检测底泥中荧光素双醋酸酯活性的方法

摘要

本发明公开了一种检测底泥中荧光素双醋酸酯活性的方法，包括：1)称取底泥样品，加入磷酸缓冲液振荡混匀；加入FDA溶液启动反应，振荡培养显色；2)培养结束后，立即加入氯仿/甲醇混合终止剂终止反应，充分振荡摇匀；3)将混合液离心后取上清液在490nm处测定吸光度；4)计算荧光素量，进而对FDA活性进行计算与单位标准化。在线性范围内选择适宜的培养时间，可以有效降低测定周期；能快速、有效终止荧光素显色反应，保证测定结果的准确、快速，重现性好；优化离心时间，保证获得FDA活性的最大值，客观、科学的表征底泥的FDA活性；定量、规范FDA表征单位，大大提高底泥FDA活性数据的规范化和可比性。

说明书

技术领域

本发明涉及一种底泥微生物活性的检查方法，尤其涉及一种检测底泥中荧光素双醋酸酯活性的方法。

背景技术

荧光素双醋酸酯(FDA)可被不同的酶如蛋白酶、脂肪酶和酯酶消解，产物为荧光素，可利用分光光度计和荧光光度计定量测定，其在最大吸收波长下的吸光值(abs)与细胞活性成正比，是多种环境样本中微生物总酶活性的迅速、灵敏、简便的测定方法。由于测定基质的差异及不同环境样品在理化性质、污染状况、微生物活性高低等方面的差异均会影响FDA方法的重要操作步骤与适用性。

微生物在自然环境下对底泥中污染物的净化及其利用过程会直接影响其向水体的二次释放，对水环境质量具有重要意义。

现有的研究包括在活性污泥、沉积生物膜、深海粘土和土壤等介质中的测定与应用。但对于底泥介质特别是污染底泥中常含有重金属、营养物、有机物等多种污染物质，对其微生物特性产生一定的影响乃至抑制。

现有技术中的底泥微生物活性的检测方法中至少存在以下缺点：

终止手段缺乏、培养时间过长、活性单位不规范。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便、有效、针对性强、规范的检测底泥中荧光素双醋酸酯活性的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明的检测底泥中荧光素双醋酸酯活性的方法，包括步骤：

A、反应启动与培养：称取底泥样品，加入磷酸缓冲液振荡混匀，并加入荧光素双醋酸酯溶液启动反应，包括振荡、培养、显色；

B、反应终止：培养结束后，立即加入氯仿/甲醇混合终止剂终止反应，振荡摇匀；

C、离心测定：将已终止反应并振荡后的混合液进行离心处理后，取上清液在490nm处测定吸光度；

D、计算所述底泥中的荧光素量，进而对荧光素双醋酸酯的活性进行计算和对单位标准化，具体包括：

标准曲线绘制：配制一系列浓度不同的荧光素标准溶液，于490nm处测定各荧光素标准溶液的吸光度abs，以所述各荧光素标准溶液的荧光素浓度与其所测得的吸光度值绘制标准曲线，并求得所述标准曲线的斜率b，并通过公式计算荧光素浓度：C_f＝abs×b；

荧光素双醋酸酯溶液活性计算与单位标准化：将所述步骤C中的上清液在490nm处测定的吸光度根据所述荧光素标准曲线换算为荧光素浓度，再根据以下公式计算所述底泥的土壤荧光素双醋酸酯活性：式中：

U_FDA为土壤荧光素双醋酸酯活性，单位：μg荧光素/g/min，以干重计；

C_f为荧光素浓度，单位：μg/mL；

V为所述步骤A中的混合溶液的总体积，单位：mL；

m为所述底泥样品重量，单位：g，以干重为基准进行计算；

t为所述步骤A中的培养时间，单位：min。

由上述本发明提供的技术方案可以看出，本发明所述的检测底泥中荧光素双醋酸酯活性的方法，由于首先称取底泥样品，加入磷酸缓冲液振荡混匀，并加入荧光素双醋酸酯溶液启动反应，振荡培养显色；培养结束后，立即加入氯仿/甲醇混合终止剂终止反应，充分振荡摇匀；然后将混合液离心后取上清液在490nm处测定吸光度，并计算荧光素量，进而对荧光素双醋酸酯活性进行计算与单位标准化。能简便、有效、针对性强、规范的检测底泥中荧光素双醋酸酯活性。

具体实施方式

本发明的检测底泥中荧光素双醋酸酯活性的方法，其较佳的具体实施方是，包括步骤：

A、反应启动与培养：称取底泥样品，加入磷酸缓冲液振荡混匀，并加入荧光素双醋酸酯溶液启动反应，包括振荡、培养、显色；

B、反应终止：培养结束后，立即加入氯仿/甲醇混合终止剂终止反应，振荡摇匀；

C、离心测定：将已终止反应并振荡后的混合液进行离心处理后，取上清液在490nm处测定吸光度；

D、计算所述底泥中的荧光素量，进而对荧光素双醋酸酯的活性进行计算和对单位标准化，具体可以包括：

标准曲线绘制：配制一系列浓度不同的荧光素标准溶液，于490nm处测定各荧光素标准溶液的吸光度abs，以所述各荧光素标准溶液的荧光素浓度与其所测得的吸光度值绘制标准曲线，并求得所述标准曲线的斜率b，并通过公式计算荧光素浓度：C_f＝abs×b；

荧光素双醋酸酯溶液活性计算与单位标准化：将所述步骤C中的上清液在490nm处测定的吸光度根据所述荧光素标准曲线换算为荧光素浓度，再根据以下公式计算所述底泥的土壤荧光素双醋酸酯活性：式中：

U_FDA为土壤荧光素双醋酸酯活性，单位：μg荧光素/g/min，以干重计；

C_r为荧光素浓度，单位：μg/mL；

V为所述步骤A中的混合溶液的总体积，单位：mL；

m为所述底泥样品重量，单位：g，以干重为基准进行计算；

t为所述步骤A中的培养时间，单位：min。

上述的步骤A可以包括：

称取0.5-1g的底泥样品加入15mL pH＝7.6的磷酸缓冲液，振荡混匀，并加入0.2mL所述荧光素双醋酸酯溶液启动反应，于30℃下振荡，并培养时间：10min、20min、30min、40min、60min、80min、100min、120min；

通过反应体系上清液的吸光度与所述培养时间的线性关系，优化培养时间。

上述的步骤B中，可以在所述步骤A中的培养时间结束后，分别加入0mL、3mL、5mL、8mL、10mL、15mL体积比为2∶1的氯仿/甲醇混合终止剂以终止反应，充分振荡；

通过比较加入不同的终止剂的量的混合液静置0min和静置10min的两个吸光度之间的相对误差，优化终止剂用量。

上述步骤C中，可以将已终止反应并振荡后的混合液转移至10mL的离心管中，以2000r/min转速下离心3min、5min、8min、10min、12min、15min，并取各个时间段的上清液在490nm处测吸光度，以吸光度较大，反应效果明显为标准来优化离心时间。

上述步骤D中，标准曲线的测定方法可以是：

分别吸取0.1mg/mL的荧光素标准溶液1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL，并分别加入加入50mL的容量瓶中，再用去离子水分别稀释至50mL，摇匀后得到2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg/mL、12μg/mL的系列溶液，于490nm处测定各溶液的吸光度abs，以一系列荧光素浓度与其所测得的吸光度值绘制标准曲线。

上述荧光素双醋酸酯溶液可以通过以下方法配制：

称取100mg纯度≥99.99％的荧光素双醋酸酯试剂，并溶于40mL分析纯丙酮，并用丙酮定容至50mL，混匀后得到2mg/mL的荧光素双醋酸酯溶液。

对于含有大量营养物及有机物、重金属等复合污染物特点的河湖底泥，本发明针对性解决现有方法中终止手段缺乏、培养时间过长、活性单位不规范等问题，建立起污染底泥介质的一套简便、有效、针对性强、规范的污染底泥FDA活性测定方法，对其FDA活性测定的关键步骤与参数进行优化与确定，可对底泥中微生物性质测定提供直接的方法，并可为污染底泥的治理、处置提供重要技术参数和依据。与现有的环境样本微生物活性测定方法相比，本发明的有益效果与优点如下：

1)针对底泥样品，尤其是重金属、有机物等复合污染的底泥，本发明开发与优化出一系列FDA活性测定方法，该方法可以简便、快速、准确测定底泥样品的微生物总酶活性。

2)在线性范围内选择适宜的培养时间，可以有效降低测定周期；选择适当终止剂，快速、有效终止荧光素显色反应，FDA活性的测定过程的准确、快速，重现性好；优化离心时间，保证获得FDA活性的最大值，客观、科学的表征底泥的FDA活性。

3)通过荧光素显色标准曲线的绘制，通过定量公式规范FDA表征单位，大大提高不同环境样品及修复周期等的底泥FDA活性数据的规范化和可比性。

规范了FDA活性的单位和表征方法，统一以单位时间内单位重量样品的荧光素浓度来表示底泥的FDA活性，其单位为μg荧光素/g/min，以干重计。

下面通过具体实施例对本发明的方法进行详细的描述：

首先进行试剂配制：

1、荧光素双醋酸酯(FDA)溶液：准确称取100mg FDA试剂(纯度≥99.99％)溶于约40mL丙酮(分析纯)，用丙酮定容至50mL，混匀，即为2mg/mL的FDA溶液。

2、荧光素标准溶液：分别吸取0.1mg/mL的荧光素钠标准溶液1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL，并加入50mL容量瓶中，再用去离子水分别稀释至50mL，摇匀后得到2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg/mL、12μg/mL的系列溶液。

3、氯仿/甲醇混合终止剂：将氯仿(分析纯)和甲醇(分析纯)试剂以2∶1(v/v)充分混合.

然后进行操作步骤：

1)称取约0.5-1g底泥样品于100L锥形瓶中，加入15mL磷酸缓冲液(pH＝7.6)，振荡混匀；加入0.2mL 2mg/mL的FDA溶液启动反应，于30℃下振荡(培养10min、20min、30min、40min、60min、80min、100min、120min)，通过反应体系上清液的吸光度与培养时间的线性关系确定适宜的培养时间。

2)在优化的培养时间结束后，立即加入0mL、3mL、5mL、8mL、10mL、15mL氯仿/甲醇(2∶1v/v)混合终止剂以终止反应，充分振荡。通过比较静置0min和静置10min的两个吸光度之间的相对误差，以确定既经济又有效的终止剂用量。

3)将已终止反应并振荡后的混合液转移至10mL的离心管中，以2000r/min转速下离心3min、5min、8min、10min、12min、15min，取上清液在490nm处测吸光度(OD₄₉₀)。以吸光度较大，反应效果明显为标准来优化离心时间。

4)分别吸取0.1mg/mL的荧光素标准溶液1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL，并分别加入50mL容量瓶中，再用去离子水分别稀释至50mL，摇匀后得到2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg/mL、12μg/mL的系列溶液，于490nm处测定各溶液的吸光度，以一系列荧光素浓度与其所测得的吸光度值绘制荧光素标准曲线，并求得荧光素标准曲线的斜率。

5)将底泥样品反应体系上清液的吸光度根据所述荧光素标准曲线换算为荧光素浓度，其计算公式如下：

C_f＝b×OD₄₉₀

式中，C_f、b、OD₄₉₀分别为FDA活性荧光素浓度(μg/mL)、标准曲线斜率和底泥样品反应体系上清液在490nm处测得的吸光度。

6)根据FDA活性测定的培养时间、体系体积等参数换算为文献中常用的荧光素量标准表示方法，其计算公示如下，测定与计算以干重为基准：

$U_{\mathrm{FDA}}=\frac{C_f\times V}{m\times t}$

式中，U_FDA、V、m和t分别为土壤FDA活性(μg荧光素/g/min，以干重计)、FDA测定体系总体积(mL)、底泥样品重量(g，以干重为基准进行计算)和培养时间(min)。

具体实施例一：

本实施例所用样品为取自某河道的底泥，以底泥取样器将样品采集于灭菌样品袋中，带回实验室后4℃保存一周内用上述方法测定样品的FDA活性。

底泥样品的具体FDA活性测定步骤如下：

1)称取0.5-1.0g样品(记录底泥样品的准确质量)于100mL锥形瓶中，加入15mL磷酸缓冲液(pH＝7.6)，加入适量玻璃珠，振荡混匀；加入0.2mL 2mg/mL FDA溶液启动反应，于30℃下恒温振荡培养30min。

2)立即加入8mL氯仿/甲醇(2∶1v/v)混合终止剂终止反应，充分振荡5min。

3)将混合液转移至10mL离心管中，以2000r/min转速下离心5min，取上清液在490nm处测吸光度。

4)绘制荧光素标准曲线：分别吸取0.1mg/mL荧光素标准溶液1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL加入50mL容量瓶中，再用去离子水分别稀释至50mL，摇匀后得到2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg/mL、12μg/mL的系列溶液，于490nm处测定各溶液的吸光度，以一系列荧光素浓度与其所测得的吸光度值绘制标准曲线，求得斜率b.

5)将底泥样品的吸光度根据荧光素标准曲线换算为荧光素浓度，其计算公式如下：

C_f＝b×OD₄₉₀

式中，C_f、b、OD₄₉₀分别为FDA活性荧光素浓度(μg/mL)、标准曲线斜率和底泥样品在490nm处测得的吸光度。

6)FDA活性标准化与单位换算：根据FDA活性的计算公式计算各样品底泥的FDA活性。计算公示如下，测定与计算以干重为基准。

$U_{\mathrm{FDA}}=\frac{C_f\times V}{m\times t}$

式中，U_FDA、V、m和t分别为土壤FDA活性(μg荧光素/g/min，以干重计)、FDA测定体系总体积(mL)、底泥样品重量(g，以干重为基准进行计算)和培养时间(min)。

计算结果如下：

OD₄₉₀＝0.616；

V为FDA测定体系总体积(mL)＝23；

b为标准曲线斜率＝8.694；

t为培养时间(min)＝30；

m为底泥样品重量(g，以干重为基准进行计算)＝0.2449；

C_f为FDA活性荧光素浓度(μg/mL)＝5.3555；

U_FDA为土壤FDA活性(μg荧光素/g/min，以干重计)＝16.7655。

根据《水和废水监测分析方法》(第四版)中的实验误差及数据质量评价方法，采用相对平均偏差和变异系数来表达利用本发明分析测试同一底泥样品FDA活性的精密度，从而对本发明方法的可靠性进行评价。

相对平均偏差为平均偏差与均值的比值：

变异系数CV％或相对标准偏差RSD％为标准偏差与均值的比值：

按本发明方法测定的该样品的FDA活性分别为：16.7623、16.6262、16.5857、17.0106、

16.8644、16.2181、16.1203(μg荧光素/g/min，以干重计)。

根据上述计算方法，本发明方法的相对平均偏差为1.20％，变异系数为1.97％。

具体实施例二：

本实施例所用样品为取自某河道的底泥样品，其取样和保存方法同实施例1。

底泥样品的具体FDA活性测定步骤如下：

1)称取0.5-1.0g样品(记录底泥样品的准确质量)于100mL锥形瓶中，加入15mL磷酸缓冲液(pH＝7.6)，加入适量玻璃珠，振荡混匀；加入0.2mL 2mg/mL FDA溶液启动反应，于30℃下恒温振荡培养30min。

2)立即加入8mL氯仿/甲醇(2∶1v/v)混合终止剂终止反应，充分振荡5min。

3)将混合液转移至10mL离心管中，以2000r/min转速下离心5min，取上清液在490nm处测吸光度。

4)荧光素标准曲线绘制同实施例1。

5)将底泥样品的吸光度根据荧光素标准曲线换算为荧光素浓度，其计算公式如下：

C_f＝b×OD₄₉₀

式中，C_f、b、OD₄₉₀分别为FDA活性荧光素浓度(μg/mL)、标准曲线斜率和底泥样品在490nm处测得的吸光度。

6)FDA活性标准化与单位换算：根据FDA活性的计算公式计算各样品底泥的FDA活性。计算公示如下，测定与计算以干重为基准。

$U_{\mathrm{FDA}}=\frac{C_f\times V}{m\times t}$

式中，U_FDA、V、m和t分别为土壤FDA活性(μg荧光素/g/min，以干重计)、FDA测定体系总体积(mL)、底泥样品重量(g，以干重为基准进行计算)和培养时间(min)。

计算结果如下：

OD₄₉₀＝0.257；

V为FDA测定体系总体积(mL)＝23；

b为标准曲线斜率＝8.694；

t为培养时间(min)＝30；

m为底泥样品重量(g，以干重为基准进行计算)＝0.2578；

C_f为FDA活性荧光素浓度(μg/mL)＝2.2344；

U_FDA为土壤FDA活性(μg荧光素/g/min，以干重计)＝6.6450。

本实施例的可靠性评价方法同实施例1。

本实验测定的底泥样品微生物FDA活性分别为：6.6450、6.3886、6.6367、6.2849、6.5659、6.1451、6.2740(μg荧光素/g/min，以干重计)。

根据上述计算方法，本发明方法的相对平均偏差为2.35％，变异系数为3.08％。

本发明优化了活性测定培养时间，可起到快速、准确测定的目的；选择氯仿/甲醇混合终止剂：以氯仿(分析纯)和甲醇(2∶1v/v)混合终止剂经济、高效终止显色反应；优化离心时间，以达到最大吸光值；同时，对FDA活性的单位进行了规范化，以便于不同样品间的相互比较。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。