SX1近交系小鼠的DNA分子标记及其应用

摘要

本发明通过筛选SSR分子标记，获得山西省自行培育的SX1近交系小鼠特异的4个SSR位点条带，经对其克隆、测序和同源比较，获得该小鼠4个SSR位点的DNA序列，该序列可作为分子遗传学标记，用于SX1近交系小鼠的鉴定。本发明克服了常规形态标记，细胞标记及生化标记鉴定方法的不足，提供了对实验动物小鼠快速、准确鉴定的分子标记方法。

说明书

技术领域

本发明涉及DNA序列，具体涉及山西省自行培育的SX1近交系小鼠微卫星(SSR)位点DNA分子标记及其应用。

背景技术

实验动物在生物医学和科学研究领域的应用日益广泛，实验动物的标准化问题也亟待解决。预先了解不同品系或近交系的遗传纯度及背景信息，对于实验材料的选取和实验结果分析都有很大帮助。国内外针对近交系实验动物的遗传质量控制均制定了相应的检测标准，但检测方法多集中于形态学、染色体及蛋白水平。对于毛色相同的小鼠形态学鉴定较为困难，而染色体和蛋白水平的鉴定所需样本量大，对饲养成本较大的近交系小鼠难以普及应用。

发明内容

本发明的目的是从小鼠基因组中克隆出SX1近交系小鼠特异的SSR位点，并用于SX1近交系小鼠鉴定。

本发明通过大量筛选SSR分子标记，获得4个SX1近交系小鼠的SSR位点特征性DNA条带，经对其克隆、测序和同源比较，确定D2Mit17，D9Mit18，D12Mit136和DXMit186四个位点的特征性DNA序列，这些位点DNA序列可作为分子遗传学标记，用于SX1近交系小鼠鉴别。

本发明获得的SX1近交系小鼠DNA分子标记，由核苷酸序列1、序列2、序列3和序列4组成(见序列表)。

本发明发现该小鼠在4个位点D2Mit17，D9Mit18，D12Mit136和DXMit186的微卫星片段长度与两个国际标准品系BALB/c和C57BL/6在这些位点的片段长度不一致。经进一步的克隆、测序，获得SX1近交系小鼠在这些位点的特征性序列信息：D2Mit17包含28个TG重复单元和19个AG重复单元；D9Mit18包含20个GT重复单元；D12Mit136包含28个CA重复单元；DXMit186包含23个CA重复单元。

用4个SSR位点引物来扩增小鼠尾尖基因组DNA样本，经8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)筛选，克隆测序，若获得4个特征性序列，为SX1近交系小鼠。

这4个SSR位点引物如下：

D2Mit17

上游引物AGGCAATTACAAGGCCTGG

下游引物CACCCATCTCCCTCAGTCAT

D9Mit18

上游引物TCACTGTAGCCCAGAGCAGT

下游引物CCTGTTGTCAACACCTGATG

D12Mit136

上游引物TTTAATTTTGAGTGGGTTTGGC

下游引物TTGCTACATGTACACTGATCTCCA

DXMit186

上游引物ATCAATGCATAGTATTTGGGCC

下游引物AATTTGTCACTGCGGGTAGG

本发明克服了常规形态标记，细胞标记及生化标记鉴定方法的不足，提供了对实验动物小鼠快速、准确鉴定的分子标记方法。

具体实施方式

实施例1SX1近交系小鼠SSR位点DNA分子标记序列获得及应用

1、采用常规酚-氯仿法提取SX1近交系小鼠及两个标准品系BALB/c，C57BL/6尾尖总基因组DNA。即剪取小鼠尾尖2-3mm，9g/L生理盐水洗净，剪碎，加入360μl TES，40μl10％SDS，4μl Proteinase K(20mg/μl)，4μl RNase(10mg/μl)，充分混匀后，55℃消化过夜。加入等体积饱和酚(pH7.6)缓慢混匀20min。10,000r/min离心10min。取上清液于另一EP管中，加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)缓慢抽提20min，10,000r/min离心10min。取上清液于另一EP管中，加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)缓慢抽提20min，10,000r/min离心10min。取上清液于另一EP管中，加入2倍体积预冷无水乙醇-20℃放置2h。10,000r/min离心5min。DNA沉淀于管底，用70％预冷乙醇洗涤2次。37℃烘干。溶于适量TE。

2、参照相关数据库Mouse Genome Database(http//www.informatics.jax.org)，获得19对微卫星引物并由上海英潍捷基生物有限公司合成。

3、PCR反应体系优化。本发明采用梯度PCR法对PCR反应体系和循环程序进行优化。PCR循环体系为：94℃预变性3min后，经94℃45s，50-65℃1min，72℃90s，循环40次，最后72℃延伸10min，10℃保存。

4、PCR产物的检测。用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)经溴化乙锭染色后，凝胶呈象做进一步的分型验证。根据聚丙烯酰胺凝胶上DNA泳动距离进行结果判读，泳动距离最长的带设定英文字母a，依次为b，c，d……。若发现SX1在某一SSR位点的扩增片段与两标准品系不同。就将该位点的PCR扩增产物回收。

5、PCR产物回收。依据以上方法选择回收4个微卫星位点的扩增产物，应用DNA胶回收试剂盒回收PCR产物。

6、应用DNA重组技术回收克隆DNA序列。将回收产物插入pGEM-T easy vector，转化大肠杆菌进行克隆，酶切验证后送往北京奥科生物公司测序，进一步对序列在NCBI上做Blast分析。

(1)在0.5ml低DNA结合力的离心管中按照T载体说明将回收DNA条带与T载体连接，具体连接步骤如下：10μl反应体系中含有5μl T₄ DNA连接酶2×快速连接缓冲液，1μlpGEM-T Easy vector(50ng)，3μl PCR产物，1μl T₄ DNA连接酶(3Weiss/μl)。用移液器吹打连接反应液使之混匀，4℃孵育过夜，待用。

(2)转化反应和细菌培养

1)从-70℃冰箱中取出50μl感受态细胞DH5α，冰水解冻，轻掸管壁以混匀细胞；

2)短暂离心连接反应管(4,000g，30s)，取一半体积的连接反应物于解冻后的感受态细胞中，轻掸混匀，冰水浴30min；

3)取出离心管，于42℃水浴50-90s；

4)冰水浴2min；

5)离心管中加入950μl SOC液体培养基；

6)37℃，温和地振摇1.5h(150转/分)，使细菌复苏，并使质粒编码的抗性基因表达；

7)1,000g，常温10min离心，倒去绝大部分上清液(留存150μl左右)，重新温和地悬浮细菌，涂于预先处理好的平板培养基上(提前半小时涂100μl 100mM IPTG和20μl50μg/ml X-gal于平板培养基中)。待吸收后倒置放入37℃烘箱中，16h左右观察蓝、白菌落，可置4℃短期保存待用；

8)取经灭菌的试管若干，加入约4ml左右的液体LB培养基(含0.1％氨苄抗生素)；

9)用灭菌牙签小心挑取白色菌落，丢于试管中；

10)37℃，250转/分振荡培养过夜，至溶液混浊。

(3)应用酶切鉴定法进一步鉴定阳性克隆子。方法与步骤：质粒回收，经蓝白斑和氨苄筛选，重组质粒扩大培养，采用上海华舜生物工程有限公司的产品小量质粒快速抽提纯化试剂盒按照其步骤回收质粒；将获得的质粒用EcoR I进行酶切鉴定，10ul的酶切体系中含有：1ul 10×buffer，5ul PCR product，0.208ul EcoR I(12U/ul)和3.792ul H₂O。37℃温浴120min，取5ul用于1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。根据酶切的DNA片段长度与回收是DNA片段长度相一致的确定为阳性克隆。

(4)将含有目的片段的菌液约1.5ml送往北京奥科生物公司进行测序。在获得的DNA序列两端找到PCR扩增时采用的特异引物序列，进一步确定阳性克隆的真实性。

7、序列分析。对获得的DNA序列，在NCBI网站Mouse Genome Resources中进行BlastN搜索，确定为SX1小鼠微卫星位点序列。

8、SSR位点序列用于SX1近交系小鼠鉴定

(1)参照相关数据库Mouse Genome Database(http//www.informatics.jax.org)获得4个微卫星位点引物(D2Mit17，D9Mit18，D12Mit136和DXMit186)。这4个微卫星位点引物如下：

D2Mit17

上游引物AGGCAATTACAAGGCCTGG

下游引物CACCCATCTCCCTCAGTCAT

D9Mit18

上游引物TCACTGTAGCCCAGAGCAGT

下游引物CCTGTTGTCAACACCTGATG

D12Mit136

上游引物TTTAATTTTGAGTGGGTTTGGC

下游引物TTGCTACATGTACACTGATCTCCA

DXMit186

上游引物ATCAATGCATAGTATTTGGGCC

下游引物AATTTGTCACTGCGGGTAGG

(2)采用常规酚-氯仿法提取SX1近交系小鼠尾尖总基因组DNA，利用PCR法获得以上4个SSR位点的PCR产物。PCR循环体系为：94℃预变性3min后，经94℃45s，57-61℃1min(D2Mit17，DXMit186，57℃；D9Mit18，61℃；D12Mit136，59℃)，72℃90s，循环40次，最后72℃延伸10min，10℃保存。

将PCR产物回收，进行DNA重组，克隆转化及测序。如果获得如下特征性的序列片段即为SX1近交系小鼠。D2Mit17扩增片段长度233bp，序列特征(TG)28(AG)19；D9Mit18扩增片段长度206bp，序列特征(GT)20；D12Mit136扩增片段长度194bp，序列特征(CA)28；DXMit186扩增片段长度112bp，序列特征(CA)23。因此这4个微卫星位点可作为SX1小鼠鉴定。

SEQUENCE LISTING

<110>山西大学

<120>SX1近交系小鼠的DNA分子标记及其应用

<160>4

<210>1

<211>233

<212>DNA

<213>SX1近交系小鼠SSR位点D2Mi“7的DNA序列

<400>1

aggcaattac aaggcctggg agatggtcta aactttacag tttctcggct ggtgtggatg     60

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gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga    180

gagggagaga gggagagttc aggtgatgaa gagatgactg agggagatgg gtg           233

<210>2

<211>206

<212>DNA

<213>SX1近交系小鼠SSR位点D9Mit18的DNA序列

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<210>3

<211>194

<212>DNA

<213>SX1近交系小鼠SSR位点D12Mit136的DNA序列

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tttaattttg agtgggtttg gctcgcttta tctatctatc tatctatcta tctatctatc     60

tatctatcta tctatctatc tatctaatct atctatctac acacacacac acacacacac    120

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<210>4

<211>112

<212>DNA

<213>SX1近交系小鼠SSR位点DXMit186的DNA序列

<400>4

atcaatgcat agtatttggg cctacattag tgtttccccc aacacacaca cacacacaca     60

cacacacaca cacacacaca cacacacaga gttgatccta cccgcagtga ca            112