagaatg caataatacc   180

attcctaagg caacaacaaa ttctaaaggt tattcattag ataatagtgg tcctgatcaa   240

aaagatacat ttttagatca atggtggggg ttattatggt caattcaatc atcaattaat   300

cctaatttaa atcaaatgac aaatccttca ggaatattaa ctcctcaaca tcaaatgatt   360

gtacaacaaa gaatgcttca acaacaacaa caacaggctc aacagcagca gcaacaggct   420

caacaacaac aggcccaaca acagcaacaa caacaacaat tgttgcaaca acaaagacta   480

cagcaacaag caatgatcca acaacaacat caacaacaat tgattaataa tttgagtgct   540

cgtcaacaac aagttggtct atctacaact actaatcaaa tgggaccacc tggtagtaat   600

agtaataatc ttcaatcaaa tatgtcacca aataatgaac aattacaatc acaagcaaga   660

ttacaacaat tgaaattaca atttcaacaa caacaacagc aacaacttca acaacagcag   720

caacaattgc aattacagca acagcaacag caacaacaac agcaacaaca acaacagcaa   780

caacaacaac aacaacaaca acgtcaacag caacgtcaac gacaaaagaa attccaacgt   840

caattactga ctctgtctca aagactgcca gttattaata atggacaacc gcaacaacaa   900

ctccaacaag atcaacgtcc tgcactggca ccacaaaatc aacctactcc aggaaacaac   960

aacaacaaca acaatactaa tgctgtatca ccggaattac atagacaatc tgttgatgat  1020

tatcaaatga acttattaca aatggaaaat caaaataatt cacaaagaca aaaatatttg  1080

aataatcaac aaacacgtaa ctcacaacaa caacaacaac aacaacaact gcaactgcaa  1140

ctgcaacaac tgctgccatt tcaaccacca gctcagcaac ctaaaaatag tacaacaaca  1200

tcaactaata ctactactag tcgagcacag aagtcctcga gaaaacaaca accaaagaat  1260

tcaagacgtc aatctgttca acaacaacaa caacaacaac cccagcaaca accccaacaa  1320

tctcaacaaa tgtcgacttc ttcacaatct tttaccgctg ctaataattc aaataatgtg  1380

aataatacat ttgatatttc accacaaatt caagatcaag gaatgttatc caccaaagaa  1440

caacaacaac aaccccagca accgcaacca caaccgcaat cgcaatcgca atcacaatca  1500

caatctctac cttcaaataa taacaataac aataacaata aacaagatgt tgttaatgta  1560

gtatttgatg atgcattttt cctgggtaat ttacttttag atgattttaa tgaatttgcc  1620

aatagtacaa gtaataatgg taatggtaat ggtaataatg atatgaattc acaatttaat  1680

aatacacaaa cagaaagaat aatgtttagt atgccaccta atcagaatca aaatcaattt  1740

ccttcacaat ctggtgatgg tggaggagga ggtggtggaa gtatgcaacc taattttttc  1800

gaaggtattg aattaggtga tggaaataat agtggtaatg gagatgatga tgatgctcct  1860

ataattacta ctgattggtt aagtctgatg ggatcaggtc caggttatga ataa        1914

<210>2

<211>637

<212>PRT

<213>白念珠菌(Candida albicans)

<400>2

Met Ser Lys Pro Pro Pro Gln His Gln Ser Lys Asn Ala Asn Asn Ser

1               5                   10                  15

Leu Ser Ser Pro Val Ser Asp Lys Gln Ser Asn Asp Ser Arg Gln Leu

            20                  25                  30

Leu Leu Ala His Leu Tyr Asn Tyr Phe Lys Thr Asn Gly Leu Glu Glu

        35                  40                  45

Thr Ala Gln Ala Leu Leu Ile Glu Cys Asn Asn Thr Ile Pro Lys Ala

    50                  55                  60

Thr Thr Asn Ser Lys Gly Tyr Ser Leu Asp Asn Ser Gly Pro Asp Gln

65                  70                  75                  80

Lys Asp Thr Phe Leu Asp Gln Trp Trp Gly Leu Leu Trp Ser Ile Gln

                85                  90                  95

Ser Ser Ile Asn Pro Asn Leu Asn Gln Met Thr Asn Pro Ser Gly Ile

            100                 105                 110

Leu Thr Pro Gln His Gln Met Ile Val Gln Gln Arg Met Leu Gln Gln

        115                 120                 125

Gln Gln Gln Gln Ala Gln Gln Gln Gln Gln Gln Ala Gln Gln Gln Gln

    130                 135                 140

Ala Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Leu Leu Gln Gln Gln Arg Leu

145                 150                 155                 160

Gln Gln Gln Ala Met Ile Gln Gln Gln His Gln Gln Gln Leu Ile Asn

                165                 170                 175

Asn Leu Ser Ala Arg Gln Gln Gln Val Gly Leu Ser Thr Thr Thr Asn

            180                 185                 190

Gln Met Gly Pro Pro Gly Ser Asn Ser Asn Asn Leu Gln Ser Asn Met

        195                 200                 205

Ser Pro Asn Asn Glu Gln Leu Gln Ser Gln Ala Arg Leu Gln Gln Leu

    210                 215                 220

Lys Leu Gln Phe Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Leu Gln Gln Gln Gln

225                 230                 235                 240

Gln Gln Leu Gln Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln

                245                 250                 255

Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Arg Gln Gln Gln Arg

            260                 265                 270

Gln Arg Gln Lys Lys Phe Gln Arg Gln Leu Ser Thr Ser Ser Gln Arg

        275                 280                 285

Ser Pro Val Ile Asn Asn Gly Gln Pro Gln Gln Gln Leu Gln Gln Asp

    290                 295                 300

Gln Arg Pro Ala Ser Ala Pro Gln Asn Gln Pro Thr Pro Gly Asn Asn

305                 310                 315                 320

Asn Asn Asn Asn Asn Thr Asn Ala Val Ser Pro Glu Leu His Arg Gln

                325                 330                 335

Ser Val Asp Asp Tyr Gln Met Asn Leu Leu Gln Met Glu Asn Gln Asn

            340                 345                 350

Asn Ser Gln Arg Gln Lys Tyr Leu Asn Asn Gln Gln Thr Arg Asn Ser

        355                 360                 365

Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Ser Gln Ser Gln Ser Gln Gln Ser

    370                 375                 380

Ser Pro Phe Gln Pro Pro Ala Gln Gln Pro Lys Asn Ser Thr Thr Thr

385                 390                 395                 400

Ser Thr Asn Thr Thr Thr Ser Arg Ala Gln Lys Ser Ser Arg Lys Gln

                405                 410                 415

Gln Pro Lys Asn Ser Arg Arg Gln Ser Val Gln Gln Gln Gln Gln Gln

            420                 425                 430

Gln Pro Gln Gln Gln Pro Gln Gln Ser Gln Gln Met Ser Thr Ser Ser

        435                 440                 445

Gln Ser Phe Thr Ala Ala Asn Asn Ser Asn Asn Val Asn Asn Thr Phe

    450                 455                 460

Asp Ile Ser Pro Gln Ile Gln Asp Gln Gly Met Leu Ser Thr Lys Glu

465                 470                 475                 480

Gln Gln Gln Gln Pro Gln Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Ser Gln Ser

                485                 490                 495

Gln Ser Gln Ser Gln Ser Leu Pro Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn

            500                 505                 510

Asn Lys Gln Asp Val Val Asn Val Val Phe Asp Asp Ala Phe Phe Ser

        515                 520                 525

Gly Asn Leu Leu Leu Asp Asp Phe Asn Glu Phe Ala Asn Ser Thr Ser

    530                 535                 540

Asn Asn Gly Asn Gly Asn Gly Asn Asn Asp Met Asn Ser Gln Phe Asn

545                 550                 555                 560

Asn Thr Gln Thr Glu Arg Ile Met Phe Ser Met Pro Pro Asn Gln Asn

                565                 570                 575

Gln Asn Gln Phe Pro Ser Gln Ser Gly Asp Gly Gly Gly Gly Gly Gly

            580                 585                 590

Gly Ser Met Gln Pro Asn Phe Phe Glu Gly Ile Glu Leu Gly Asp Gly

        595                 600                 605

Asn Asn Ser Gly Asn Gly Asp Asp Asp Asp Ala Pro Ile Ile Thr Thr

    610                 615                 620

Asp Trp Leu Ser Ser Met Gly Ser Gly Pro Gly Tyr Glu

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