利用支链淀粉-对硝基肉桂酸接枝物原位包埋蛋白类生物大分子的方法

摘要

本发明公开了一种利用支链淀粉-对硝基肉桂酸接枝物原位包埋蛋白类生物大分子的方法。该方法包括步骤：将质量百分比浓度为5～20％支链淀粉-对硝基肉桂酸接枝物溶液与质量百分比浓度为4～8％的蛋白类生物大分子溶液混合均匀，倒入模具中，在紫外灯下光照，得到原位包埋蛋白类生物大分子的支链淀粉凝胶。本发明以对硝基肉桂酸为光反应性基团，通过紫外光交联光反应性基团，制备原位包埋蛋白类生物大分子的支链淀粉凝胶，不涉及其它化学交联剂与光引发剂；制备工艺简单，且容易控制，反应温和，室温成形；主要原料为支链淀粉，原料来源广泛，获得的支链淀粉凝胶具有优良的生物相容性和生物降解性，可望在生物医学工程领域获得应用。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学工程材料领域，特别涉及一种利用支链淀粉-对硝基肉桂酸接枝物原位包埋蛋白类生物大分子的方法。

背景技术

近年来，光交联水凝胶作为生物材料在药物控释以及组织工程等领域获得了广泛的应用。与其它交联方式相比，光交联方法制备水凝胶具有如下优点(Amsden B G，Sukarto A，Knight D K and Shapka S N.Biomacromolecules，2007，8：3758-3766)：(1)可使聚合物前驱体水溶液原位交联，因而可用于制备可注射水凝胶；(2)在室温或生理温度下快速聚合形成水凝胶；(3)产物几何形状易于控制；(4)原位聚合过程中产生较低的热量等。这些优点使光交联水凝胶在蛋白类生物大分子药物的包埋与控制释放方面备受青睐。

用于蛋白类生物大分子药物控释载体的光交联水凝胶，依据其主要原料来源可分为合成高分子类光交联水凝胶和天然高分子类光交联水凝胶，一般光活性基团为大分子单体末端丙烯酸酯中的双键。常用的化学合成前驱体有聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯衍生物、聚乙二醇聚丙交酯嵌段共聚物(甲基)丙烯酸酯衍生物等。Elisseeff等人(Elisseeff J，Anseth K，Langer R.Plastic andReconstructive Surgery，1999，104：1014-1022)利用可注射水凝胶的透皮光聚合技术，实现了软骨的异位形成；他们将牛关节软骨细胞悬浮于聚乙二醇双丙烯酸酯与聚乙二醇的水溶液中，然后将其皮下注射于鼠背上，在体外光源照射下聚合，经4-7周后取出，发现有新生类软骨结构形成。Liu等(Liu C C，Sawicki S M，Metters A T.Biomacromolecules，2008，9：75-83)以聚乙二醇双丙烯酸酯为大单体，在光引发剂的存在下，通过光交联原位包埋溶菌酶。但是这类化学合成前驱体不具备良好的生物降解性，其应用受到一定的限制。

与合成高分子类水凝胶相比，天然高分子类光交联水凝胶具有无毒易降解等优点，作为蛋白类生物大分子药物载体更具发展潜力。Leacha等(LeachaJ B，Schmidt C E.Biomaterials，2005，26：125-135)将透明质酸与甲基丙烯酸缩水甘油酯反应引入双键，再与牛血清蛋白溶液混合，在光引发剂的作用下发生光交联反应，原位包埋牛血清蛋白。Jeon等(Jeon O，Bouhadir K H，Mansour J M，Alsberg E.Biomaterials，2009，30：2724-2734)以Irgacure 2959为光引发剂，将甲基丙烯酸酯海藻酸盐与牛软骨细胞混合，在365nm的紫外光照下聚合，原位包埋牛软骨细胞。通过对活/死细胞的染色和MTT实验发现，原位包埋于光交联海藻酸盐凝胶中的牛软骨细胞具有一定生物活性。但是，有关合成时均使用了有一定细胞毒性的光引发剂，且在光聚合过程中，光引发剂可能诱导蛋白类生物大分子发生自由基聚合而导致蛋白类生物大分子失去活性。因此，如何在不加光引发剂条件下利用光交联技术制备适用的天然高分子类水凝胶，便成为生物医学工程材料领域的一项重要课题。

发明内容

为了克服现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种在室温和不加光引发剂条件下，利用支链淀粉-对硝基肉桂酸接枝物原位包埋蛋白类生物大分子的方法。

本发明的另一目的在于提供一种上述方法得到的支链淀粉凝胶。

本发明的再一目的在于提供上述支链淀粉凝胶的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种利用支链淀粉-对硝基肉桂酸接枝物原位包埋蛋白类生物大分子的方法，包括以下操作步骤：

(1)在60～90℃条件下，将1g支链淀粉溶于20～30mL无水二甲基亚砜中；将温度降至40～50℃，加入0.23～0.32gN，N′-二环己基碳二亚胺和0.07～0.09g 4-二甲氨基吡啶，溶解完全后得到支链淀粉溶液；将0.22～0.30g对硝基肉桂酸溶于5～10mL二甲基亚砜，得到对硝基肉桂酸溶液；将对硝基肉桂酸溶液滴加到支链淀粉溶液中，避光反应；反应完毕后，过滤除去沉淀物，将滤液用乙醇沉淀、洗涤，干燥，得到支链淀粉-对硝基肉桂酸接枝物；

(2)将步骤(1)所得支链淀粉-对硝基肉桂酸接枝物配制成质量百分比浓度为5～20％的支链淀粉-对硝基肉桂酸接枝物溶液，然后和质量百分比浓度为4～8％的蛋白类生物大分子溶液混合均匀，得到混合溶液；将混合溶液倒入模具中，在紫外灯下光照5～50min，得到原位包埋蛋白类生物大分子的支链淀粉凝胶。

步骤(1)所述避光反应的温度为40～50℃，反应时间为24h。

步骤(1)所述干燥为真空干燥，干燥温度为40～50℃，干燥时间为48h。

步骤(2)所述支链淀粉-对硝基肉桂酸接枝物溶液是将支链淀粉-对硝基肉桂酸接枝物溶于去离子水、缓冲试剂或生理盐水中；所述缓冲试剂为磷酸盐、碳酸盐或柠檬酸盐。

步骤(2)所述混合溶液中蛋白类生物大分子与支链淀粉-对硝基肉桂酸接枝物的质量比为1∶10～1∶100。

步骤(2)所述蛋白类生物大分子是牛血清蛋白、鸡蛋清蛋白、溶菌酶、辣根过氧化物酶或胰蛋白酶；所述蛋白类生物大分子溶液是将蛋白类生物大分子溶于去离子水、缓冲试剂或生理盐水中；所述缓冲试剂为磷酸盐、碳酸盐或柠檬酸盐。

步骤(2)所述模具为聚四氟乙烯模具、玻璃模具或硅橡胶模具。

步骤(2)所述紫外灯的波长为365nm，功率为4～15W，光强为0.4～1mW/cm²。

一种根据上述方法制备的支链淀粉凝胶。

上述支链淀粉凝胶可用于制备可注射蛋白类生物大分子药物载体或口服蛋白类生物大分子药物载体。

本发明的原理是：本发明以具有良好生物降解和生物相容性的支链淀粉为基本原材料，首先合成了支链淀粉-对硝基肉桂酸接枝物，以对硝基肉桂酸为光反应性基团，通过紫外光交联光反应性基团，接枝物混合溶液快速形成包埋蛋白类生物大分子药物的水凝胶；本发明通过控制支链淀粉-对硝基肉桂酸接枝物的浓度与光照时间，于室温和不加光引发剂条件下，制备系列可生物降解且具有良好生物相容性的载有蛋白类生物大分子药物的支链淀粉凝胶。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：(1)本发明以对硝基肉桂酸为光反应性基团，采用光交联法制备原位包埋蛋白类生物大分子的支链淀粉凝胶，不涉及其它化学交联剂与光引发剂，制备工艺简单，且容易控制；(2)反应条件温和，在室温下快速形成凝胶，可有效避免蛋白类生物大分子失活；(3)凝胶化过程在水介质中进行；(4)凝胶的强度可通过支链淀粉-对硝基肉桂酸接枝物的浓度及光照时间进行调控；(5)所采用的主要原料为支链淀粉，原料来源广泛，所形成的水凝胶具有良好的生物降解性及生物相容性。

附图说明

图1为原位包埋牛血清蛋白支链淀粉凝胶中牛血清蛋白的体外累积释放曲线图。

图2为天然牛血清蛋白与包埋牛血清蛋白的圆二色谱图。

图3为原位包埋溶菌酶支链淀粉凝胶中溶菌酶的体外累积释放曲线图。

图4为天然溶菌酶与包埋溶菌酶的圆二色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

支链淀粉-对硝基肉桂酸接枝物的制备：在70℃条件下，将1g支链淀粉溶于20mL无水二甲基亚砜中；降低温度至40℃，加入0.25gN，N′-二环己基碳二亚胺和0.074g 4-二甲氨基吡啶，搅拌溶解后得到支链淀粉溶液；将0.24g对硝基肉桂酸溶于10mL二甲基亚砜，得到对硝基肉桂酸溶液；将对硝基肉桂酸溶液滴加到支链淀粉溶液中，40℃条件下避光反应24h；反应完毕后，过滤除去沉淀物，将滤液逐滴滴加到6倍体积的乙醇中，过滤得到的沉淀用乙醇反复洗涤至用紫外可见分光光谱仪检测不到肉桂酸的吸收峰，然后40℃真空干燥48h，得到支链淀粉-对硝基肉桂酸接枝物。用紫外光谱法测得该支链淀粉-对硝基肉桂酸接枝物中，每100个糖环上含有对硝基肉桂酸酯基数目为1.6。

实施例2

支链淀粉-对硝基肉桂酸接枝物的制备：在60℃条件下，将1g支链淀粉溶于25mL无水二甲基亚砜中；降低温度至50℃，加入0.23g N，N′-二环己基碳二亚胺和0.074g 4-二甲氨基吡啶，搅拌溶解后得到支链淀粉溶液；将0.22g对硝基肉桂酸溶于5mL二甲基亚砜，得到对硝基肉桂酸溶液；将对硝基肉桂酸溶液滴加到支链淀粉溶液中，50℃条件下避光反应24h；反应完毕后，过滤除去沉淀物，将滤液逐滴滴加到6倍体积的乙醇中，过滤得到的沉淀用乙醇反复洗涤至用紫外可见分光光谱仪检测不到肉桂酸的吸收峰，然后45℃真空干燥48h，得到支链淀粉-对硝基肉桂酸接枝物。用紫外光谱法测得该支链淀粉-对硝基肉桂酸接枝物中，每100个糖环上含有对硝基肉桂酸酯基数目为1.5。

实施例3

支链淀粉-对硝基肉桂酸接枝物的制备：在90℃条件下，将1g支链淀粉溶于30mL无水二甲基亚砜中；降低温度至45℃，加入0.32g N，N′-二环己基碳二亚胺和0.09g 4-二甲氨基吡啶，搅拌溶解后得到支链淀粉溶液；将0.30g对硝基肉桂酸溶于8mL二甲基亚砜，得到对硝基肉桂酸溶液；将对硝基肉桂酸溶液滴加到支链淀粉溶液中，45℃条件下避光反应24h；反应完毕后，过滤除去沉淀物，将滤液逐滴滴加到6倍体积的乙醇中，过滤得到的沉淀用乙醇反复洗涤至用紫外可见分光光谱仪检测不到肉桂酸的吸收峰，然后50℃真空干燥48h，得到支链淀粉-对硝基肉桂酸接枝物。用紫外光谱法测得该支链淀粉-对硝基肉桂酸接枝物中，每100个糖环上含有对硝基肉桂酸酯基数目为1.9。

实施例4

将实施例1所得支链淀粉-对硝基肉桂酸接枝物配制成1mL质量百分比浓度为10％的支链淀粉-对硝基肉桂酸接枝物的磷酸盐缓冲溶液，然后向其中加入25μL质量百分比浓度为4％的牛血清蛋白的磷酸盐缓冲溶液，充分混匀，得到混合溶液；将混合溶液倒入聚四氟乙烯模具中(模具尺寸为20mm×20mm×1mm)，在波长为365nm的紫外灯(紫外灯的功率为6W，光强为0.6mW/cm²)下光照10min，得到原位包埋牛血清蛋白的支链淀粉凝胶。

将制得的原位包埋牛血清蛋白的支链淀粉凝胶置于10mL的磷酸盐缓冲溶液中，在37℃的水浴摇床(震荡速率为50转/分钟)中进行体外药物释放，释放液中牛血清蛋白的含量采用考马斯亮蓝法测定，再将24h的释放液进行圆二色谱分析。此载有牛血清蛋白的支链淀粉凝胶在磷酸盐缓冲溶液中持续释放，且在释放过程中无明显的初期爆释(如图1所示)。

通过圆二色谱法对包埋前后牛血清蛋白的构象进行测定，图2中(●)表示天然牛血清蛋白缓冲溶液的圆二色谱图，(○)表示本发明原位包埋牛血清蛋白支链淀粉凝胶释放24h的释放液的圆二色谱图。从图2可以看出，牛血清蛋白经光交联的支链淀粉凝胶包埋后，其圆二色谱图与天然牛血清蛋白的谱图是一致的，说明牛血清蛋白在包埋及释放的过程中，其构象得到了较好的保持。

实施例5

将实施例1所得支链淀粉-对硝基肉桂酸接枝物配制成1mL质量百分比浓度为10％的支链淀粉-对硝基肉桂酸接枝物的碳酸盐缓冲溶液，然后向其中加入50μL质量百分比浓度为4％的牛血清蛋白的碳酸盐缓冲溶液，充分混匀，得到混合溶液；将混合溶液倒入聚四氟乙烯模具中(模具尺寸为20mm×20mm×1mm)，在波长为365nm的紫外灯(紫外灯的功率为8W，光强为0.6mW/cm²)下光照20min，得到原位包埋牛血清蛋白的支链淀粉凝胶。

将制得的原位包埋牛血清蛋白的支链淀粉凝胶置于10mL的磷酸盐缓冲溶液中，在37℃的水浴摇床(震荡速率为50转/分钟)中进行体外药物释放，释放液中牛血清蛋白的含量采用考马斯亮蓝法测定。此包埋牛血清蛋白的支链淀粉凝胶在磷酸盐缓冲溶液中持续释放，且在释放过程中无明显的初期爆释。

实施例6

将实施例1所得支链淀粉-对硝基肉桂酸接枝物配制成1mL质量百分比浓度为5％的支链淀粉-对硝基肉桂酸接枝物的柠檬酸盐缓冲溶液，然后向其中加入25μL质量百分比浓度为4％的牛血清蛋白的柠檬酸盐缓冲溶液，充分混匀，得到混合溶液；将混合溶液倒入聚四氟乙烯模具中(模具尺寸为20mm×20mm×1mm)，在波长为365nm的紫外灯(紫外灯的功率为4W，光强为0.4mW/cm²)下光照50min，得到原位包埋牛血清蛋白的支链淀粉凝胶。

将制得的原位包埋牛血清蛋白的支链淀粉凝胶置于10mL的磷酸盐缓冲溶液中，在37℃的水浴摇床(震荡速率为50转/分钟)中进行体外药物释放，释放液中牛血清蛋白的含量采用考马斯亮蓝法测定。此包埋牛血清蛋白的支链淀粉凝胶在磷酸盐缓冲溶液中持续释放，且在释放过程中无明显的初期爆释。

实施例7

将实施例1所得支链淀粉-对硝基肉桂酸接枝物配制成1mL质量百分比浓度为15％的支链淀粉-对硝基肉桂酸接枝物水溶液，然后向其中加入50μL质量百分比浓度为4％的牛血清蛋白水溶液，充分混匀，得到混合溶液；将混合溶液倒入聚四氟乙烯模具中(模具尺寸为20mm×20mm×1mm)，在波长为365nm的紫外灯(紫外灯的功率为15W，光强为1mW/cm²)下光照5min，得到原位包埋牛血清蛋白的支链淀粉凝胶。

将制得的原位包埋牛血清蛋白的支链淀粉凝胶置于10mL的磷酸盐缓冲溶液中，在37℃的水浴摇床(震荡速率为50转/分钟)中进行体外药物释放，释放液中牛血清蛋白的含量采用考马斯亮蓝法测定。此包埋牛血清蛋白的支链淀粉凝胶在磷酸盐缓冲溶液中持续释放，且在释放过程中无明显的初期爆释。

实施例8

将实施例1所得支链淀粉-对硝基肉桂酸接枝物配制成1mL质量百分比浓度为10％的支链淀粉-对硝基肉桂酸接枝物的生理盐水溶液，然后向其中加入50μL质量百分比浓度为8％的溶菌酶的生理盐水溶液，充分混匀，得到混合溶液；将混合溶液倒入硅橡胶模具中(模具尺寸为20mm×20mm×1mm)，在波长为365nm的紫外灯(紫外灯的功率为6W，光强为0.6mW/cm²)下光照10min，得到原位包埋溶菌酶的支链淀粉凝胶。

将制得的原位包埋溶菌酶的支链淀粉凝胶置于10mL的磷酸盐缓冲溶液中，在37℃的水浴摇床(震荡速率为50转/分钟)中进行体外药物释放，释放液中溶菌酶的含量采用考马斯亮蓝法测定，再将24h的释放液进行圆二色谱分析。此包埋溶菌酶的支链淀粉凝胶在磷酸盐缓冲溶液中持续释放，且在释放过程中无明显的初期爆释(如图3所示)。与实施例2中牛血清蛋白的体外释放情况相比，溶菌酶的释放速率更快，48h的累积释放量更高。

通过圆二色谱法对包埋前后溶菌酶的构象进行测定，图4中(●)表示天然溶菌酶缓冲溶液的圆二色谱图，(○)表示本发明原位包埋溶菌酶支链淀粉凝胶释放24h的释放液的圆二色谱图。从图4可以看出，溶菌酶经光交联的支链淀粉凝胶包埋后，其圆二色谱图与天然溶菌酶的谱图是一致的，说明溶菌酶在包埋及释放的过程中，其构象得到了较好的保持。

实施例9

将实施例1所得支链淀粉-对硝基肉桂酸接枝物配制成1mL质量百分比浓度为10％的支链淀粉-对硝基肉桂酸接枝物的磷酸盐缓冲溶液，然后向其中加入100μL质量百分比浓度为8％的溶菌酶的磷酸盐缓冲溶液，充分混匀，得到混合溶液；将混合溶液倒入玻璃模具中(模具尺寸为20mm×20mm×1mm)，在波长为365nm的紫外灯(紫外灯的功率为12W，光强为0.8mW/cm²)下光照20min，得到原位包埋溶菌酶的支链淀粉凝胶。

将制得的原位包埋溶菌酶的支链淀粉凝胶置于10mL的磷酸盐缓冲溶液中，在37℃的水浴摇床(震荡速率为50转/分钟)中进行体外药物释放，释放液中溶菌酶的含量采用考马斯亮蓝法测定。此包埋溶菌酶的支链淀粉凝胶在磷酸盐缓冲溶液中持续释放，且在释放过程中无明显的初期爆释。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。