一种炎症性疾病相关的药物靶点及其应用

摘要

本发明涉及一种免疫细胞介导的炎症性疾病相关的药物靶点及其应用，所述的药物靶点是γ-氨基丁酸转运蛋白亚型1(GAT-1)。本发明公开了GAT-1或其激动剂的用途，用于制备抑制哺乳动物免疫细胞介导的炎症性疾病的组合物。本发明还公开了筛选抑制哺乳动物免疫细胞介导的炎症性疾病的潜在物质的方法。

说明书

技术领域

本发明属于基因技术领域，更具体地，本发明涉及一种免疫细胞介导的炎症性疾病相关的药物靶点及其应用。

背景技术

由免疫细胞介导的炎症性疾病主要是由活化的淋巴细胞攻击特定的靶器官引起的局部炎性浸润、器官功能受累、多种并发症的发生。免疫细胞介导的炎症性疾病包括器官特异性自身免疫性疾病，如多发性硬化、类风湿性关节炎、I型糖尿病、结肠炎、克隆氏病、葡萄膜炎、免疫细胞介导肝损伤、多发性肌炎及皮肌炎、桥本甲状腺炎、慢性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、原发性胆汁性肝硬变、寻常天皰疮、类天皰疮、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、实验变态反应性神经炎、重症肌无力、交感性眼炎、原发性肾上腺皮质萎缩、梅毒、系统性红斑狼疮、男性自了性不育症、硬皮病等，这些疾病的发生会引起多种临床症状，包括特定靶器官的功能受损，并且伴随着疾病的复发和缓解。此外，还有一些由免疫细胞的活化引起的局部的炎性浸润，如超敏反应、移植物抗宿主反应等。上述这些疾病的共同特点就是由抗原活化的淋巴细胞所引起，是威胁人类健康、导致身体状况不良乃至引起恶性肿瘤的重要原因。

本领域对于免疫细胞介导的自身免疫性疾病的病因尚不清楚。目前的研究认为免疫细胞攻击自身组织或器官引起的自身免疫病主要涉及MHCII分子限制的自身抗原特异性的T细胞诱导的靶器官的功能受损。这些疾病给病人的身心健康及经济带来很大的影响，严重影响生活质量，增加社会负担。因此，寻找有效药物及手段有效治疗及彻底治愈免疫细胞介导的炎症性疾病成为本领域密切关注的问题。

因此，本领域非常有必要找到与免疫细胞介导的炎症相关的新的药物靶点，为免疫细胞介导的炎症性疾病，特别是自身免疫病的治疗提供新的途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种γ-氨基丁酸转运蛋白亚型1(GAT-1)或其激动剂的用途，用于制备抑制哺乳动物炎症性疾病的组合物。

本发明的另一目的在于提供一种筛选可用于抑制炎症性疾病的潜在物质的方法。

在本发明的第一方面，提供一种γ-氨基丁酸转运蛋白亚型1(GAT-1)或其激动剂的用途，用于制备抑制哺乳动物炎症性疾病的组合物。

在另一优选例中，所述的炎症性疾病是免疫细胞介导的炎症性疾病。

在另一优选例中，所述的免疫细胞介导的炎症性疾病选自：多发性硬化、类风湿性关节炎、I型糖尿病、移植物抗宿主反应、超敏反应、结肠炎、克隆氏病、葡萄膜炎、免疫细胞介导肝损伤、多发性肌炎及皮肌炎、桥本甲状腺炎、慢性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、原发性胆汁性肝硬变、寻常天皰疮、类天皰疮、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、实验变态反应性神经炎、重症肌无力、交感性眼炎、原发性肾上腺皮质萎缩、梅毒、系统性红斑狼疮、男性自了性不育症、硬皮病等。

在另一优选例中，所述的组合物用于抑制哺乳动物体内单个核细胞的增殖；或用于降低哺乳动物单个核细胞或脊髓中炎性细胞因子的表达。

在另一优选例中，所述的炎性细胞因子选自：TNF-α、IFN-γ、IL-12、IL-6、IL-17或IL-23。

在另一优选例中，所述的组合物用于提高抗炎症细胞因子IL-5的表达。

在另一优选例中，所述的组合物用于预防或治疗多发性硬化(MS)或其并发症。

在另一优选例中，所述的炎症性疾病是脑脊髓炎。

在另一优选例中，所述的γ-氨基丁酸转运蛋白亚型1的激动剂选自(但不限于)：γ-氨基丁酸、雌激素、蛋白酶C激动剂(包括佛波脂、(-)-Indolactam V等)、磷脂酶抑制剂(包括环胞酶素A、Okadaic Acid等)。

在另一优选例中，所述GAT-1的激动剂是一表达载体，所述表达载体包含一基因盒，所述的基因盒含有编码分泌蛋白GAT-1的基因及与之操作性相连的表达调控序列。

在本发明的第二方面，提供一种筛选可用于抑制炎症性疾病的潜在物质的方法，所述的方法包括：

(1)将候选物质与表达γ-氨基丁酸转运蛋白亚型1的体系接触；

(2)检测候选物质对γ-氨基丁酸转运蛋白亚型1的影响；

若所述候选物质可提高γ-氨基丁酸转运蛋白亚型1的表达、活性或分泌，则表明该候选物质是可用于抑制哺乳动物炎症性疾病的潜在物质。

在另一优选例中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达γ-氨基丁酸转运蛋白亚型1的体系中；和/或

步骤(2)包括：检测测试组的体系中γ-氨基丁酸转运蛋白亚型1的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达γ-氨基丁酸转运蛋白亚型1的体系；

如果测试组中γ-氨基丁酸转运蛋白亚型1的表达、活性或分泌在统计学上高于(优选显著高于，如高20％以上，较佳的高50％以上；更佳的高80％以上)对照组，就表明该候选物质是可用于抑制哺乳动物炎症性疾病的潜在物质。

在另一优选例中，所述的体系选自：细胞体系(或细胞培养物体系)、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

在另一优选例中，所述方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于抑制炎症性疾病有用的组合物。

另一方面，提供一种抑制哺乳动物炎症性疾病的方法，所述方法包括：上调所述哺乳动物免疫细胞或中枢神经系统中γ-氨基丁酸转运蛋白亚型1的表达或活性。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1.EAE诱导后，GAT-1在脊髓中表达情况的变化。其中，

A为通过Real-Time PCR的方法检测GAT-1的表达水平。所示数据代表3次试验的结果。^*p＜0.01。

B为通过Western-blotting的方法检测GAT-1的表达水平。

图2.野生型和GAT-1-/-小鼠诱导EAE后表现出的EAE临床症状比较。所示数据代表4次试验的结果的平均值。

图3.GAT-1-/-EAE小鼠在脊髓部位显示了更为明显的炎性浸润和脱髓鞘(放大倍数：×100)。图中所示数据代表4次试验的结果。

图4.GAT-1-/-EAE小鼠脾脏单个核细胞在抗原MOG35-55的刺激下增殖的更为显著。所示数据代表4次试验的结果。^**p＜0.01。

图5.GAT-1的缺失引起EAE发生过程中细胞因子分泌格局的变化。所示数据代表3次试验的结果。^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次论证了γ-氨基丁酸转运蛋白亚型1(GAT-1)对炎症性疾病有抑制作用，下调GAT-1会明显加重炎症性疾病的症状，可见GAT-1对于抑制炎症性疾病是必要的。因此，GAT-1其本身或其激动剂能够用于抑制炎症性疾病；并且，可基于GAT-1的上述功能，筛选抑制炎症性疾病的物质。

GAT-1及其用途

γ-氨基丁酸(GABA)作为重要的抑制性神经递质，与兴奋型神经递质谷氨酸相互平衡维持中枢神经系统的正常功能。由神经元释放至突触间隙的GABA部分与位于突触后膜的GABA受体结合，而大部分GABA则通过突触前膜的GABA转运体转运至细胞内。GAT-1作为抑制性神经递质的主要转运体之一，最早被科学家们所发现，目前认为其主要表达在嗅球、神经皮质、小脑、上丘、基质核，并且主要分布在突触前膜末端、神经元及胶质细胞，对于维持体内较低浓度的GABA起着重要的作用。

本发明利用GAT-1基因缺失动物，首次在一种模拟多发性硬化(MS)发病机制的动物模型(实验性自身反应性脑脊髓膜炎模型，EAE)中发现，GAT-1基因的缺失使得动物出现更为严重的炎症表现，证实了GAT-1对于EAE有重要的病理生理作用。进一步的研究显示，GAT-1的下调引起多种炎性细胞因子表达的升高(如γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-17(IL-17)、白介素-23(IL-23))以及抗炎症细胞因子表达的降低(如白介素-5(IL-5))，从而加重EAE的发生。

因此，GAT-1是一种新的抑制炎症性疾病，特别是免疫细胞介导的炎症性疾病的分子。所述的免疫细胞介导的炎症性疾病表现为哺乳动物体内单个核细胞对于抗原的增殖反应增强、哺乳动物单个核细胞或病灶部位炎性细胞因子的高表达、哺乳动物抗炎症细胞因子的降低表达等。通过促进GAT-1的表达可以作为治疗免疫细胞介导的炎症性疾病的新的有效的治疗方法。

因此，基于本发明人的新发现，本发明提供了GAT-1蛋白的用途，用于制备抑制免疫细胞介导的炎症性疾病的组合物；或用于筛选抑制免疫细胞介导的炎症性疾病的物质。

在本发明中，所用的GAT-1蛋白可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自哺乳动物。此外，所述的GAT-1蛋白也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组GAT-1蛋白。优选的，本发明可采用重组的GAT-1蛋白。

任何适合的GAT-1蛋白均可用于本发明。所述的GAT-1蛋白包括全长的GAT-1蛋白或其生物活性片段。优选的，所述的GAT-1蛋白的氨基酸序列可以与GenBank登录号：NP_848818所示的序列基本上相同。

经过-个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的GAT-1蛋白的氨基酸序列也包括在本发明中。GAT-1蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等，Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224。

任何一种GAT-1蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，GAT-1蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的GAT-1蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长GAT-1蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长GAT-1蛋白的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

本发明也可采用经修饰或改良的GAT-1蛋白，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的GAT-1蛋白。所述经过修饰或改良的GAT-1蛋白可以是一种GAT-1蛋白的共轭物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述经过修饰或改良的GAT-1蛋白可以是与天然存在的GAT-1蛋白具有较小的共同点，但也能抑制免疫细胞介导的炎症性疾病，且不会带来其它不良影响或毒性。也就是说，任何不影响GAT-1蛋白的生物活性的变化形式都可用于本发明中。

根据GAT-1蛋白的氨基酸序列可以方便地得出其相应的核苷酸编码序列。优选的，所述的GAT-1蛋白的核苷酸序列可以与GenBank登录号：NM_178703所示的序列基本上相同。

GAT-1的激动剂及其用途

基于本发明人的上述新发现，本发明提供了一种GAT-1的激动剂的用途，用于制备抑制炎症性疾病，特别是免疫细胞介导的炎症性疾病的组合物。

如本文所用，所述的GAT-1的激动剂包括了促进剂、上调剂等。任何可提高GAT-1蛋白的活性、维持GAT-1蛋白的稳定性、促进GAT-1蛋白的表达、促进GAT-1蛋白的分泌、延长GAT-1蛋白有效作用时间、或促进GAT-1的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于抑制炎症性疾病的有效物质。

作为本发明的优选方式，所述的GAT-1的激动剂包括(但不限于)：γ-氨基丁酸、雌激素、蛋白酶C激动剂(佛波脂、(-)-Indolactam V等)、磷脂酶抑制剂(环胞酶素A、Okadaic Acid等)。

作为本发明的优选方式，所述的GAT-1蛋白的激动剂包括(但不限于)：在转入细胞后可表达(优选过表达)GAT-1的表达载体或表达构建物。通常，所述表达载体包含一基因盒，所述的基因盒含有编码GAT-1的基因及与之操作性相连的表达调控序列。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。

本发明中，GAT-1多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于本发明。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含GAT-1的DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。转化载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

组合物

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.000001-50wt％；较佳的0.00001-20wt％；更佳的，0.0001-10wt％)的所述的GAT-1蛋白或其激动剂，以及药学上可接受的载体。

本发明的组合物可直接用于抑制炎症性疾病，特别是免疫细胞介导的炎症性疾病。此外，还可同时与其它治疗剂或辅剂联合使用。

通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

如本文所用，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的组合物含有安全有效量的GAT-1蛋白以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。

本发明所述的GAT-1蛋白或其激动剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的GAT-1蛋白或其激动剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的GAT-1蛋白或其激动剂每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

作为本发明的优选方式，所述的激动剂是γ-氨基丁酸，当每天以0.1-500mg/kg动物体重给药时，具有较好的效果；优选地每天以1-200mg/kg动物体重给药；更优选地每天以5-100mg/kg动物体重给药。

作为本发明的优选方式，所述的激动剂是雌激素，当每天以0.1-800μg/kg动物体重给药时，具有较好的效果；优选地每天以0.5-300μg/kg动物体重给药；更优选地每天以1-200μg/kg动物体重给药。

本发明还提供了一种抑制免疫细胞介导的炎症性疾病的方法，包括给予受试者有效量的GAT-1蛋白或其激动剂。当用于抑制免疫细胞介导的炎症性疾病时，优选采用重组的GAT-1蛋白。

本发明的GAT-1蛋白或其激动剂的给药方式没有特别的限制，可以是全身的或局部的。例如，本发明的GAT-1蛋白或其激动剂可通过脊髓鞘内注射、腹腔注射、静脉注射、口服、皮下注射、皮内注射等的方式给予动物，较为优选的是脊髓鞘内注射。

在得知了所述的GAT-1蛋白的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的GAT-1蛋白或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。优选的，可采用基因治疗的手段进行，比如可直接将GAT-1蛋白通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带GAT-1基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的GAT-1蛋白。

作为本发明的一种实施方式，可将所述的GAT-1蛋白直接给药于哺乳动物(比如人)，或者，可将编码GAT-1蛋白的基因通过常规的方法克隆到适当的载体(如常规原核或真核表达载体、或病毒载体如疱疹病毒载体或腺病毒载体)中，将所述的载体导入到可表达所述GAT-1蛋白的细胞中，使所述的细胞表达GAT-1蛋白。可通过将适量的所述细胞引入到哺乳动物身体的适当部位，实现GAT-1蛋白的表达。

GAT-1蛋白的激动剂的给药方式主要取决于所述激动剂的类型和特性，这是本领域人员可以评估的。

筛选抑制炎症性疾病的潜在物质的方法

在得知了所述的GAT-1蛋白在抑制炎症性疾病，特别是免疫细胞介导的炎症性疾病的用途后，可以基于该特征来筛选促进GAT-1的表达或活性的物质。

因此，本发明提供一种筛选可用于抑制炎症性疾病的潜在物质的方法，所述的方法包括：将候选物质与表达GAT-1的体系接触；和检测候选物质对GAT-1的影响；若所述候选物质可提高GAT-1的表达或活性或分泌，则表明该候选物质是可用于抑制炎症性疾病的潜在物质。

在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到GAT-1的表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达GAT-1的体系。

所述的表达GAT-1的体系例如可以是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达GAT-1的细胞；或可以是重组表达GAT-1的细胞。所述的表达GAT-1的体系还可以是(但不限于)亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型)等。

作为本发明的一种优选方式，所述的体系是表达GAT-1的细胞体系。较佳地，表达GAT-1的免疫细胞可来源于以下3种制备方法：

①来源于正常哺乳动物的单个核细胞

取正常哺乳动物单个核细胞(淋巴结、外周血、脾脏)经过，例如(但不限于)anti-CD3和anti-CD28或佛波脂和离子酶素刺激后，该细胞可表达GAT-1蛋白。将该种细胞作为用于筛选抑制免疫细胞介导的炎症性疾病的药物的细胞模型。

②T淋巴细胞系，选自(但不限于)：OVA-特异性T细胞系、MOG-特异性T细胞系、MBP-特异性T细胞系、Jurkat细胞系、YAC-1细胞系、人T淋巴细胞系(H9)、Hut-102等。

取T淋巴细胞系经过抗原或anti-CD3和anti-CD28或佛波脂和离子酶素刺激后，该细胞可表达GAT-1蛋白。将该种细胞作为用于筛选抑制免疫细胞介导的炎症性疾病的药物的细胞模型。

③来源于抗原免疫后或疾病状态的哺乳动物的单个核细胞

取抗原免疫后或疾病状态的哺乳动物的单个核细胞(外周血、淋巴结、脾脏、病灶部位等)经过刺激(抗原、anti-CD3和anti-CD28、佛波脂和离子酶素)活化后，该细胞可表达GAT-1蛋白。将该种细胞作为用于筛选抑制免疫细胞介导的炎症性疾病的药物的细胞模型。

作为本发明的另一种优选方式，所述的体系是动物模型体系。较佳地，可采用具有致病性的抗原或致病性的免疫细胞来制备致病的动物模型。所述的动物包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔等。诱导方法可如下：经抗原免疫主动诱导致病；经被动转移致病性(但不限于)T细胞或B细胞或免疫因子(如抗体等)诱导致病。所述的动物模型也可以是自发性的发病的动物模型。

作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于抑制炎症性疾病真正有用的物质。

本发明对于GAT-1蛋白的表达、活性、存在量或分泌情况的检测方法没有特别的限制。可以采用常规的蛋白定量或半定量检测技术，例如(但不限于)：SDS-PAGE法，Western-Blot法，ELISA等。

另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的可用于抑制炎症性疾病的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于抑制免疫细胞介导的炎症性疾病真正有用的物质，从而用于临床。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明提供了一种全新的免疫细胞介导的炎症性疾病药物靶点，从而提供了一条抑制哺乳动物免疫细胞介导的炎症性疾病的新途径。

(2)可以以GAT-1作为药物筛选靶点，筛选通过促进GAT-1的表达而抑制哺乳动物免疫细胞介导的炎症性疾病的物质。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实验组：1)对照组(野生型)小鼠；

        2)GAT-1基因缺陷小鼠。

评价临床效果的指标：临床评分、脊髓的组织病理染色、脾脏单个核细胞的体外增殖实验、脾脏单个核细胞及脊髓的RNA抽提、RNA逆转及real-timePCR等。

实施例1.EAE小鼠的脊髓中GAT-1的表达下降

实验性自身反应性脑脊髓膜炎模型(EAE)是一种模拟MS发病机制的动物模型，可以通过给动物直接免疫相应的髓鞘蛋白进行主动诱导，也可通过髓鞘抗原特异性的T淋巴细胞的被动转移诱导模型的发生。EAE以进行性瘫痪、脊髓血管周围的炎性浸润以及炎症性细胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-17及IL-23)表达的升高和抗炎症性细胞因子(IL-5)表达的下降为主要特征，因此，EAE已广泛地用于研究MS的发病机制以及作为探讨对于MS治疗方法的有用模型。

C57BL/6小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司)每组四只，分为两组，一组作为对照组(Naive)，不予以任何处理；另一组EAE组，通过给小鼠在第0天皮下免疫MOG35-55(购自吉尔生化有限公司)和CFA(购自Sigma公司)等体积混合的乳化抗原(含MOG35-55300μg，含CFA 500μg)，同时给予尾静脉注射百日咳毒素200ng；第2天再给予小鼠尾静脉注射百日咳毒素200ng，以诱导EAE的发生。在诱导EAE的第18天，EAE组的小鼠达到发病高峰，处死两组小鼠，取出小鼠的脊髓分别抽去RNA和膜蛋白。

通过常规的Real-Time PCR和Western-Blotting的方法检测GAT-1的表达水平，结果见图1。由结果可知，在EAE组小鼠的脊髓中GAT-1的表达显著低于对照组。

实施例2.GAT-1-/-小鼠诱导EAE后表现出更为严重的EAE临床症状

GAT-1-/-小鼠的构建方法参考Cai YQ等，Journal of Neuroscience Research，2006，84：255-67。

对照组(野生型)和实验组(GAT-1-/-)，每组4-5只小鼠，通过给小鼠在第0天皮下免疫MOG35-55和CFA等体积混合的乳化抗原(含MOG35-55300μg，含CFA 500μg)，同时给予尾静脉注射百日咳毒素200ng；第2天再给予小鼠尾静脉注射百日咳毒素200ng，以诱导EAE的发生。

临床评分标准如下：

0分：没有异常表现；

1分：尾巴瘫痪；

2分：后肢受影响，无力，跛行；

3分：双后肢完全瘫痪；

4分：后肢瘫痪同时前肢受影响；

5分：死亡。

结果如图2所示，与野生型(WT)小鼠相比，GAT-1-/-小鼠表现出更为严重的EAE临床症状。

实施例3.GAT-1-/-小鼠诱导EAE后脊髓部位显示更为明显的炎性浸润和脱髓鞘

对照组(野生型)和实验组(GAT-1-/-)，每组4-5只小鼠，按照实施例2所述的方式诱导EAE的发生，在免疫后的第34天，处死小鼠，取出小鼠的脊髓，用4％多聚甲醛进行固定。对脊髓的组织切片进行Fast Blue染色，通过光学显微镜对其进行检查。

结果见图3。可以看到GAT-1-/-小鼠的脊髓显示了更为严重的炎性浸润和脱髓鞘。

实施例4.GAT-1-/-EAE小鼠脾脏诱导EAE后单个核细胞增殖更显著

对照组(野生型)和实验组(GAT-1-/-)，每组4-5只小鼠，按照实施例2所述的方式诱导EAE的发生，在免疫后的第18天，处死小鼠，取出脾脏，常规方法获得单个核细胞。在96孔平底板中加入200μl的脾脏单细胞悬液(2.5×10⁶/ml)，以20μg/ml的MOG35-55刺激72小时，在停止试验前16小时加³H。抽膜后，通过β-液闪计数仪测量掺入³H的细胞数。

细胞计数结果如图4所示，可见GAT-1-/-EAE小鼠脾脏单个核细胞在抗原MOG35-55的刺激下增殖得更为显著。上述结果说明，GAT-1的缺失引起致病性淋巴细胞的大量增殖，从而引起EAE疾病进展的加剧。

实施例5.GAT-1的缺失对于细胞因子的影响

对照组(野生型)和实验组(GAT-1-/-)，每组4-5只小鼠，按照实施例2所述的方式诱导EAE的发生，在免疫后的第18天，处死小鼠，常规方法获得单个核细胞及脊髓。

分别抽取单个核细胞的RNA和脊髓的RNA，通过常规的Real-Time PCR方法检测脾脏单个核细胞中TNF-α、IFN-γ、IL-12、IL-6、IL-17、IL-23及IL-5RNA的表达情况分别如(A)、(C)、(E)、(G)、(I)、(K)、(M)所示；通过Real-TimePCR的方法检测脊髓中TNF-α、IFN-γ、IL-12、IL-6、IL-17、IL-23及IL-5RNA的表达情况分别如(B)、(D)、(F)、(H)、(J)、(L)、(N)所示。

由结果可知，GAT-1-1-小鼠的单个核细胞和脊髓中细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-12、IL-6、IL-17、IL-23的表达量均显著高于野生型对照；而在脊髓中IL-5的表达量反而低于野生型对照。

实施例6.GAT-1激动剂(γ-氨基丁酸)对于EAE的保护作用

1.临床表现

对照组(不给予GAT-1激动剂γ-氨基丁酸)和实验组(给予GAT-1激动剂γ-氨基丁酸)，每组4-5只小鼠，通过给小鼠在第0天皮下免疫MOG35-55和CFA等体积混合的乳化抗原(含MOG35-55300μg，含CFA 500μg)，同时给予尾静脉注射百日咳毒素200ng；第2天再给予小鼠尾静脉注射百日咳毒素200ng，以诱导EAE的发生。在诱导EAE之前或同时给予小鼠皮下植入γ-氨基丁酸的缓释片，使其每天释放一定剂量的γ-氨基丁酸，直至实验结束，在此期间，每天对小鼠进行临床评分。每天释放的γ-氨基丁酸剂量设为25mg/kg，50mg/kg。

临床评分标准如下：

0分：没有异常表现；

1分：尾巴瘫痪；

2分：后肢受影响，无力，跛行；

3分：双后肢完全瘫痪；

4分：后肢瘫痪同时前肢受影响；

5分：死亡。

根据观察发现，与对照组小鼠相比，给予γ-氨基丁酸的小鼠EAE发病明显减轻。

2.给予GAT-1激动剂γ-氨基丁酸的小鼠诱导EAE后脊髓部位的炎性浸润和脱髓鞘明显减轻

对照组(不给予GAT-1激动剂γ-氨基丁酸)和实验组(给予GAT-1激动剂γ-氨基丁酸)，每组4-5只小鼠，按照实施例6.1所述的方式诱导EAE的发生并给予γ-氨基丁酸处理。在免疫后的第30-34天，处死小鼠，取出小鼠的脊髓，用4％多聚甲醛进行固定。对脊髓的组织切片进行Fast Blue染色，通过光学显微镜对其进行检查。

根据观察可以看到γ-氨基丁酸给予的小鼠脊髓的炎性浸润和脱髓鞘，明显减少。

3.给予GAT-1激动剂γ-氨基丁酸的小鼠诱导EAE后单个核细胞增殖显著下降

对照组(不给予GAT-1激动剂γ-氨基丁酸)和实验组(给予GAT-1激动剂γ-氨基丁酸)，每组4-5只小鼠，按照实施例6.1所述的方式诱导EAE并给予γ-氨基丁酸处理。在免疫后的第15-20天，处死小鼠，取出脾脏，常规方法获得单个核细胞。在96孔平底板中加入200μl的脾脏单细胞悬液(2.5×10⁶/ml)，以20μg/ml的MOG35-55刺激72小时，在停止试验前16小时加³H。抽膜后，通过β-液闪计数仪测量掺入³H的细胞数。

根据观察可见，给予γ-氨基丁酸的小鼠诱导EAE后脾脏单个核细胞在抗原MOG35-55的刺激下增殖显著下降，说明GAT-1激动剂可以抑制致病性淋巴细胞的增殖，从而减轻EAE的发生。

实施例7.GAT-1激动剂(γ-氨基丁酸)对于EAE的治疗作用

1.临床表现

对照组(不给予GAT-1激动剂γ-氨基丁酸)和实验组(给予GAT-1激动剂γ-氨基丁酸)，每组4-5只小鼠，通过给小鼠在第0天皮下免疫MOG35-55和CFA等体积混合的乳化抗原(含MOG35-55300μg，含CFA 500μg)，同时给予尾静脉注射百日咳毒素200ng；第2天再给予小鼠尾静脉注射百日咳毒素200ng，以诱导EAE的发生。在EAE开始发病时给予小鼠皮下植入γ-氨基丁酸的缓释片，使其每天释放一定剂量的γ-氨基丁酸，直至实验结束，在此期间，每天对小鼠进行临床评分。每天释放的γ-氨基丁酸剂量设为25mg/kg/天，50mg/kg/天。

临床评分标准如下：

0分：没有异常表现；

1分：尾巴瘫痪；

2分：后肢受影响，无力，跛行；

3分：双后肢完全瘫痪；

4分：后肢瘫痪同时前肢受影响；

5分：死亡。

根据观察发现，与对照组小鼠相比，给予γ-氨基丁酸的小鼠EAE发病得到明显抑制。

2.给予GAT-1激动剂γ-氨基丁酸的小鼠诱导EAE后脊髓部位的炎性浸润和脱髓鞘明显减轻

对照组(不给予GAT-1激动剂γ-氨基丁酸)和实验组(给予GAT-1激动剂γ-氨基丁酸)，每组4-5只小鼠，按照实施例7.1所述的方式诱导EAE并给予激动剂处理。在免疫后的第30-34天，处死小鼠，取出小鼠的脊髓，用4％多聚甲醛进行固定。对脊髓的组织切片进行Fast Blue染色，通过光学显微镜对其进行检查。

根据观察可以看到γ-氨基丁酸给予的小鼠脊髓的炎性浸润和脱髓鞘，明显减少，说明GAT-1激动剂的给予可以有效治疗EAE。

3.给予GAT-1激动剂γ-氨基丁酸的小鼠诱导EAE后单个核细胞增殖显著下降

对照组(不给予GAT-1激动剂γ-氨基丁酸)和实验组(给予GAT-1激动剂γ-氨基丁酸)，每组4-5只小鼠，按照实施例7.1所述的方式诱导EAE并给予激动剂处理。在EAE诱导后的第15-20天，处死小鼠，取出脾脏，常规方法获得单个核细胞。在96孔平底板中加入200μl的脾脏单细胞悬液(2.5×10⁶/ml)，以20μg/ml的MOG35-55刺激72小时，在停止试验前16小时加³H。抽膜后，通过β-液闪计数仪测量掺入³H的细胞数。

根据观察可见，给予GAT-1激动剂γ-氨基丁酸的小鼠诱导EAE后脾脏单个核细胞在抗原MOG35-55的刺激下增殖显著下降，说明GAT-1激动剂可以抑制致病性淋巴细胞的增殖，从而减轻EAE的发生。

实施例8.GAT-1激动剂(雌激素)对于EAE的保护作用

1.临床表现

对照组(不给予雌激素)和实验组(给予雌激素)，每组4-5只小鼠，通过给小鼠在第0天皮下免疫MOG35-55和CFA等体积混合的乳化抗原(含MOG35-55300μg，含CFA 500μg)，同时给予尾静脉注射百日咳毒素200ng；第2天再给予小鼠尾静脉注射百日咳毒素200ng，以诱导EAE的发生。在诱导EAE之前或同时给予小鼠皮下植入雌激素的40天缓释片，使其每天释放一定剂量的雌激素，直至实验结束，在此期间，每天对小鼠进行临床评分。释放的雌激素2剂量设为10μg/kg/天，50μg/kg/天。

临床评分标准如下：

0分：没有异常表现；

1分：尾巴瘫痪；

2分：后肢受影响，无力，跛行；

3分：双后肢完全瘫痪；

4分：后肢瘫痪同时前肢受影响；

5分：死亡。

根据观察发现，与对照组小鼠相比，给予雌激素的小鼠EAE发病明显减轻。

2.给予雌激素的小鼠诱导EAE后脊髓部位的炎性浸润和脱髓鞘明显减轻

对照组(不给予雌激素)和实验组(给予雌激素)，每组4-5只小鼠，按照实施例8.1所述的方式诱导EAE的发生并给予雌激素处理。在免疫后的第30-34天，处死小鼠，取出小鼠的脊髓，用4％多聚甲醛进行固定。对脊髓的组织切片进行Fast Blue染色，通过光学显微镜对其进行检查。

根据观察可以看到雌激素给予的小鼠脊髓的炎性浸润和脱髓鞘，明显减少。

3.给予雌激素的小鼠诱导EAE后单个核细胞增殖显著下降

对照组(不给予雌激素)和实验组(给予雌激素)，每组4-5只小鼠，按照实施例8.1所述的方式诱导EAE并给予雌激素处理。在免疫后的第15-20天，处死小鼠，取出脾脏，常规方法获得单个核细胞。在96孔平底板中加入200μl的脾脏单细胞悬液(2.5×10⁶/ml)，以20μg/ml的MOG35-55刺激72小时，在停止试验前16小时加³H。抽膜后，通过β-液闪计数仪测量掺入³H的细胞数。

根据观察可见给予雌激素的小鼠诱导EAE后脾脏单个核细胞在抗原MOG35-55的刺激下增殖显著下降，说明雌激素可以抑制致病性淋巴细胞的增殖，从而减轻EAE的发生。

实施例9.GAT-1激动剂(雌激素)对于EAE的治疗作用

1.临床表现

对照组(不给予雌激素)和实验组(给予雌激素)，每组4-5只小鼠，通过给小鼠在第0天皮下免疫MOG35-55和CFA等体积混合的乳化抗原(含MOG35-55300μg，含CFA 500μg)，同时给予尾静脉注射百日咳毒素200ng；第2天再给予小鼠尾静脉注射百日咳毒素200ng，以诱导EAE的发生。在EAE开始发病时给予小鼠皮下植入雌激素2的30天缓释片，使其每天释放一定剂量的雌激素，直至实验结束，在此期间，每天对小鼠进行临床评分。释放的雌激素剂量设为10μg/kg/天，50μg/kg/天，100μg/kg/天。

临床评分标准如下：

0分：没有异常表现；

1分：尾巴瘫痪；

2分：后肢受影响，无力，跛行；

3分：双后肢完全瘫痪；

4分：后肢瘫痪同时前肢受影响；

5分：死亡。

根据观察发现，与对照组小鼠相比，给予雌激素的小鼠EAE发病得到明显抑制。

2.给予雌激素的小鼠诱导EAE后脊髓部位的炎性浸润和脱髓鞘明显减轻

对照组(不给予雌激素)和实验组(给予雌激素)，每组4-5只小鼠，按照实施例9.1所述的方式诱导EAE并给予激动剂处理。在免疫后的第30-34天，处死小鼠，取出小鼠的脊髓，用4％多聚甲醛进行固定。对脊髓的组织切片进行Fast Blue染色，通过光学显微镜对其进行检查。

根据观察可以看到雌激素给予的小鼠脊髓的炎性浸润和脱髓鞘，明显减少，说明雌激素的给予可以有效治疗EAE。

3.给予雌激素的小鼠诱导EAE后单个核细胞增殖显著下降

对照组(不给予雌激素)和实验组(给予雌激素)，每组4-5只小鼠，按照实施例9.1所述的方式诱导EAE并给予激动剂处理。在EAE诱导后的第15-20天，处死小鼠，取出脾脏，常规方法获得单个核细胞。在96孔平底板中加入200μl的脾脏单细胞悬液(2.5×10⁶/ml)，以20μg/ml的MOG35-55刺激72小时，在停止试验前16小时加³H。抽膜后，通过β-液闪计数仪测量掺入³H的细胞数。

根据观察可见给予雌激素的小鼠诱导EAE后脾脏单个核细胞在抗原MOG35-55的刺激下增殖显著下降，说明雌激素可以抑制致病性淋巴细胞的增殖，从而减轻EAE的发生。

实施例10.药物筛选

1.细胞水平筛选

第一步：表达GAT-1免疫细胞的制备。表达GAT-1的免疫细胞通过以下方法制备：常规方法获取小鼠淋巴结的单个核细胞，用20ng/ml浓度的佛波脂和0.5μmol/l浓度的离子酶素刺激2-12小时后，经Real time PCR或Western blot检测该细胞可表达GAT-1蛋白。将该种细胞作为用于筛选抑制免疫细胞介导的炎症性疾病的药物的细胞模型。

第二步：药物筛选：

测试组：用候选物质处理的上述细胞的培养物；

对照组：不用候选物质处理的上述细胞的培养物。

在处理后适当时间，采用常规方法测定所述细胞的GAT-1蛋白的表达、活性、存在量或分泌情况。如果与对照组相比，测试组中的GAT-1蛋白的表达、活性、存在量或分泌显著上升30％以上，则说明该候选物质是潜在的抑制免疫细胞介导的炎症性疾病的物质。

2.动物水平筛选-被动免疫诱导的炎症性疾病

用具有致病性的免疫细胞作为细胞抗原免疫小鼠，诱导小鼠发生免疫性炎症。

测试组：用候选物质给予(通过腹腔注射、口服、静脉注射、皮下注射或皮内注射等方式)哺乳动物；

对照组：不用候选物质给予哺乳动物。

在处理后适当时间，采用常规方法测定哺乳动物体内(包括炎性浸润的病灶部位，或淋巴结、脾脏、外周血单个核细胞)GAT-1蛋白的表达、活性、存在量或分泌情况。如果与对照组相比，测试组中的GAT-1蛋白的表达、活性、存在量或分泌显著上升30％以上，则说明该候选物质是潜在的抑制免疫细胞介导的炎症性疾病的物质。

3.动物水平筛选-主动免疫诱导的炎症性疾病

经抗原免疫小鼠主动诱导的免疫性炎症。

测试组：用候选物质给予(通过腹腔注射、口服、静脉注射、皮下注射或皮内注射等方式)哺乳动物；

对照组：不用候选物质给予哺乳动物。

在处理后适当时间，采用常规方法测定哺乳动物体内(包括炎性浸润的病灶部位，或淋巴结、脾脏、外周血单个核细胞)GAT-1蛋白的表达、活性、存在量或分泌情况。如果与对照组相比，测试组中的GAT-1蛋白的表达、活性、存在量或分泌显著上升30％以上，则说明该候选物质是潜在的抑制免疫细胞介导的炎症性疾病的物质。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。