一种糖皮质激素接枝的基因给药载体的制备方法

摘要

本发明提供一种糖皮质激素接枝的聚阳离子修饰脂质体的基因给药载体的制备方法，是利用糖皮质激素接枝聚阳离子上糖皮质激素的疏水性，与脂质体结合。糖皮质激素接枝聚阳离子修饰的脂质体由糖皮质激素接枝聚阳离子、中性磷脂、胆固醇、蒸馏水组成，用逆向蒸发法制备。本发明的优点在于：将糖皮质激素接枝聚阳离子与脂质体结合，可以提高脂质体的转染效率，又可以增加聚合物的生物相容性，降低毒性，还可以通过对脂质体进行靶向修饰，提高载体的靶向性传递。本发明方法设计合理，制备工艺简单，具有很好的体内应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种给药载体的制备方法，尤其涉及一种用糖皮质激素接枝的聚阳离子修饰脂质体的基因给药载体的制备方法。

背景技术

随着分子生物学的发展，特别是人类基因库的建立和人类疾病相关基因的阐明，疾病的基因治疗应运而生，并已发展为当代医学和生物学的一个新的研究领域，被认为是治疗遗传性先天疾病、恶性肿瘤、传染病等最有希望的治疗方案之一。

目前的转染载体基本上可分为两类：病毒载体与非病毒载体。非病毒基因载体能够克服病毒基因载体的许多内在问题，诸如无免疫原性、无遗传毒性、细胞毒性低、成本低等等，是治疗基因体内给药不可替代的传递系统，具有重要的临床实用潜力。但是，相比于病毒载体，非病毒载体的转染效率低，限制了其实际应用。

阳离子脂质体和阳离子聚合物是目前应用最广泛的非病毒基因载体。脂质体是由脂质双层构成的内部为水相的闭合囊泡，作为基因载体主要是利用脂质体能够促进极性大分子穿透细胞膜的原理。阳离子脂质体的生物相容性好，制备简单，但稳定性差，具有一定的细胞毒性。聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI)是一种阳离子聚合物，PEI的单体为-CH₂-CH₂-NH-，结构骨架中每三个原子中含一个氨基，具有很高的正电荷密度，具有较强的DNA结合能力和细胞吸附能力。PEI具有强大的缓冲能力，即“质子海绵”效应。PEI的分子量范围很宽，其分子量对其转染效果和细胞毒性影响很大。分子量越高，PEI表面的电荷密度越大，转染效率越高，毒性越大。低分子量PEI的毒性较低，其转染效率也较低。PEI进入细胞后不会进入细胞核。糖皮质激素是一种强疏水性的类固醇激素，能与细胞中的糖皮质激素受体(GR)结合，形成激素-受体复合物，瞬间转移入细胞核，因此可以选择糖皮质激素作为NLS，提高基因载体的转染效率。将糖皮质激素与小分子量PEI连接，得到糖皮质激素接枝的聚阳离子，是一种转染效率高，细胞毒性较低的基因载体材料，但由于聚阳离子在体内不可降解，其生物相容性较低。利用糖皮质激素接枝的聚阳离子上的疏水性糖皮质激素，与脂质体结合，以提高聚合物的生物相容性，又提高脂质体的转染效率。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种糖皮质激素接枝的基因给药载体的制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种糖皮质激素接枝的基因给药载体的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)按摩尔比36∶9～36∶4～84称取磷脂、胆固醇和糖皮质激素接枝聚乙烯亚胺；

(2)将磷脂和胆固醇溶于氯仿中，糖皮质激素接枝聚乙烯亚胺溶于体积为氯仿体积1/3的蒸馏水后，加入上述氯仿中，旋涡振荡或超声10～30分钟，形成乳剂；

(3)在旋转蒸发仪上减压蒸发，除去氯仿，得到脂质体混悬液；

(4)脂质体混悬液经过超声和挤压过膜，即得用糖皮质激素接枝的聚阳离子修饰脂质体的基因给药载体。

进一步地，所述糖皮质激素接枝聚乙烯亚胺为曲安奈德接枝聚乙烯亚胺。

本发明的有益效果是：本发明糖皮质激素接枝聚阳离子带正电，可以有效压缩DNA，糖皮质激素具有细胞核定位信号的作用，可以提高低分子量聚阳离子的基因转染效率；脂质体具有与细胞膜类似的磷脂双层结构，因此具有一定的细胞亲和性和组织相容性；将糖皮质激素接枝聚阳离子与脂质体结合，可以提高脂质体的转染效率，又可以增加聚合物的生物相容性，降低毒性，还可以通过对脂质体进行靶向修饰，提高载体的靶向性传递。本发明方法设计合理，制备工艺简单，具有很好的体内应用前景。

附图说明

图1是曲安奈德修饰聚乙烯亚胺的合成路线图；

图2是曲安奈德21位甲磺酸酯的¹H-NMR图谱；

图3是曲安奈德-聚乙烯亚胺的¹H-NMR图谱；

图4是糖皮质激素接枝聚阳离子修饰的脂质体的形态观察图；

图5是糖皮质激素接枝聚阳离子修饰的脂质体的细胞毒性图；

图6是糖皮质激素接枝聚阳离子修饰的脂质体的细胞转染效率测定图。

具体实施方式

本发明利用糖皮质激素接枝聚阳离子上糖皮质激素的疏水性，与脂质体结合，制备糖皮质激素接枝聚阳离子修饰的脂质体。本发明糖皮质激素接枝的基因给药载体的制备方法具体为：按摩尔比36∶9～36∶4～84称取磷脂、胆固醇和糖皮质激素接枝聚乙烯亚胺，将磷脂和胆固醇溶于氯仿中，糖皮质激素接枝聚乙烯亚胺溶于体积为氯仿体积1/3的蒸馏水后，加入上述氯仿中，旋涡振荡或超声10～30分钟，形成乳剂，在旋转蒸发仪上减压蒸发，除去氯仿，得到脂质体混悬液。脂质体混悬液经过超声和挤压过膜，即得用糖皮质激素接枝的聚阳离子修饰脂质体的基因给药载体。

本发明所涉及的糖皮质激素为具有21位羟基的糖皮质激素，包括但不限于曲安奈德。

曲安奈德接枝聚乙烯亚胺(TA-PEI)的合成通过以下步骤实现：

1.将曲安奈德上的C-21羟基用甲磺酰氯酯化，合成曲安奈德21位甲磺酸酯。

取C-21羟基的曲安奈德用无水吡啶溶解，溶液于0℃，N₂保护，搅拌下，慢慢滴加过量的甲磺酰氯，反应于0℃进行5h，反应溶液加入0℃的过量的纯水终止反应，抽滤，冰水洗涤，真空干燥，得到白色固体，即曲安奈德21位甲磺酸酯。

2.曲安奈德21位甲磺酸酯与低分子量PEI用Traut’s试剂连接合成目标产物。

将曲安奈德21位甲磺酸酯和Traut’s试剂溶于无水DMSO中，将低分子量PEI 1800溶于无水DMSO中，在N₂保护下滴加入前者溶液中，边加边搅拌。反应室温下进行4h，然后加入过量的冰的乙酸乙酯，过滤得到淡黄色沉淀，加入适量纯水溶解，0.45μm微孔滤膜过滤，纯水透析(截留分子量1000)48小时。冷冻干燥得淡黄色固体，即为目标产物。

聚阳离子的种类繁多，其他种类的聚阳离子也适用于本发明的脂质体修饰

下面根据实施例详细描述本发明，本发明的目的和效果将变得更加明显。

实施例1：

取磷脂10mg、胆固醇0～4.83mg溶于15mL氯仿中，取糖皮质激素接枝聚阳离子3.2～67.45mg溶于相对于氯仿1/3体积的蒸馏水(5mL)中，用逆向蒸发法制备脂质体。具体为：将水相加入有机相中，旋涡振荡或超声10～30分钟，形成乳剂，在旋转蒸发仪上减压除去氯仿，得到脂质体混悬液。脂质体溶液经过水浴超声5～20min，挤压过膜，孔径为0.1～0.22μm，既得。

实施例2：

取曲安奈德217.25mg用无水吡啶溶解，溶液于0℃，N₂保护，搅拌下，慢慢滴加过量的甲磺酰氯78μL，反应于0℃进行5h，反应溶液加入0℃的过量的冰水(约80mL)终止反应，抽滤，冰水洗涤，真空干燥，得到白色固体，为曲安奈德21位甲磺酸酯。

将4倍过量的曲安奈德21位甲磺酸酯133.9mg和Traut’s试剂34.4mg溶于无水DMSO 2mL中，将低分子量PEI 1800 112.5mg溶于无水DMSO 2mL中，在N₂保护下滴加入前者溶液中，边加边搅拌。反应室温下进行4h，然后加入过量的冰的乙酸乙酯80mL，过滤得到淡黄色沉淀，加入适量纯水溶解，0.45μm微孔滤膜过滤，纯水透析(截留分子量1000)48h。冷冻干燥得淡黄色固体，即为曲安奈德-聚乙烯亚胺。合成反应方程式参见附图1。

实施例3：曲安奈德21位甲磺酸酯和曲安奈德-聚乙烯亚胺(TA-PEI)的核磁共振表征

将适量曲安奈德21位甲磺酸酯溶于氘代DMSO中，进行500MHz 1H-NMR扫描。将适量TA-PEI溶于氘水中，进行500MHz 1H-NMR扫描。曲安奈德21位甲磺酸酯的核磁图参见附图2。曲安奈德-聚乙烯亚胺的核磁图参见附图3。

实施例4：本发明的测定试验如下：

1.糖皮质激素接枝聚阳离子修饰的脂质体的形态观察

取适量糖皮质激素接枝聚阳离子修饰的脂质体加适量的双蒸水稀释后，加至专用铜网上，2％磷钨酸染色0.5～2min，透射电子显微镜下观察粒子的大小和形态，结果见附图4。

2.糖皮质激素接枝聚阳离子修饰的脂质体的粒径与电位

取适量糖皮质激素接枝聚阳离子修饰的脂质体加适量的双蒸水稀释至适当浓度，按不同质量比与pDNA混合，室温下孵育30min，动态光散射粒径电位测定仪测定修饰后脂质体的粒径分布与电位，结果见表1。

表1曲安奈德-聚乙烯亚胺修饰脂质体及与pDNA复合物的粒径与电位(n＝3)

3.糖皮质激素接枝聚阳离子修饰的脂质体的细胞毒性

HepG 2细胞(1×10⁴/孔)接种于96孔培养板，过夜培养至细胞贴壁，汇合度为60～80％。取适量糖皮质激素接枝聚阳离子修饰的脂质体加适量的双蒸水稀释至适当浓度，按不同质量比与pDNA混合，室温下孵育30min，形成复合物。以糖皮质激素接枝聚阳离子/DNA复合物为对照。细胞用PBS洗涤后加入无血清培养基，加入不同质量比的复合物、PEI 1800(质量比＝5.3∶1)、PEI 25K(质量比＝1.33∶1)，每孔DNA的质量固定为0.2μg，每孔总体积为100μL/孔，空白对照组加100μL无血清培养基。培养箱中培养4h之后移去培养基，加入180μL无血清培养基和20μL MTT(5mg/mL)溶液，继续培养4h后，加入100μLDMSO每孔，振摇10min，酶标仪上，于570nm测定A值。按以下公式计算细胞生存率。

细胞生存率(％)＝(A_样品/A_空白)×100％

结果表明在不同的质量比时，糖皮质激素接枝聚阳离子修饰脂质体的细胞毒性均小于糖皮质激素接枝聚阳离子，结果参见附图5。

4.糖皮质激素接枝聚阳离子修饰脂质体的细胞转染效率测定

pGL-3转染细胞：

HepG 2细胞(1×10⁵/孔)接种于24孔培养板，过夜培养至细胞贴壁，汇合度为60～80％。取适量糖皮质激素接枝聚阳离子修饰的脂质体与糖皮质激素接枝聚阳离子加适量的双蒸水稀释至适当浓度，与pDNA按质量比3∶1混合，室温下孵育30min，形成复合物。细胞用PBS洗涤后加入无血清培养基或含10％血清培养基，加入不同质量比的复合物、PEI 1800(质量比＝5.3∶1)、PEI 25K(质量比＝1.33∶1)，每孔DNA的质量固定为2μg，每孔总体积为500μL/孔。放入37℃ CO₂培养箱培养6小时，吸去转染液，每孔加入500μL含10％小牛血清的培养基，继续培养48h。吸去培养基，PBS洗一次，每孔加入500μL细胞裂解液，裂解30min，转移至EP管中，12000rpm，4℃离心5min。取100μL上清液，加入100μL Luciferase(Promega)测定相对光单位.其蛋白含量用BCA蛋白检测试剂盒检测.以相对光单位/蛋白含量作为转染效率的评价指标，结果见附图6.结果表明糖皮质激素接枝聚阳离子修饰的脂质体在有血清时转染效率大于糖皮质激素接枝聚阳离子，表明其生物相容性更好.

*表示P＜0.05，存在显著性差异。

上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。