包含来自脂肪组织干细胞的治疗缺血性肢体疾病的组合物

摘要

本发明公开了用于治疗缺血性肢体疾病的细胞治疗组合物，更具体地说，本发明公开了用于治疗缺血性疾病的细胞治疗组合物，其含有来自人脂肪组织的间充质干细胞作为活性成分和蔗糖或者甘露糖作为赋形剂。该组合物诱导了在缺血性肢体病变中封闭血管周围的血管形成，因此对于治疗缺血性疾病是有效的。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于治疗缺血性肢体疾病的细胞治疗组合物，具体涉及用于治疗缺血性疾病的细胞治疗组合物，其含有来自脂肪组织的间充质(mesenchymal)干细胞和赋形剂。

背景技术

缺血性肢体疾病包括由于血管内血栓症、栓塞、血管内发炎、高血压、高血脂和糖尿病综合症引起的动脉和静脉闭塞而导致的外周循环障碍糖尿病足(diabetic foot)；如烧伤或者冻疮等外部因素引起的血管损伤导致的症状；以及在烟瘾极大的中年男子中表现为血炎症和血栓的血栓闭塞性血管炎(Buerger’s disease)，其典型例子是闭塞性动脉硬化症、血管闭塞性脉管炎以及类似疾病。

目前治疗所述疾病的方法包括优选治疗引起血栓或者栓塞的疾病，例如心律不齐、心房粘液瘤和红细胞增多症以及使用溶解血栓剂暂时减轻症状或者为了增大腔的直径给药例如右旋糖酐、抗凝血剂、苯基丁氮酮、潘生丁、肾上腺皮质激素、免疫抑制剂或者前列腺素E1等血管扩张剂和循环改善试剂。

手术疗法包括通过交感神经切除术、硬膜外阻断和交感神经阻断来解除痛苦的方法，减少交感神经过度紧张以诱导改善血管舒张和血液循环效果的方法，使用人造血管诸如Gortex的支路移植外科手术和病灶切除术(lesionectomy)。

但是，上面描述的药物治疗或者手术治疗方法具有的问题在于，它们暂时减轻了缺血性疾病症状或者显示了高度复发的风险。由于这种原因，需要开发能够根本上治疗缺血性疾病的方法。

干细胞指的是不仅具有自我复制而且具有分化成至少两种细胞的能力的细胞，并且可被分成全能干细胞、多功能干细胞(pluripotent stem cells)和多潜能干细胞(multipotent stem cells)。

近来发现脂肪组织是多潜能干细胞的新来源(Cousin等人，BBRC.，301：1016，2003；Miranville等人，Circulation，110：349，2004；Gronthos等人，J.Cell Physiol.，189：54，2001；Seo等人，BBRC.，328：258，2005)。也就是说，据报导，通过抽脂术得到的人脂肪组织中包含未分化细胞组并具有分化成脂肪细胞、成骨细胞、成肌细胞和成软骨细胞的能力(Zuk等人，Tissue Eng.，7：211，2001；Rodriguez等人，BBRC.，315：255，2004)。这种脂肪组织具有的优点在于其能够大量提取，其可以通过组织培养大量增殖，并且由于其为自体同源组织，因此不存在免疫排斥反应的风险，因而其可以重复注射。因此，其作为新的干细胞来源受到关注，克服来自骨髓或者脐带血所存在诸如难以收集、成本高以及必须通过组织相容性验证发现合适匹配的缺陷。

而且，近来使用动物模型实验的研究表明，来自脂肪组织的细胞具有能够再生肌肉和刺激神经血管分化的能力。因此，来自脂肪组织的细胞作为新的干细胞来源受到关注。

到目前为止已知的来自脂肪组织的干细胞包括可分化成上皮细胞的来自人脂肪组织的成人干细胞(Brzoska等人，BBRC，330：142，2005)，可分化成成骨细胞和脂肪细胞的来自人脂肪组织的成人干细胞(Cao等人，BBRC，332：370，2005)，可分化成神经细胞的来自人脂肪组织的成人干细胞(Safford等人，BBRC，294：371，2002)，可分化成脂肪细胞的来自鼠脂肪细胞的干细胞(Ogawa等人，BBRC，319：511，2004)，可分化成成骨细胞和成软骨细胞的来自鼠脂肪细胞的干细胞(Ogawa等人，BBRC，313：871，2004)，可分化成软骨细胞的来自人脂肪组织的干细胞(Biomaterials，25：3211，2004)，可分化成神经细胞的来自鼠脂肪细胞的干细胞(Fujimura等人，BBRC，333：116，2005)，以及可分化骨细胞、软骨细胞、神经细胞或肌肉细胞的来自脂肪细胞的干细胞(US 6,777,231)。

为了治疗缺血性疾病，韩国专利公开号2003-0034177公开了使用其分化已经由G-CSF诱导的造血干细胞治疗缺血性疾病的方法，韩国专利公开号2005-0111593公开了使用具有其中引入了血管蛋白(angiopoietin)基因的间充质干细胞治疗缺血性疾病的方法。但是，现有方法具有的问题在于干细胞被辅助使用，或者含有干细胞的细胞治疗剂的储存不稳定。

因此，本发明的发明人付出了许多努力来开发使用更稳定的干细胞来治疗缺血性疾病的方法，结果发现，当将赋形剂诸如蔗糖加入到其中的来自脂肪组织的脂肪干细胞引入到缺血性疾病的鼠模型中时，有效地产生了新的血管，从而完成了本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种治疗缺血性疾病的细胞治疗组合物，其含有来自脂肪组织的间充质干细胞作为活性成分，并在冷藏或者冻藏储存时显示很高的稳定性。

为了实现上述目的，本发明提供了治疗缺血性疾病的细胞治疗组合物，其含有作为活性成分的来自脂肪组织的间充质干细胞和赋形剂，其中来自脂肪组织的间质细胞的浓度为1×10⁵～1×10⁸个细胞/mL，并且赋形剂为蔗糖或者甘露糖。

在本发明中，用于组合物的基质优选选自下组，该组包括生理盐水、磷酸盐缓冲液(PBS)和

在本发明中，组合物优选另外包括白蛋白或者人血清作为赋形剂。另外，组合物优选另外包括EDTA或者DMSO作为赋形剂。

在本发明中，组合物优选另外包括药物学上可接受量的至少一种选自下组的添加剂，该组包括悬浮剂、溶解剂、稳定剂、等渗剂、防腐剂、防吸收剂、表面活性剂、稀释剂、载色剂、pH调节剂、镇痛剂、缓冲剂、含硫还原剂和抗氧化剂。

通过下列详细描述和所附的权利要求书，本发明的其他特征和实施方式将是容易想到的。

附图说明

图1显示了以100×放大倍数摄取的根据本发明的来自人脂肪组织的多潜能干细胞的照片。

图2显示了根据本发明的来自人脂肪的多潜能干细胞的免疫性质。

图3显示了根据本发明的来自人脂肪组织的多潜能干细胞相对于球形形成能力的稳定性。

图4显示了根据本发明的来自人脂肪组织的间充质干细胞的体外血管形成(angiogenic)能力。

图5显示了患有诱导的缺血性下肢疾病并注射有本发明的来自人脂肪组织间充质干细胞的裸鼠中的肢体切除程度，并显示了使用激光多普勒灌成象观察的裸鼠中的血管形成程度。

图6显示了由激光多普勒灌流比表示的本发明的来自人脂肪组织的多潜能干细胞的血管形成能力。

具体实施方式

本发明涉及治疗缺血性疾病的细胞治疗组合物，其含有浓度为1×10⁵～1×10⁸个细胞/mL的来自脂肪组织的间质细胞的和作为赋形剂的蔗糖或者甘露糖。

在本发明中，来自脂肪的干细胞通过经抽脂收集的细胞脂肪组织和粘附于培养皿并体外生长的来自脂肪的间充质干细胞得到。

在本发明的实施方式中，来自脂肪组织的间质细胞可通过如下步骤得到：使用抽脂管或者连接有导管的一次性注射器注入肿胀溶液和含脂肪材料，将得到的材料进行支原体检测和无菌检测，通过质量管理标准从受测材料中选取样品，将所选样品离心成脂肪层和水层，使用胶原酶溶液预处理水层样品，然后在含有10％FBS以及抗坏血酸的DMEM培养基中培养得到的细胞。

同时从上面得到的来自人脂肪组织的干细胞培养液中得到表达所需表面抗原的方法包括使用具有分选功能(Int.Immunol.，10(3)：275，1998)的流式细胞计数器的FACS方法，使用磁珠的方法，以及使用特异性识别多潜能干细胞的抗体的淘盘洗选法(panning，J.Immunol.，141(8)：2797，1998)。而且，从大量培养液中得到多潜能干细胞的方法包括其中在细胞表面上表达以特异性识别分子(此后称为“表面抗原”)的抗体被单独使用或者组合成柱使用。

流式细胞计数分选法可包括水滴电荷法和细胞捕获法。在这些方法的任一种中，特异性识别细胞表面上的抗原的抗体被荧光标记，由与细胞表面上表达的分子结合的抗体发出的荧光强度被转化成电信号，从而可对抗原的表达量进行定量。还能够通过将所使用的荧光类型进行组合来分离表达多种表面抗原的细胞。在这种情况下可使用的荧光的粒子包括FITC(荧光异硫氰酸酯)、PE(藻红蛋白)，APC(异藻青蛋白，allo-phycocyanin)、TR(Texas Red)、Cy 3、CyChrome、Red 613、Red 670、TRI-Color、Quantum Red等等。

使用流式细胞计数器的FACS法包括：其中上述干细胞培养液被收集的方法，细胞通过该方法分离，例如离心并直接使用抗体进行染色；以及其中细胞在适当的培养基中培养并生长然后使用抗体染色的方法。细胞的染色通过将识别表面抗原的初级抗体与靶细胞样品混合并将混合物在冰上孵化30分钟到1小时来进行。当初级抗体被荧光标记时，洗涤后将细胞使用流式细胞计数器分离。当初级抗体没有被荧光标记时，将细胞与初级抗体反应，并且将具有与初级抗体结合活性的荧光标记的次级抗体在洗涤后混合，并在冰上孵化30分钟到1小时。洗涤后，将使用初级抗体和次级抗体染色的细胞使用流式细胞计数器分离。

而且，分离的根据本发明的间充质干细胞可使用流式细胞计数器分析它们的免疫学性质。

在本文中，术语“缺血性疾病”指的是因到组织的血液供应减少或者中断而引起的功能不正常、组织变性或坏死，特别包括缺血性心脏病，诸如心肌梗死和心绞痛、末端局部缺血、与损坏性循环有关的损伤、外伤性损伤诸如截肢和骨折。特别是，本发明中的缺血性疾病不仅包括缺血性疾病，而且包括由于损伤或伤害导致的缺血性状态。

本发明的细胞治疗组合物可直接或者通过载体引入。载体应当是生理上可接受的，其例子包括诸如生物聚合物的有机物质，和诸如羟磷灰石的无机物质。其特定例子包括胶原基质，多聚乳酸聚合物或者共聚物，聚乙烯甘油集合物或者共聚物，以及它们的化学衍生物。此外，载体可以使两种或者多种上述生理上可接受的材料的混合物。

本发明的组合物例如可在围绕缺血部位的残余肌肉(骨骼肌、心肌等等)中的一个或多个部位(例如2～50个部位)给药。组合物的计量优选例如在1.0×10⁵～1.0×10⁸个细胞/kg(重量)的范围，更优选1.0×10⁶～1.0×10⁷个细胞/kg(重量)。

但是，组合物的计量可基于患者体重、年龄、性别和症状、待给药组合物的剂型、组合物的给药方法等等而变化。本领域技术人员可适当调节剂量。给药频率可在临床可接受的副作用限制内从一次到数次的范围内变化。可以有一个或多个给药部位。对于非人动物而言每kg的剂量可以与人的相同，或者可通过上面描述的计量转换，例如基于人的缺血性器官(诸如心脏)与动物对象之间的体积比(例如平均值)来转换。根据本发明待治疗的动物包括人和其他需要的哺乳动物，其特定例子包括人、猴、小鼠、大鼠、兔子、绵羊、牛和狗。

本发明的治疗方法可单独或者与其他标准或者先进方法结合进行。例如，本发明的用于治疗缺血性疾病的方法优选可与手术血管再生成诸如经皮冠状动脉成形术(PTCA)和/或冠状动脉旁路移植(CABG)结合。本发明的方法与其他方法结合使用可有效改善心脏功能并缩短卧床(confined to bed)时间。

本发明的细胞治疗剂可包括药物学上可接受的载体和/或添加剂。它们的粒子包括无菌水、生理盐水、标准缓冲液(例如磷酸、柠檬酸或者其他有机酸)、稳定剂、盐、抗氧化剂(例如抗坏血酸)、表面活性剂、悬浮剂、等渗剂或者防腐剂。对于局部给药来说，本发明的组合物优选与有机物质诸如生物聚合物、无机物质诸如羟基磷灰石结合，它们的特定例子包括胶原基质、聚乳酸的聚合物或者共聚物，聚乙烯甘油的聚合物或者共聚物，以及它们的化学衍生物。

在本文中使用的术语“基质”指的是细胞治疗组合物中的间充质干细胞被悬浮在其中的基质溶液。作为基质，生理盐水、磷酸缓冲液或者Hartman-D(Choongwae Pharma Corp.)优选被使用。

在优选实施方式中，细胞治疗组合物以适于注射的剂型制备。出于这种目的，本发明的脂肪干细胞优选被溶解在药物学上可接受的水溶液中，或者以溶液状态冷冻。本发明的试剂盒可进一步包括可被使用以悬浮或稀释脂肪干细胞的所需药物学上可接受的载体。这样的载体的粒子包括蒸馏水、生理盐水、PBS以及类似物。

本发明的组合物可含有药物学上可接受的载体或者赋形剂，或者任何所需稳定剂或者防吸收剂，以提供适于给人或动物给药的药物学制剂。本发明的组合物可被制成注射液(例如用于皮下、真皮内、肌肉、静脉内和腹膜腔注射的注射液)的形式。当注射本发明的组合物时，可使用可减轻痛苦的镇痛剂，在需要时，还可使用合适装置。

本发明的细胞治疗组合物可被填充到细胞可在其中冰冻的注射器、装置、冷冻管中，或者含有液体药物的包括橡皮塞和铝盖的无热源玻璃瓶中。

作为装置，可使用注射器或者多头注射器(multi-syringe)，并且在肢体缺血疾病的情况下，考虑到细胞被给药的部位或者肌肉的深度，在细胞给药过程中可使痛苦最小化而不会由于细胞剪切而引起细胞损伤的20～30号针(gauge needle)被使用。而且，注射器或装置由不影响细胞活力的材料制成。

如果需要，根据给药模式以及制剂，本发明的细胞治疗组合物可含有至少一种选自下面的物质：悬浮剂、溶解剂、稳定剂、等渗剂、防腐剂、防吸收剂、表面活性剂、稀释剂、载色剂、pH调节剂、镇痛剂、缓冲剂、含硫还原剂和抗氧化剂。

悬浮剂的例子可包括甲基纤维素，聚山梨醇酯80，羟甲基纤维素，阿拉伯胶，黄蓍胶粉，羧甲基纤维素钠，聚氧乙烯去水山梨醇月桂酸酯等等。溶解剂包括聚氧乙烯氢化蓖麻油，聚山梨醇酯80，烟碱，聚氧乙烯去水山梨醇月桂酸酯，Macrogol和蓖麻油脂肪酸乙酯。稳定剂包括右旋糖酐40，甲基纤维素，白明胶，亚硫酸钠，焦亚硫酸钠等等。等渗剂的例子是D-甘露醇和山梨醇。

保护剂的例子包括甲基对羟基苯甲酸，乙基对羟基苯甲酸，山梨酸，苯酚，甲苯酚以及氯甲酚。防吸收剂的例子包括人血清蛋白，卵磷脂，右旋糖酐，环氧乙烷-环氧丙烯共聚物，羟丙烯纤维素，甲基纤维素，聚氧乙烯氢化蓖麻油和聚乙烯甘油。

含硫还原剂包括N-乙酰半胱氨酸，N-乙酰基高半胱氨酸，硫辛酸，硫二甘醇，硫代乙醇胺，硫代甘油，硫代山梨醇，硫代羟基乙酸以及其盐，硫代硫酸钠，谷胱甘肽和含巯基化合物诸如具有1到7个碳原子的硫代烷醇酸。

抗氧化剂包括例如异抗坏血酸，二丁羟基甲苯，丁羟基苯甲醚，α-生育酚，醋酸生育酚，L-抗坏血酸及其盐，L-抗坏血酸软脂酸酯，L-a抗坏血酸硬脂酸酯，亚硫酸氢钠，硫酸钠，没食子酸三戊酯，没食子酸丙酯或者螯合剂诸如乙二胺四乙酸二钠(EDTA)，焦磷酸钠和偏磷酸钠。低温防腐剂包括例如DMSO、甘油等。

此外，本发明的组合物可包括常规添加剂，诸如无机盐，包括氯化钠、氯化钾、氯化钙、磷酸钠、磷酸钾和碳酸氢钾，以及有机盐，包括柠檬酸钠、柠檬酸钾和醋酸钠。

特别是，目前的细胞治疗剂在冷藏条件下悬浮并储存在生理盐水中的情况下，当它们储存48小时或者更久时，难以显示超过70％的细胞活性；但是，在本发明的含有人脂肪组织来源的间充质干细胞的细胞治疗组合物的情况下，当将蔗糖或者白蛋白加入到组合物中时，显示超过70％的细胞活性，甚至当其储存48～72小时时也是如此，表明其具有改善的稳定性。而且，在本发明的组合物的情况下，观察到甚至当使用Hartman-D或者PBS而不是生理盐水作为基质时，细胞活性也没有明显差别，蔗糖或者白蛋白的加入改善了治疗组合物的稳定性。

此外，当本发明的含有来自脂肪组织的干细胞的细胞治疗组合物在冷冻储藏条件下储存时，含有生理盐水、蔗糖、白蛋白和低温保护剂DMSO的组合物在融化时显示最高活性，并且观察到白蛋白和糖成分加入到细胞治疗组合物中在冷冻和融化过程中保护了细胞，以改善细胞活性。

实施例

下面，将参照实施例进一步详细描述本发明。对本领域技术人员来说容易想到的是，这些实施例仅仅是用于说明的目的，而不解释为对本发明的范围的限制。

实施例1：来自脂肪组织的多潜能干细胞的分离

通过腹部抽脂术得到脂肪组织，并使用PBS洗涤然后进行微细切割。切割的组织在添加了1型胶原酶(1mg/ml)的DMEM培养基中在37℃下消解2小时。消解的组织使用PBS洗涤然后1000rpm离心5分钟。吸去上清液，并使用PBS洗涤保留在底部的微团，然后1000rpm离心5分钟。将得到的微团经100μm筛过滤以除去碎片，接着使用PBS洗涤。得到的细胞在DMEM培养基(10％FBS，2mM NAC，0.2mM抗坏血酸)中孵化。经过一夜的时间之后，使用PBS洗去未附着的细胞，并在角化细胞-SFM培养基(含有2mM NAC，0.2mM抗坏血酸，0.09mM钙，5ng/ml rEGF，50μg/ml BPE，5μg/ml胰岛素和74ng/ml氢化可的松)中培养，同时以两天为间隔更换培养基，从而分离多潜能干细胞(图1)。图1显示了以100×放大倍数摄取的上述分离的来自人脂肪组织的多潜能干细胞的照片。

实施例2：来自脂肪组织的多潜能干细胞的免疫性质

使用PBS洗涤并使用酪蛋白处理在实施例1中得到的来自脂肪组织的多潜能干细胞。收集处理的细胞并1000rpm离心5分钟。弃去上清液，然后使用2％FBS和PBS的混合物洗涤，1000rpm离心5分钟。弃去上清液，将细胞悬浮在PBS中，并对于每个样品将1×10⁵细胞分散到细胞板中。将抗体(R-藻红蛋白-结合的鼠抗人单克隆抗体)放置到每个孔中并在冰上孵化40分钟。孵化之后，将培养基1000rpm离心5分钟。除去上清液并使用PBS洗涤细胞两次。洗涤后，将细胞使用1％多聚甲醛固定，然后使用流式细胞计数器分析多潜能干细胞的表面抗原(表1和图2)。

表1：来自脂肪的干细胞的表面抗原的FACS分析。

  表面抗原  AD-MSCs  CD73  +  CD90  +  CD29  +  CD44  +  CD105  +  CD33  -  CD34  -  CD45  -  CD4  -

  表面抗原  AD-MSCs  CD31  -  CD62p  -  CD14  -  HLA-DR  -

结果，如表1所示，根据本发明的来自脂肪组织的成人干细胞显示了对CD7391％、对CD9097％、对CD2996％、对CD4483％和对CD10580％的阳性应答。而且，本发明的干细胞显示了对所有CD33，CD34、CD45、CD4、CD31、CD62p、CD14和HLA-DR的阴性免疫应答。

实施例3：来自人脂肪组织的多潜能干细胞球制剂

将在实施例1中得到的来自人脂肪组织的多潜能干细胞储存在盐溶液、盐溶液+蔗糖、盐溶液+蔗糖+50％白蛋白和PBS+蔗糖条件下，然后检查它们的球形成能力。

将5×10⁴～1×10⁵/ml在实施例1中得到的来自人脂肪组织的多潜能干细胞接种到含有添加了10μM CORM-2，5ml抗菌素抗真菌素溶液(100×)，1μg/ml皮质醇，5μg/ml胰岛素，20ng/ml EGF，40ng/ml FGF、B27和β-巯基乙醇的无血清MEBM培养基的6孔板的每个孔中。结果，接种3～7天之后细胞开始形成球形，如图3所示，甚至在接种7～10天后细胞增殖形成球形。

实施例4：来自脂肪组织的干细胞的体外血管形成效果检查

使用暴露或未暴露于5达因/cm²剪切应力(血管内剪切应力)的细胞通过体外管形成测定检查来自脂肪组织的间充质干细胞是否形成血管。

出于该目的，将Matrigel(Chemicon，USA)加热并溶解，然后将溶解的凝胶加入到96-孔板并在室温下固化大约1小时。然后，将在实施例1中得到的来自人脂肪组织的多潜能干细胞以1×10⁴个细胞/孔的浓度分散在多孔板中，并使用EGM-2MV(Clonetics，USA)孵化5天，检查孵化的细胞是否分化成血管内皮细胞。结果，如图4所示，观察到当暴露于剪切应力时，本发明的来自脂肪组织的间充质干细胞分化成血管内皮细胞，形成类似于血管网络的结构。

实施例5：来自脂肪组织的体内血管形成效果的检查

5-1：鼠缺血性模型的构建

通常将8周大之后的裸鼠麻醉，切割左腿的中线，分离并结扎股动脉以及它们的侧枝。然后，完全除去左侧股动脉，从而形成缺血性下肢模型。

5-2：鼠缺血性模型中来自脂肪组织干细胞的血管形成效果

在实施例5-1中构建的鼠缺血性模型形成之后24小时，根据细胞浓度将鼠模型分成3组：LD组(1×10⁶个细胞/kg)，MD组(5×10⁶个细胞/kg)和HD组(1×10⁷个细胞/kg)。然后，将细胞肌肉注射到鼠的缺血性部位。

下肢去除是否发生被连续观察，细胞治疗之后4周通过激光多普勒灌流成像来评估鼠中血流的改进程度。结果，在仅仅注射盐溶液的阴性对照组中，下肢去除发生，并且在激光多普勒灌流图像中能够观察到注射细胞的浓度越高，血流越平缓(图5)。当依据激光多普勒灌流比分析血流的改进程度时，与注射盐溶液作为对照组相比，注射了来自脂肪组织的干细胞的组在血流方面显示了剂量依赖性改进。

实施例6：用于冷藏的干细胞治疗组合物的制剂例子

在用于大约4℃下冷藏直到它们被注射给药的制剂中，根据生理盐水、Hartman-D溶液、PBS和蔗糖作为用于保持细胞活力的等渗溶液的细胞活力被检查。而且，为了建立在冷藏过程中其中的细胞不凝集或沉淀的条件，EDTA和人血清白蛋白的含量增加和降低对细胞活力的影响被检查(表2)。

结果，与其中细胞被单独储存在生理盐水、Hartman-D溶液或者PBS中的情况相比，在包括蔗糖作为等渗剂、血清白带白作为放吸收剂或者EDTA的制剂的情况下现实更高的细胞活力，并且细胞不发生凝集。

表2：冷藏条件下的细胞活力

 细胞活力(％)  0  3  6  9  12  24  48  72 生理盐水  97.1  96.3  93.2  90.9  89.2  86.9  70.3  57.2 生理盐水+1％蔗糖  97.8  92.4  93.1  88.8  84.2  71.5  67.2  59.0 生理盐水+2％蔗糖  97.9  92.2  89.4  89.6  79.9  77.4  78.9  64.9 生理盐水+10％蔗糖  98.7  93.9  88.3  89.0  83.0  73.3  75.5  63.8 生理盐水+2％蔗糖+2％血清白蛋白  97.8  98.0  95.5  90.8  82.4  83.3  71.5  72.1 生理盐水+2％蔗糖+5％血清白蛋白98.396.995.786.185.580.678.475.0 生理盐水+2％蔗糖+5％血清白蛋白+1mMEDTA99.095.594.392.193.081.783.379.7 生理盐水+2％蔗糖+2％血清白蛋白+10mMEDTA97.795.396.093.988.883.284.578.6 PBS  99.1  94.5  91.2  89.3  90.7  85.5  69.2  54.8 PBS+2％蔗糖  97.6  90.2  89.5  79.4  82.1  83.7  72.0  65.2

 细胞活力(％)  0  3  6  9  12  24  48  72 PBS+2％蔗糖+5％血清白蛋白  98.4  89.5  92.2  86.1  83.2  81.7  77.9  70.1 Hartman-D  99.4  90.0  91.5  82.2  81.9  70.2  55.3  54.9 Hartman-D+2％蔗糖  97.2  92.1  84.0  86.7  83.3  79.2  72.9  71.2 Hartman-D+2％蔗糖+5％血清白蛋白97.793.887.379.280.981.375.071.4

实施例7：用于冻藏的干细胞治疗组合物的制剂例子

在包括除生理盐水作为基质之外的各种添加剂包括低温防腐剂的各种制剂中的细胞活性被检查以便确保本发明的干细胞治疗组合物在干细胞治疗组合物的冷藏过程中的冻融稳定性。

通过添加了生理盐水、Hartman-D溶液或者PBS作为赋形剂、蔗糖或者甘露糖作为用于保持细胞活力的等渗溶液、在细胞低温保藏中使用的人血清白蛋白和DMSO得到的细胞活力在冻融后被观察。

结果观察到，在包括作为基质的生理盐水、PBS或者Hartman-D溶液，2％的蔗糖和5％的白蛋白的制剂中和除了这些物质之外还包括低温保护器DMSO的制剂中，冷冻储存条件下的细胞活力进一步增加(表3)。

表3：冷冻储存条件下的细胞活力

  细胞活力(％)  0  24h  48h  72h  生理盐水  97.1  82.3  80.0  81.3  生理盐水+2％蔗糖  97.9  78.9  81.3  82.2  生理盐水+10％DMSO  96.6  87.5  86.5  80.9  生理盐水+2％蔗糖+5％白蛋白98.380.484.283.1  生理盐水+2％蔗糖+5％白蛋白+10％DMSO97.789.787.988.0

  细胞活力(％)  0  24h  48h  72h  生理盐水+2％甘露糖  98.1  83.0  80.1  79.8  生理盐水+2％甘露糖+5％白蛋白97.387.783.482.1  生理盐水+2％甘露糖+5％白蛋白+10％DMSO98.586.487.387.9  PBS  99.1  82.3  79.0  77.4  PBS+2％蔗糖  97.2  87.2  78.0  83.5  PBS+10％DMSO  97.6  84.8  86.5  82.3  PBS+2％蔗糖+5％白蛋白  98.4  83.2  81.8  81.0  PBS+2％蔗糖+5％白蛋白+10％DMSO98.086.279.385.4  Hartman-D  99.4  73.6  69.9  65.4  Hartman-D+2％蔗糖  97.2  70.2  78.9  73.2  Hartman-D+10％DMSO  98.0  84.2  83.7  81.1  Hartman-D+2％蔗糖+5％白蛋白97.787.176.679.3  Hartman-D+2％蔗糖+5％白蛋白+10％DMSO96.988.083.287.3

工业实用性

如上面详细描述的那样，本发明提供了用于治疗缺血性疾病的细胞治疗组合物，其含有来自人脂肪组织的间充质干细胞作为活性成分。根据本发明的细胞治疗剂诱导了在缺血性病变中封闭血管周围的血管形成以加速血流，因此对于治疗缺血性疾病是有效的。

虽然已经参照特定特征对本发明进行了详细描述，但对于本领域技术人员来说显而易见的是，该描述仅仅用于优选实施方式，而不是限制本发明的范围。因此，本发明的实际范围由所附的权利要求书及其等同物来限定。