检测乙肝病毒复制能力和抗病毒药物敏感性的方法

摘要

本发明所要解决的技术问题是克服现有乙型肝炎病毒复制能力和抗病毒药物敏感性步骤烦琐，结果不够准确的缺陷。解决该问题的技术方案是提供一种1.3拷贝的HBV基因组的引物组，包括扩增制备HBV2.4片段的引物对和扩增HBV1.7片段的引物对。同时还提供了包含上述引物组的试剂盒以及一种检测乙型肝炎病毒复制能力和抗病毒药物敏感性的方法。本发明方法利用HBV基因组序列的自身结构特点，创造性地采用了两步扩增法扩增得到1.3拷贝的HBV基因组，过程简便，周期短，费用低，很好的克服了现有技术的缺陷，有好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及检测乙肝病毒复制能力和抗病毒药物敏感性的方法。

背景技术

乙型病毒性肝炎(Viral hepatitis B)是目前危害我国人民身体健康最为严重的感染性疾病。据调查，我国慢性乙肝病毒感染者多达1.2亿以上，其中慢性乙肝患者达2000万以上。部分携带者及慢性肝炎患者中可发展为重症肝炎、肝硬化甚至肝癌，每年死于肝炎及其相关性疾病的患者不下30万例。乙肝病毒感染至今尚无特效治疗方法。由于HBV的宿主范围狭窄，有明显嗜肝性，体外培养困难，极大限制了HBV感染相关的分子机制研究和抗病毒药物的疗效评价。因此，迫切需要建立一种检测乙肝病毒复制能力和抗病毒药物敏感性的方法。

随着现代分子生物学技术的发展，多种有关HBV复制的细胞模型及动物模型相继建立，为HBV的研究和抗HBV药物评价提供了十分有用的工具。主要包括天然HBV颗粒感染的成人肝细胞和胎肝细胞模型、HBV基因组稳定转染的肝癌细胞模型、HBV转基因动物模型、嵌合体小鼠模型、HBV感染树鼩模型等。但上述模型还存在诸多不足，如HBV存在时间短暂或制备周期长、费用高昂等问题。

近年来，采用复制型HBV基因组检测乙肝病毒复制能力和抗病毒药物敏感性成为研究的热点，并显示出广阔的应用前景，其优越性在于：(1)所用HBV病毒基因组结构具有单一性和可操控性，并能产生全部HBV mRNA转录(3.5Kb、2.4Kb/2.1Kb、0.7Kb)、HBV DNA复制中间体和包括HBsAg/HBeAg在内的HBV抗原蛋白的表达，较好地模拟HBV在HBV感染者体内的复制过程，有望用于特定HBV病毒株感染的分子机制研究以及抗病毒药物的疗效评价。(2)研制周期短，费用低，且可以对HBV基因组进行体外定点诱变，就临床研究中发现的可疑位点进行潜在耐药性评估。(3)Tang和Priscilla等采用HBV基因组建立的复制HBV型小鼠模型，血清病毒学、生化学改变与HBV感染人的自然感染过程极为相似；Klein等应用该模型评价核苷类似物和siRNA对HBV复制的抑制作用。(4)HBV基因组可通过质粒载体导入细胞内，也可利用重组腺病毒载体制备携带HBV基因组的腺病毒。后者可高效率感染跨种属细胞，如小鼠、大鼠、树鼩肝细胞、鸭肝细胞等；HBV复制水平和产量可通过调节HBV重组腺病毒的感染数量进行控制，便于选择合适的HBV复制水平进行药效试验；还可用来研究不同种属和器官源的细胞支持HBV复制的能力，为研究HBV感染种属和器官特异性提供有力的工具。

国内外有关HBV复制能力的检测方法主要集中在以下方面：

1.HBV基因片段的选择

HBV基因组全长3.2kb，分别调控3.5kb，2.4kb，2.1kb，0.7kb长度的HBV mRNA的转录，并编码合成HBcAg、HBeAg、DNA多聚酶、HBsAg及HBx蛋白.HBV全基因组、S基因组、X基因组的HBV转基因小鼠目前均有报道.Chisari等率先建立能表达HBsAg的HBV转基因小鼠模型，肝细胞呈现“毛玻璃样”改变，最终结节再生；Wirth等用HBV调节成分或小鼠白蛋白启动子控制的HBV S编码区序列产生了HBs转基因小鼠模型，所有肝细胞均表达HBsAg并分泌至血液循环。Guidotti等用含小鼠主要尿蛋白启动子控制的C基因编码区及SV40多聚腺苷酸尾的质粒，显微注射C57BL/XSJL胚胎后产生Mup-Core50系小鼠，通过与亲代C57BL/6逆代杂交而繁殖，MC50鼠在小鼠主要尿蛋白启动子转录控制下表达HBV核心蛋白，出生时肝内存在少量的核心蛋白，随时间延长逐渐增多。屠亚军等建立了人HBx基因转基因小鼠模型，所用HBV(adr)1.15kb DNA片段(病毒基因第707～1856位核苷酸)含完整的HBx基因编码区、转录增强子、主要RNA起始位点及多聚腺苷酸位点，结果小鼠肝、肾、睾丸组织内检出高水平0.7kb转录物，免疫沉淀法证实HBx蛋白的存在；小鼠4月龄时出现肝细胞癌前病变，8～10月龄时出现肝内肿瘤结节；针对X基因起始区的反义核酸药物可有效地抑制HBx转基因小鼠肝脏HBx基因的表达。但上述HBV部分片段转基因小鼠模型仅表达单一基因产物，不能产生病毒，因此不适宜研究病毒复制机制及抗病毒药物疗效的评价。

现有资料表明，HBV基因组通过逆转录机制和基因组循环利用的方式，产生3.5kb前基因组RNA(pregenomic RNA)作为病毒逆转录复制的模板(即前基因组RNA)。在病毒复制过程中，HBV多聚酶结合于3.5kb mRNA5’末端的∑茎-环结构，形成RNA/多聚酶复合物，并被核心抗原多肽二聚体包裹成未成熟的核壳体。在核壳体内的HBV DNA多聚酶催化下，以3.5kbmRNA为模板，逆转录合成负链HBV DNA，然后再以负链DNA为模板合成正链HBV DNA。通过将大于HBV基因组全长的HBV DNA片段导入小鼠受精卵，能够建立复制型HBV转基因小鼠。目前已导入的基因分别为HBV基因组的1.1、1.2、1.3、2.0个拷贝。研究显示HBV基因组后连接有HBc和HBx基因的HBV1.3拷贝基因组转基因小鼠体内的病毒复制水平最高，是HBV1.1、HBV1.2及HBV2.0的10～100倍，与HBV慢性感染者体内的病毒水平相近，能够检测到血清HBsAg和HBeAg，且可包装成新的病毒颗粒。利用该转基因小鼠的研究发现干扰素可激活宿主多个相关基因，也可通过诱生干扰素调节因子-1(IRF-1)和双链RNA激活的蛋白激酶(PKR)发挥抗病毒作用。该模型是目前HBV相关肝病发病机制和抗病毒药物作用机制研究中应用最广泛的模型之一。

2.载体的选择和构建方法

HBV基因组的载体常采用质粒或病毒载体。因HBV复制模型需要排除外界因素干扰，HBV基因组在细胞或动物体内复制和表达时，不能受到载体上外源启动子序列的影响，唯有依靠HBV自身启动子驱动而复制。常用质粒载体包括pBluescript及pUC系列；病毒载体常用重组腺病毒载体。

3.HBV基因组的导入途径

目前，包含HBV基因组的质粒载体导入细胞的方式主要包括磷酸钙转染、脂质体转染和电转染；导入动物体内的方式包括尾静脉高压注射和直接注入肝脏内等。包含HBV基因组的重组腺病毒可直接感染多个种属的多种细胞；导入动物体内的方法包括尾静脉注射、腹腔注射以及直接注入肝脏内等方式。

表1  肝炎病毒复制能力检测的相关专利

  专利号  申请日期  发明人  病毒基因组  细胞/动物  1  US06610471  1999.01.20  Isom，et al.  杆状病毒  肝癌细胞株  2  US06087556  1998.07.01  Feitelson，et  al.  HBV或HCV  转基因SCID小  鼠  3  CN1463594  2002.06.14  宁琴等  鼠肝炎3型  病毒  (MHV-  近交系小鼠  BALB/CJ，  C3H/HEJ，A/J  4  CN1526826  2003.03.03  杨振等  HCV NS5b  5  CN1679967  2004.12.21  孙汶生等  HBs  小鼠  6  CN1701124  2003.09.26  D·迪朗泰尔  HBV

虽然本领域在扩增病毒携带者离体样本中的HBV基因组并建立复制体系进行特异性的毒复复制检测和该病毒对抗病毒药物的敏感性的研究方面取得了很大的进展，但是目前扩增病毒携带者离体样本中的HBV基因组特别是1.3个拷贝的基因组的扩增制备方面速度慢，要采取多个扩增和制备步骤，另外，现有技术还需要将扩增得到的1.3个拷贝的基因组连接在所使用的载体自带的启动子之后以进行病毒复制，难以反应病毒复制的真实能力。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题快速扩增制备1.3拷贝的HBV基因组。解决该问题的方案是提供一新的引物组，该引物组包括以下两对引物：

扩增制备HBV2.4片段的引物对：

上游引物序列PF1：5’-CCTGCTTTAATGCCTTTGTATGC-3’(SEQ ID NO.1)；

下游引物序列PR1：5’-TCCACCACGAGTCTAGACTCTGTGG-3’(SEQ ID NO.2)；

扩增HBV1.7片段的引物对：

上游引物序列PF2；5’-CCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGA-3’(SEQ ID NO.3)；

下游引物序列PR2：5’-CGGTGTCGAGGAGATCTCGAATAGA-3’(SEQ ID NO.4)。

本发明需要解决的第二个技术问题是快速检测乙型肝炎病毒复制能力或抗病毒药物敏感性。技术方案是提供一种检测乙型肝炎病毒复制能力或抗病毒药物敏感性的试剂盒，该试剂盒含有上述的引物组。该试剂盒也适用于快速建立HBV转基因复制增殖体系

同时本发明提供了扩增1.3拷贝HBV基因组的方法，包括以下步骤：用上述的引物组从含HBV的样品中扩增制备1.3拷贝HBV基因组并连接到目的载体上。

其中，上述的1.3拷贝的HBV基因组是在HBV基因组后连接有HBc和HBx基因。

其中，上述方法的扩增制备1.3拷贝HBV基因组并连接到目的载体上是通过以下方式完成：

取含HBV的样品，用引物PF1、PR1进行PCR扩增，得到分子量约为2.4kb的目的条带HBV2.4，连接到质粒上保存；

取含HBV的样品，用引物PF2、PR2进行PCR扩增，得到分子量约为1.7kb的目的条带HBV1.7，连接到质粒上保存；

采用Hind III、Xba I双酶切连接有HBV2.4片段的质粒，Xba I、Pst I双酶切连接有HBV1.7片段的质粒，Hind III、Pst I双酶切目的载体，分离纯化酶切后的目的载体、HBV2.4片段和HBV1.7片段，然后将HBV2.4片段、HBV1.7片段同时连接到目的载体上，即得。

本发明同时也提供了一种快速检测乙型肝炎病毒复制能力和抗病毒药物敏感性的方法。该方法包括以下步骤：

a、用上述的引物组从含HBV的样品中扩增制备1.3拷贝HBV基因组并连接到目的载体上：

b、用该载体建立HBV转基因复制增殖体系；

c、用该HBV转基因复制增殖体系进行乙型肝炎病毒复制能力和抗病毒药物敏感性的检测。

其中，上述的1.3拷贝的HBV基因组是在HBV基因组后连接有HBc和HBx基因。可由用本发明扩增HBV2.4片段的引物对扩增得到的HBV2.4片段的3’端与用本发明扩增HBV1.7片段的引物对所扩增得到的HBV1.7片段5’端连接得到。

其中，上述方法步骤a中扩增制备1.3拷贝HBV基因组并连接到目的载体上是通过以下方式完成：

将含HBV的样品用PF1、PR1进行PCR扩增，得到分子量约为2.4kb的目的条带HBV2.4片段，连接到质粒上保存；将含HBV的样品用引物PF2、PR2进行PCR扩增，得到分子量约为1.7kb的目的条带HBV1.7片段，连接到质粒上保存；然后采用Hind III、Xba I双酶切连接有HBV2.4的质粒，Xba I、Pst I双酶切连接有HBV1.7的质粒，Hind III、Pst I双酶切目的载体，分离纯化酶切后的目的载体和HBV2.4、HBV1.7片段，然后将HBV2.4、HBV1.7同时连接到目的载体上，即得。所述目的载体是指希望含有1.3拷贝HBV基因组的载体。

其中，上述方法步骤b所述的HBV转基因复制增殖体系为肝癌细胞株HepG2细胞模型、鼠成纤维细胞NIH3T3细胞模型。

其中，上述方法步骤a中扩增制备1.3拷贝HBV基因组并连接到目的载体上是通过以下方式完成：

本发明还提供了一种扩增制备样品中HBV的1.3拷贝基因组的方法。该方法为将含HBV的样品用 上述PF1、PR1进行PCR扩增，得到分子量约为2.4kb的目的条带HBV2.4，连接到质粒上保存；将含HBV的样品用上述引物PF2、PR2进行PCR扩增，得到分子量约为1.7kb的目的条带HBV1.7，连接到质粒上保存；然后采用Hind III、Xba I双酶切连接有HBV2.4的质粒，XbaI、Pst I双酶切连接有HBV1.7的质粒，Hind III、Pst I双酶切目的载体，分离纯化酶切后的目的载体和HBV2.4、HBV1.7片段，然后将HBV2.4、HBV1.7同时连接到目的载体上，即得。所述目的载体是指希望含有1.3拷贝HBV基因组的载体。

进一步，上述目的载体为不含有外源启动子的载体。

由于HBV基因组全长3.2kb，在宿主体内产生3.5kb前基因组RNA作为病毒逆转录复制的模板(即前基因组RNA)。通过在HBV 全长序列5’末端重复一个C基因和X基因及其增强子，形成约1.3拷贝(4.1kb)的HBV超长序列，不仅可以产生完整的HBV转录和复制过程，而且表现出明显的嗜肝性。

需要说明的是，本发明出现的4.1kb(即约4.1kb)、1.3拷贝(即约1.3拷贝)等对核苷酸片段长度的描述术语在分子生物学操作领域是常用而清楚的，不会影响本领域技术人员对本发明技术方案的实施。

本发明创造性地采用了两步扩增和体外重组方法，得到该1.3拷贝的HBV基因组。其特点在于：巧妙利用HBV基因组序列的自身结构。经分析，多数HBV基因组的X基因及其增强子上游存在单一的Nsi I酶切位点，而在C基因的下游存在Bgl II酶切位点，在两者之间有单一的Xba I酶切位点。上述特点使在不影响目标HBV基因组原有序列的前提下，构建1.3拷贝的HBV基因组的重组质粒成为可能。

本发明方法扩增HBV特定基因片段所适用的乙肝病毒DNA模板样品可为来自于一般的HBV慢性感染患者的离体血清样本，并不依赖于特定的个人。2对引物是根据对现有的公开资料的分析后设计得到，引物序列1(PF1)和引物序列2(PR1)的5’-端分别包含Nsi I酶切位点和Xba I酶切位点；引物序列3(PF2)和引物序列4(PR2)的5’-端分别包含Bgl II酶切位点和Xba I酶切位点。在本发明中，PF为上游引物序列的简写，PR为下游引物序列的简写。

采用引物序列1、序列2组合，引物序列3、序列4组合分别扩增HBV基因片段1(HBV2.4，大小约2.4kb)及HBV基因片段2(HBV1.7，大小约1.7kb)，经凝胶回收纯化后连接至载体上并测序鉴定。

携带1.3拷贝HBV基因组的重组载体的构建是从上述克隆有HBV基因片段的载体上，采用Hind III和Xba I酶切并胶回收HBV2.4片段，Pst I和Xba I酶切并胶回收HBV1.7片段。同步Hind III和Pst I酶切并胶回收pUC18载体，将HBV2.4和HBV1.7同步连接到pUC18载体上，获得包含约4.1kb HBV基因组(约1.3拷贝)的重组质粒pHBV4.1。

载体尤其是携带1.3拷贝HBV基因组目的载体的选择：pUC系列为最常用的质粒载体，结构紧凑，仅含常用多克隆位点、氨苄青霉素抗性基因、pMB1复制子，几乎不含多余的DNA片段。

本发明的有益效果在于：本发明利用HBV基因组序列的自身结构特点，创造性地采用了两步扩增和体外重组方法，发展了专用的高效引物对，在不影响目标HBV基因组原有序列的前提下，扩增得到目标样品中HBV的1.3拷贝的HBV基因组，该基因组能在细胞模型或动物模型中产生HBV DNA复制中间体以及所有类型的HBV mRNA转录(3.5kb，2.4kb，2.1kb，0.7kb)，并编码合成HBeAg、HBsAg，较好模拟HBV在宿主体内的复制情况，进而能够检测该基因组的复制能力和抗病毒药物敏感性。使用本发明方法制备的该1.3拷贝HBV基因组序列不需要外源启动子的作用，能够较好地模拟HBV的作用机制和对抗病毒药物的反应。使用本发明方法制备1.3拷贝的HBV基因组过程简便，周期短，费用低，且能够对HBV基因组进行定点诱变。很好的克服了现有技术的多项缺陷，具有很好的应用前景。

附图说明

图1乙肝病毒HBV的结构示意图。

图2pT/HBV4.1质粒的构建示意图。

图3pMD-18T/HBV2.4质粒的酶切产物电泳图谱，其中M为分子量标准Marker依次为：19329bp、7743bp、6223bp、4253bp、3472bp、2690bp、1882bp、1489bp、925bp、421bp；第1道为：pMD-18T/HBV2.4用EcoR I/Pst I双酶切，得到2.69kb载体和2.4kb插入片段(部分重叠)；第2道为：pMD-18T/HBV2.4用EcoR I/Pst I和Pvu I酶切，2.69kb载体进一步酶切为1.6kb、1kb和135bp片段。

图4EcoR I/Pst I双酶切pMD-18T/HBV1.7质粒的酶切产物电泳图谱，其中1、2、3道：pMD-18T/HBV1.7质粒酶切后，得到2.69kb的载体和1.7kb的插入片段；M为分子量标准Marker，大小依次为：19329bp、7743bp、6223bp、4253bp、3472bp、2690bp、1882bp、1489bp、925bp、421bp。

图5复制型HBV重组质粒pUC18/HBV4.1(简称pHBV4.1)的酶切产物电泳图谱，其中第1道：未切质粒，第2道：分子量标准Marker，大小依次为5kb，3kb，2kb，1.5kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp；第3道：pHBV4.1质粒Hind III和EcoR I双酶切，得到2.6kb的载体和4.1kb片段。

图6pHBV4.1在非肝源细胞NIH3T3中转录和复制HBV的检测情况，表明pHBV4.1在非肝源细胞NIH3T3中复制和转录水平低。泳道1为NIH3T3转染重组质粒pHBV4.1，泳道2为NIH3T3转染重组质粒pHBV4.1及HNF4表达质粒，泳道3为NIH3T3转染重组质粒pHBV4.1及RxRα/PPARα(+lig)表达质粒。

图7pHBV4.1在肝源细胞HepG2中的转录和复制HBV的检测情况。泳道1为HepG2细胞，泳道2为转染重组质粒pHBV4.1的HepG2细胞。

图8HBV复制模型中，抗病毒药物ETV抑制pHBV4.1转录HBV RNA的情况，NS为口服磷酸盐缓冲液的对照组，ETV指口服恩替卡韦组。

图9HBV复制模型中，抗病毒药物ETV抑制pHBV4.1复制HBV RNA的情况，NS为口服磷酸盐缓冲液的对照组，ETV指口服恩替卡韦组。

具体实施方式

本发明方法可以通过以下方式进行具体的实施。

1.携带1.3拷贝HBV基因组的重组质粒的构建

(1)HBV基因组全长3.2kb，在宿主体内产生3.5kb前基因组RNA作为病毒逆转录复制的模板(即前基因组RNA)。通过在HBV全长序列5’末端重复一个C基因和X基因及其增强子，形成约1.3拷贝(4.1kb)的HBV超长序列，不仅可以产生完整的HBV转录和复制过程，而且表现出明显的嗜肝性。

(2)HBV特定基因片段的扩增

根据已知乙肝病毒DNA设计2对引物，引物序列1(PF1)和引物序列2(PR1)的5’-端分别包含Nsi I酶切位点和Xba I酶切位点；引物序列3(PF2)和引物序列4(PR2)的5’-端分别包含Bgl II酶切位点和Xba I酶切位点。待扩增的乙肝病毒DNA模板样品来自于经确诊的中国HBV慢性感染患者的血清。

采用引物序列1、序列2组合，引物序列3、序列4组合分别扩增HBV基因片段1(HBV2.4，大小约2.4kb)及HBV基因片段2(HBV1.7，大小约1.7kb)，经凝胶回收纯化后连接至pMD-18T载体上并测序鉴定。

(3)质粒载体的选择：pUC系列为最常用的质粒载体，结构紧凑，仅含常用多克隆位点、氨苄青霉素抗性基因、pMB1复制子，几乎不含多余的DNA片段。

(4)携带1.3拷贝HBV基因组的重组质粒的构建

从上述克隆有HBV基因片段的pMD-18T载体上，采用Hind III和Xba I酶切并胶回收HBV2.4片段，Pst I和Xba I酶切并胶回收HBV1.7片段。同步Hind III和Pst I酶切并胶回收pUC18载体，将HBV2.4和HBV1.7同步连接到pUC18载体上，获得包含约4.1kb HBV基因组(1.3拷贝)的重组质粒pHBV4.1。

2.建立1.3拷贝HBV基因组的细胞模型

采用改良磷酸钙转染法，将pHBV4.1质粒转染人肝癌细胞株HepG2、非肝源性细胞选用鼠成纤维细胞NIH3T3。转染3天后分离纯化细胞RNA及HBV DNA复制中间体。采用Northern吸印杂交检测HBV的3.5kb，2.4/2.1kb和0.7kb mRNA水平；以Southern吸印杂交检测HBV复制中间体DNA和上清中病毒DNA水平；ELISA法检测细胞HBsAg和HBeAg。观察pHBV4.1是否仅在肝源细胞系中复制，而在非肝源性细胞不复制或复制水平低。

将pHBV4.1质粒和肝富集转录因子HNF4(或RxRα/PPARα)共转染NIH3T3细胞，观察是否影响pHBV4.1在非肝源细胞系中的复制。

3.HBV动物模型的建立和应用

采用近交系清洁级BALB/c小鼠行尾静脉高压注射法，建立复制型HBV动物模型。

模型建立方式为将复制型HBV重组质粒pHBV4.1经小鼠尾静脉短时间内快速注射入BALB/C小鼠体内，定期检测肝脏HBV DNA复制中间体水平(Southern吸印杂交)、肝组织HBcAg和HBsAg表达(免疫组化)、血清中HBcAg和HBsAg表达(ELISA)。

将HBV模型小鼠分为试验组和对照组。试验组口服恩替卡韦，对照组口服磷酸盐缓冲液，观察两组小鼠体内HBV DNA复制中间体的水平。

实施例1  乙肝病毒基因片段HBV2.4和HBV1.7的扩增及连接

1.HBV DNA模板的制备

选择慢性乙肝病毒感染者混合血清，HBsAg(+)，HBV DNA载量在10⁴～10⁷拷贝数/mL之间。取血清200μl，采用经典酚/氯仿法抽提HBV DNA，并溶于TE(pH8.0)中。

2.乙肝病毒基因片段1(HBV2.4)和基因片段2(HBV1.7)的扩增

(1)引物合成

根据GenBank中已经报道的中国患者HBV感染主要型别(基因型B、C、D型)基因序列设计通用引物，委托上海生物工程有限公司合成(PAGE纯化)，用纯水溶解稀释为10μmol/L浓度，分装贮存于-20℃。HBV2.4和HBV1.7扩增用引物、片段大小见下表。

表1  PCR扩增及连接引物

 PCR目标产物  上游引物  下游引物  产物  HBV2.4  PF1(含Nsi I位点)  PR1(含Xba I位点)  2398

 PCR目标产物  上游引物  下游引物  产物  HBV1.7  PF2(含Xba I位点)  PR2(含Bgl II位点)  1743

①HBV2.4的基因扩增

取HBV模板3μl，2.5mM dNTPmix 8μl、25mM MgCl₂ 5μl、TaKaRa LA Taq 2.5U及引物PF1、PR1进行PCR扩增。循环参数设置为：预变性94℃5min；94℃1min，56℃1min，72℃2min30sec，循环35次；72℃延伸10min。反应结束后，取PCR产物于1％琼脂糖凝胶上电泳，切胶回收分子量约为2.4kb的目的条带(HBV2.4)，按Omega胶回收试剂盒说明书操作。最后用30μl纯水洗脱备用，结果见图3。

②HBV1.7的基因扩增

引物使用PF2、PR2，循环参数设置为：预变性94℃5min；94℃1min，56℃1min，72℃2min，循环35次；72℃延伸10min。PCR反应结束后，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化约1.7kb的目的条带，结果见图4。

实施例2 重组质粒pMD-18T/HBV2.4和pMD-18T/HBV1.7的构建

取胶回收纯化的HBV2.4片段2μl和pMD-18T载体0.5μl，加H₂O补至5μl，再加入等体积的sol I(Takara)，16℃保温1h或连接过夜。

将连接反应转化感受态菌JM109 100μl，并涂布于LB/Amp^r抗性平板上(预先涂布X-gal/IPTG)，37℃培养过夜。从LB/Amp^r抗性平板中央挑取10个白色菌落转小样提取质粒，取1μl进行琼脂糖凝胶电泳，以空载质粒为对照。如重组质粒分子量大于空载质粒，继续用EcoR I和Pst I双酶切鉴定。当酶切后的载体和插入片段分子量大小与预期值相符时，继续测序分析。经测序证实，得到包含HBV2.4片段的pMD-18T/HBV2.4质粒。

取胶回收纯化的HBV1.7片段，同上述方法获得携带HBV1.7的pMD-18T/HBV1.7重组质粒。

实施例3  重组质粒pUC18/HBV4.1的构建

采用Hind III、Xba I双酶切pMD-18T/HBV2.4，Xba I、Pst I双酶切pMD-18T/HBV1.7，Hind III、Pst I双酶切pUC18载体，分离纯化酶切后的pUC18载体和HBV2.4、HBV1.7片段。采用Takara DNA ligation Kits，将HBV2.4、HBV1.7同时连接到pUC18载体上。将连接反应转化感受态菌JM109，并涂布于LB/Amp^r抗性平板上(预先涂布X-gal/IPTG)，37℃培养过夜。

从LB/Amp^r抗性平板中央挑取10个白色菌落，小样培养并提取质粒，如重组质粒分子量大于空载质粒，继续用Hind III和EcoR I双酶切鉴定。当酶切后的载体和插入片段分子量大小与预期值相符时，继续测序分析，其序列见SEQ ID NO.5。经多克隆测序证实，获得复制型HBV重组质粒pUC18/HBV4.1(以下简称pHBV4.1)，酶切验证结果见图5。

序列分析证实，其中含有的HBV2.4片段长度为2398bp，HBV1.7片段长度为1743bp。采用BioEdit7.01软件的ClustalW程序，将HBV2.4、HBV1.7与GenBank数据库中各基因型相对应的HBV标准株序列进行多序列比对后发现具有较好的一致性，其源病毒株为基因型B、血清亚型adw2。

实施例4  利用pHBV4.1转染建立的HBV细胞模型

非肝源性细胞选用鼠成纤维细胞株NIH3T3，肝源细胞选用人肝癌细胞株HepG2.将1×10⁶细胞接种于10cm细胞培养皿，5％CO₂、37℃培养箱中培养18～24小时。采用现有的改良磷酸钙法，将pHBV4.1转染HepG2细胞和NIH3T3细胞(NIH3T3细胞采用pHBV4.1单独转染或与HNF4或与RxRα/PPARα共转染)。转染3天后，收集培养上清检测HBsAg和HBeAg；刮取细胞后重悬于TBS中，以供提取细胞总RNA和HBV DNA复制中间体。

Northern Blot检测HBV RNA：取15μlRNA样品与30μl RNA上样缓冲液，点样于1％琼脂糖甲醛凝胶上，60-100V 5mA电泳5-6h。采用毛细管法转移过夜，使核酸沉淀在尼龙膜上并紫外光交联。

Southern Blot检测HBV DNA复制中间体：取30μl DNA样品和10×DNA上样缓冲液4μl，点样于1％琼脂糖凝胶，60-100V 5mA电泳5-6h。将凝胶依次0.25M HCl，10～15min；变性液20～30min；复性液30min。然后同样毛细管法转移至尼龙膜上并紫外光交联。将HBV RNA和HBV DNA复制中间体的尼龙膜片置于预杂交液中，65℃(DNA)或42℃(RNA)预杂交过夜。然后用地高辛标记的探针Dig-HBV与固定在尼龙膜的核酸进行Southern吸印杂交和Northern吸印杂交(同时加入甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH标志探针)65℃(DNA)或42℃(RNA)杂交过夜。检测试剂采用DIG Luminescent Detection Kit，按说明书操作，最终X线胶片曝光时间选择30min～4h。

鼠成纤维细胞株NIH3T3检测结果见图6，上半部分表示Northern Blot检测结果，下半部分表示Southern Blot检测结果，表明pHBV4.1在非肝源细胞NIH3T3中复制和转录水平低，加入肝细胞核因子4(Hepatocyte Nuclear Factor-4，HNF-4)或维甲类X受体(Retinoid Xreceptor alpha，RxR)α/过氧化物酶体增殖物活化受体(Peroxisomeproliferator-activated receptor，PPAR)α后明显提高。人肝癌细胞株HepG2检测结果见图7，上半部分表示Northern Blot检测结果，下半部分表示Southern Blot检测结果。结果表明HBV可以在非肝源细胞中复制，但复制依赖于细胞因子HNF4或RxRα/PPARα。

实施例5HBV动物模型的建立和抗病毒药物敏感性检测

选择健康雄性BALB/c(H-2^d)小鼠，6-8周龄，体重18-20g，清洁级，标准化环境饲养。将小鼠分为实验组和对照组。实验组分别注射10μg的pHBV4.1质粒，从而建立HBV复制的动物模型；对照组注射同等剂量的不含HBV4.1基因组的空载质粒。注射方式为小鼠尾静脉高压注射法。预实验结果表明注射后3～4天，肝组织中可检测到HBsAg、HBeAg(免疫组化)和HBV DNA复制中间体(Southern Blot)。

将上述小鼠模型按体重、血清HBeAg水平配对，分成试验组和对照组，进行抗病毒药物敏感性检测。实验组口服恩替卡韦75μg/kg(溶于300μl生理盐水)，每隔24小时一次，共3次；对照组每次注射300μl生理盐水，注射方式同实验组。末次注射给药后24小时处死小鼠，Northern Blot和Southern Blot分别检测肝组织中HBV RNA转录和HBV DNA复制中间体。Northern Blot结果(图8)提示ETV组的HBV RNA转录水平和生理盐水对照组的差异不明显；Southern Blot结果(图9)提示ETV组的HBV DNA复制受到显著抑制。

SEQUENCE LISTING

<110>四川大学华西医院

<120>检测乙肝病毒复制能力和抗病毒药物敏感性的方法

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