用于检测生物体内一氧化氮浓度的微型光纤生物传感器

摘要

本发明涉及一种用于检测生物体内NO浓度的微型光纤生物传感器。该传感器由光源、输入光纤、NO光纤荧光微型探头、输出光纤、信息采集与数据处理系统组成。所述传感器微型探头采用157nm紫外短脉冲激光技术加工多模石英光纤制成。NO敏感膜由NO荧光指示剂和高分子基体材料构成，通过物理吸附的方法固定在光纤微探头上，敏感材料可与环境中的NO反应导致荧光强度信号显著变化，从而进行NO浓度的检测。传感器检测系统采用反射式光路设计，使用快捷，具有较高的灵敏度和精确度，抗干扰性和稳定性好。

说明书

技术领域

本发明属于生物检测及临床医学检测技术领域，涉及一种用于检测生物体内NO浓度的微型光纤生物传感器。

背景技术

一氧化氮(NO)是一种极不稳定的生物自由基，分子小，结构简单，生物半衰期只有3～5秒。现已查明NO是生物体内重要的信使分子和效应分子，对心脑血管系统、消化系统、神经系统等均具有重要的调节作用，对其检测在生命学科、基础医学和临床医学等领域中都非常重要。

目前，检测NO的方法主要有电化学法、化学发光法、仪器分析法，同位素放射强度法、间接检测法等，这些方法各有其特点，但在灵敏度、特异度和检测速度等方面不能非常好地满足临床医学上实时在体检测的需要。如：电化学法是目前报道检测NO最为广泛的一类检测方法，但其响应慢、易受干扰、检测精度低；化学发光法中臭氧氧化法需要NO和臭氧气相反应且同仪器分析法一样过程复杂、耗时长；Luminol-H₂O₂化学发光体系易受生物体中多巴胺、尿酸、抗坏血酸维生素C、金属离子等的干扰；同位素放射强度法则会造成放射性污染并给人体带来危害。由于NO是由一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸(LA)脱去胍基而产生，人们也尝试用间接测量的方法，通过测定NOS(半衰期为1-2min)的含量或NO代谢产物亚硝酸盐(NO₂^-)、硝酸盐(NO₃^-)等的含量来间接测定NO的浓度，但这种方法误差很大，难以得到准确的结果。近年来，荧光光度法检测NO的研究成为热点，它是一种灵敏的化学检测手段，其检测下限一般可以达到纳摩尔(10^-9摩尔)甚至皮摩尔(10^-12摩尔)级，而且荧光型探针可以实现对NO的选择性、实时检测，并获得更高的敏感性。国内外已经研究出一些与NO反应产生荧光强度变化的邻二氨基共轭苯环敏感材料的荧光型探针，如：2，3-二氨基萘(DAN)及其衍射物；二氨基荧光素(DAF)；二氨基罗丹明(DARs)等。但是荧光光度检测方法无法实现对生物体内NO浓度的在体检测，因而无法获得人体的准确生理信息。

光纤生物传感器是光纤传感器中的一大类，其探头可以感知待测生物物质，并产生相应的光信号，再经过光电转换装置转化成电信号输出。由于光纤生物传感器具有探头直径小、信息传输容量大、能量损耗低、抗干扰能力强、响应快、成本低、使用方便，可实时在体检测等优点，近年来一直是国内外的研究热点。光纤微型生物传感器在检测生物体中待测物质时，探头具有特殊的要求，必须具有微小的尺寸，能无创插入人体的合适深度，并具有生物相容性。同时，为了提高在其探头上固定生物敏感材料的效率和光信号传输效率，需要在光纤上刻制精巧结构。由于光纤十分纤细(芯径一般为5～9μm，包层直径一般为125μm)，而且组成光纤的二氧化硅材料硬且脆，采用传统的研磨、腐蚀、火焰等方法很难在光纤上加工精巧结构。

发明内容

本发明目的：针对目前检测生物体内一氧化氮浓度方面存在的问题，本发明提供一种新型的一氧化氮(NO)微型光纤生物传感器。该生物传感器具有探头直径小、信息传输容量大、能量损耗低、抗干扰能力强、响应快、成本低、使用方便、可实时在体检测且检测灵敏度高等优点，可对生物体内NO浓度的实时在体检测。

该NO光纤微型生物传感器工作原理为：检测时取被测物放入含有缓冲液的微量检测池4中(见附图1)，从光源1发射出的光通过输入光纤2照射在光纤微槽中的敏感膜上，敏感材料与环境中的NO反应后自身荧光强度发生变化，变化的荧光经由输出光纤5传至信息采集与数据处理系统6进行处理，通过荧光强度变化的大小可以得到NO的浓度。其中该NO微型光纤生物传感器采用560nm的激光光源，光纤微探头包括NO荧光敏感膜7，反射面Ag膜8和半透膜9，NO敏感薄膜由含NO荧光指示剂的高分子膜组成。用激光微加工技术制作的NO传感器具有微小光纤探头，能无创检测，极大地减轻使用过程中病人痛苦。

实现本发明目的的技术方案：

一种NO光纤生物微型传感器，其特征是，光纤微探头采用紫外短脉冲激光加工技术刻蚀成微槽，该探头中NO敏感薄膜由NO荧光指示剂和具有生物相容性的高分子膜组成，采用物理吸附方法将所述敏感膜固定在光纤微槽中。光纤探头用金属套封装，NO敏感膜微槽结构处用半透膜封装，在光纤探头端面用真空蒸镀法镀Ag膜成反射膜。所述荧光指示剂为二氨基荧光素(DAFs)和二氨基罗丹明(DARs)，所述高分子膜材料为醋酸纤维素。该NO微型光纤生物传感器包括光源、输入光纤、NO微型荧光探头、输出光纤、信息采集与数据处理系统。所述的传感器结构模式为反射式。

本发明的NO微型光纤生物传感器制作方法，包含如下步骤：

1)光纤微型探头的加工：

本发明所用光纤为多模石英光纤，采用英国Exitech公司生产的输出波长为157nm的F2激光加工系统，通过振幅模板和微动平台控制技术，对传感器探头进行微加工。利用157nm深紫外激光直刻工艺在多模石英光纤刻蚀微槽，所述微槽用来固定NO敏感材料。在光纤探头端面采用真空蒸镀法镀Ag膜成反射膜。

2)NO敏感膜的制备：

本发明光纤微型探头中NO敏感膜由NO荧光指示剂和具有生物相容性的高分子膜组成，高分子膜材料为醋酸纤维素。NO荧光指示剂采用目前应用的最为成功的二氨基荧光素(DAFs)和二氨基罗丹明(DARs)。称取0.1g醋酸纤维素溶于3.5mL丙酮，密闭搅拌2h，再向混合液中加入0.25mL一定浓度的NO荧光指示剂和0.5ml双蒸水，再密闭搅拌6h；将搅拌均匀的混合液倾倒入直径Φ60mm的玻璃生化培养皿中，用保鲜膜将皿封好，在保鲜膜上扎适当大小及数量的孔，室温下置于水平平台上直至丙酮完全挥发成膜即可，膜厚约20μm。或者吸取搅拌均匀的混合液直接滴入所述光纤探头微槽中，用保鲜膜将探头封好，室温下置于水平平台上直至丙酮完全挥发成膜。

3)NO微型光纤生物传感器的制作：

采用物理吸附法将步骤2)中制备的NO敏感膜固定于步骤1)加工后的光纤微槽中。光纤探头用金属套封装，NO敏感膜微槽结构处用半透膜封装以便于敏感材料和待检测NO反应。连接激光光源(560nm)、输入光纤、光纤荧光微探头、输出光纤、信息采集与数据处理系统等制作成NO微型光纤生物传感器。

本发明中所采用的激光微加工是一种无接触加工，紫外短脉冲激光照在光纤材料上，作用时间短、热扩散度低，产生的热熔化区小，烧蚀深度、形状能够精确控制，可以制作较好的表面形貌。由于激光加工不受熔化作用、表面膨胀或震动导致的微裂纹等的限制，比较适合加工光纤这样易碎的硬性材料，可以在光纤上制作各种微小、精致的结构，精度达到微米量级。

本发明中所述的室温系指25℃。

下面将结合附图和实施例对本发明做出进一步的说明。

附图说明

图1是用于检测生物体内一氧化氮浓度的微型光纤生物传感器原理图。

图2是光纤微型探头的结构示意图。

其中：1-激光光源，2-输入光纤，3-光纤微探头，4-微量检测池，5-输出光纤，6-信息采集与数据处理系统，7-NO荧光敏感膜，8-反射面Ag膜，9-半透膜。

具体实施方法

实施例1

1)利用157nm深紫外激光直刻工艺在多模石英光纤上刻蚀微槽，刻蚀微槽槽宽20-40μm，槽长约100-120μm。在光纤探头端面用真空蒸镀法镀Ag膜成反射膜。

2)称取0.1g醋酸纤维素溶于3.5mL丙酮，密闭搅拌2h，再向混合液中加入0.25mL浓度为0.5mmol/ml的二氨基荧光素(DAFs)和0.5ml双蒸水，再密闭搅拌6h；将搅拌均匀的混合液倾倒入直径Φ60mm的玻璃生化培养皿中，用保鲜膜将皿封好，在保鲜膜上扎适当大小及数量的孔，室温下置于水平平台上直至丙酮完全挥发成膜即可。

3)采用物理吸附法将步骤2)中制备的NO敏感膜固定于步骤1)加工后的光纤微槽中。用金属套封装光纤探头，NO敏感膜微槽结构处用半透膜封装。参照图1和图2，采用560nm的激光光源，从光源1发射出的激光通过耦合器进入输入光纤2照射在NO敏感膜7上，待测物质中NO通过半透膜9与NO敏感膜7发生反应，所激发的荧光被光纤端面Ag膜8反射经光纤分路器由输出光纤5传至信息采集与数据处理系统6进行处理。

检测过程：将NO光纤微探头与输出光纤固定好，取被测物放入微量检测池4中，整个系统处于密闭状态。通过自动数据采集和处理系统读取荧光强度值，根据荧光强度的变化来计算被测物NO的浓度，待测物浓度单位为μmol/L。

实施例2

除更换NO荧光指示剂外，其他实施方法同实施例1。

NO敏感薄膜的制备：称取0.1g醋酸纤维素溶于3.5mL丙酮，密闭搅拌2h，再向混合液中加入0.25mL浓度为0.5mmol/ml的二氨基罗丹明(DARs)和0.5ml双蒸水，再密闭搅拌6h；将搅拌均匀的混合液倾倒入直径Φ60mm的玻璃生化培养皿中，用保鲜膜将皿封好，在保鲜膜上扎适当大小及数量的孔，室温下置于水平平台上直至丙酮完全挥发成膜即可。

实施例3

1)利用157nm深紫外激光直刻工艺在多模石英光纤上刻蚀微槽，刻蚀微槽槽宽约20-40μm，槽长约100-120μm。在光纤探头端面用真空蒸度法镀Ag膜成反射膜。

2)称取0.1g醋酸纤维素溶于3.5mL丙酮，密闭搅拌2h，再向混合液中加入0.25mL浓度为0.5mmol/ml的二氨基荧光素(DAFs)和0.5ml双蒸水，再密闭搅拌6h；吸取搅拌均匀的混合液直接滴入1)中所述光纤探头微槽中，用保鲜膜将探头封好，室温下置于水平平台上直至丙酮完全挥发成膜即可。

3)用金属套封装光纤探头，NO敏感膜微槽结构处用半透膜封装。参照图1和图2，采用560nm的激光光源，从光源1发射出的光线通过输入光纤2照射在NO敏感膜7上，待测物质中NO通过半透膜9与NO敏感膜7发生反应，所激发的荧光被光纤端面Ag膜8反射经光纤分路器由输出光纤5传至信息采集与数据处理系统6进行处理。

检测过程：将NO光纤微探头与输出光纤固定好，取被测物放入微量检测池4中，整个系统处于密闭状态。通过自动数据采集和处理系统读取荧光强度值，根据荧光强度的变化来计算被测物NO的浓度，待测物浓度单位为μmol/L。

实施例4

除更换NO荧光指示剂外，其他实施方法同实施例3。

NO敏感薄膜的制备：称取0.1g醋酸纤维素溶于3.5mL丙酮，密闭搅拌2h，再向混合液中加入0.25mL浓度为0.5mmol/ml的二氨基罗丹明(DARs)和0.5ml双蒸水，再密闭搅拌6h；吸取搅拌均匀的混合液直接滴入1)中所述光纤探头微槽中，用保鲜膜将探头封好，室温下置于水平平台上直至丙酮完全挥发成膜即可。