柯楠因在制备治疗心肌损伤性心脏病药物中的用途

摘要

本发明属制药领域，涉及钩藤生物碱提取物柯楠因在制备心肌损伤药物中的用途，尤其是在制备治疗缺血缺氧心肌损伤药物中的用途。本发明通过体外心肌细胞培养实验，结果表明柯楠因可以提高细胞存活率，促进NO生成；可降低缺氧缺糖损伤心肌细胞的LDH的漏出率；可提高SOD活性；可以抑制脂质过氧化以及具有抑制心肌细胞凋亡的作用。所述的柯楠因可作为治疗药物应用于治疗心肌损伤尤其是缺血缺氧心肌损伤心脏病。

说明书

技术领域

本发明属制药领域，涉及钩藤生物碱提取物柯楠因在制备靶器官保护药物中的用途，具体涉及柯楠因在制备治疗心肌损伤性心脏病药物中的用途。

背景技术

缺血缺氧心肌损伤，是近几十年来在发达国家和发展中国家导致死亡的首要原因。降低此类疾病的发病率和死亡率非常重要。心脏的内源性抗氧化系统包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)和其它抗氧化剂。体内活性氧(Reactive oxygen species，ROS)产生增加，超过了内源性抗氧化系统的清除能力，导致氧化应激，可加速人体的衰老、增加肿瘤的发生率，也可引起心血管系统的损伤，加重心肌破坏的程度。动脉粥样硬化、糖尿病、中风等疾病过程中，氧化应激的机制也不容忽视。

钩藤是茜草科植物钩藤、大叶钩藤、毛钩藤、华钩藤或无柄果钩藤的干燥带钩茎枝。已知钩藤性甘、凉。归肝、心包经。具有清热、平肝，息风定惊的功效。现有技术公开了钩藤具有持久、明确的降压作用。

柯楠因(Corynantheine)属吲哚类生物碱，是钩藤中的天然有机化合物，是中药钩藤生物碱提取物中的主要有效成分。文献报道柯楠因(Corynantheine)具有抑制利什曼原虫等活性。但至今未见有关Corynantheine对缺血缺氧损伤心肌细胞以及心肌损伤的作用的报道。

发明内容

本发明的目的是提供钩藤生物碱提取物柯楠因在制药中的新用途，具体涉及柯楠因在制备治疗心肌损伤性心脏病药物中的用途。尤其是在制备治疗缺血缺氧心肌损伤性心脏病药物中的用途。

本发明通过下述方法制备钩藤醇提取物柯楠因(碱)，

1)取正品钩藤，粉碎后加浓度大于70％的乙醇，加热提取数次，过滤，合并滤液；

2)滤液减压浓缩成稠浸膏，加0.1-10％盐酸溶解、洗涤，取滤液；

3)碱性条件下，滤液加氯仿数次萃取后合并氯仿液；

4)将氯仿液减压浓缩后得钩藤醇提取物；

5)经高压液相色谱仪检测，鉴定得式(I)结构的钩藤醇提取物柯楠因。

本发明所述的柯楠因(碱)分子式：C₂₂H₂₆O₃N₂，M＝366，结构如下述：

corynantheine

柯楠因(碱)

C₂₂H₂₆O₃N₂

M＝366

(I)

本发明进行了缺氧心肌细胞实验，检测了经柯楠因处理的缺氧心肌细胞的上清液，结果显示NO的浓度明显提高，表明柯楠因能促进体内NO的生成。

本发明通过体外心肌细胞培养实验，结果证实柯楠因能提高细胞存活率，促进NO生成；能降低缺氧损伤心肌细胞的LDH的漏出率；能提高SOD的活性；可以抑制脂质过氧化以及具有抑制心肌细胞凋亡的作用。

实验结果表明，本发明钩藤醇提取物柯楠因可作为药物制剂的原料。进一步制备治疗心肌损伤的药物。具体涉及制备缺氧缺糖心肌损伤心脏病的药物。

附图说明

图.1是柯楠因对缺氧缺糖6h损伤心肌细胞的存活率的影响，

其中，Control：正常对照组；Vehicle：模型组；a：模型组与正常对照组相比，p＜0.05；*：柯楠因各浓度处理组与模型组相比，p＜0.05。

图2是柯楠因对缺氧缺糖6h损伤心肌细胞的NO释放量的影响，

其中，Control：正常对照组；Vehicle：模型组，a：模型组与正常对照组相比，p＜0.05；*：柯楠因毛钩藤碱各浓度处理组与模型组相比，p＜0.05。

图3是柯楠因对缺氧缺糖6h损伤心肌细胞LDH漏出率的影响，

其中，Control：正常对照组；Vehicle：模型组；a：模型组与正常对照组相比，p＜0.05；*：柯楠因各浓度处理组与模型组相比，p＜0.05。

图4是柯楠因对缺氧缺糖6h损伤心肌细胞总SOD活力的影响。

其中，Control：正常对照组；Vehicle：模型组；a：模型组与正常对照组相比，p＜0.05；*：柯楠因各浓度处理组与模型组相比，p＜0.05。

图5是柯楠因对缺氧缺糖6h损伤心肌细胞MDA的影响，

其中，Control：正常对照组；Vehicle：模型组；a：模型组与正常对照组相比，p＜0.05；*：柯楠因各浓度处理组与模型组相比，p＜0.05。

图6是柯楠因对缺氧缺糖6h损伤心肌细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响，

其中，1：正常对照组(Control)；2：模型组(Vehicle)；3：柯楠因10^-5mol/l；4：柯楠因10^-6mol/l；5：柯楠因10^-7mol/l。

具体实施方式

实施例1柯楠因提高细胞存活率，促进NO生成实验

原代培养3日龄SD乳鼠，无菌条件下取心脏于PBS中清洗，剪碎，移入含有0.08％胰酶的三角烧瓶中37℃消化10分钟，持续磁力搅拌下共消化8次。每次消化后收集上清液，血清中止消化，2000转离心5分钟，收集细胞沉淀调细胞密度为10^-6，培养在含10％小牛血清的DMEM中，第三天用于实验。分为正常对照组(不给于药物干预，不缺氧缺糖)、模型组(不给于药物干预，缺氧缺糖6h复糖)、柯楠因药物组(分别给予药物10^-5mol/L、10^-6mol/L、10^-7mol/L缺氧缺糖6h)。MTT法检测细胞存活率，结果如图1所示，模型组存活率明显低于正常对照组，柯楠因各浓度均能明显提高细胞存活率(单因素方差分析p＜0.05)。

取细胞上清液100μl，按NO试剂盒测定方法检测NO。如图2所示，模型组较正常对照组相比NO浓度明显下降(单因素方差分析p＜0.05)，而柯楠因各浓度均能明显提高上清液中H₂S浓度(p＜0.05)。

实施例2.柯楠因降低缺氧缺糖损伤心肌细胞的LDH的漏出实验

每组(n＝6)每个样本取10⁶个细胞，充分裂解，丙酮酸法检测细胞内LDH的含量，正常对照组细胞内LDH为100％，各浓度用药组与模型组细胞内LDH与正常对照组的差值为LDH漏出率，在反应体系中产生1μmol丙酮酸为1单位，计算每单位/mg蛋白。结果如图.3所示，各浓度用药组的LDH漏出率较模型组均明显降低。

实施例3.柯楠因提高SOD活性实验

羟胺法检测SOD，每毫克组织蛋白在1ml反应液中SOD抑制率达50％时所对应的SOD量为一个SOD活力单位(U)。结果显示总SOD如图4所示，柯楠因各浓度用药组均能够明显提高总SOD的活力，较模型组显著升高(p＜0.05)。

实施例4.柯楠因抑制脂质过氧化实验

氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，并因此产生脂质过氧化物丙二醛(MDA)。MDA可与硫代巴比妥酸(TBA)缩合，形成红色产物，在532nm处有最大吸收峰。如图5所示，模型组MDA含量显著增高(p＜0.05与正常对照组相比)。柯楠因各浓度处理组较模型组均明显降低，证实柯楠因可抑制活性氧诱导的脂质过氧化。

实施例5.柯楠因可提高Bcl-2和降低Bax蛋白水平的表达

模型组Bcl-2蛋白表达水平显著降低、Bax蛋白水平显著增加(p＜0.05与正常对照组相比)，柯楠因各浓度处理组较模型组均明显增加Bcl-2蛋白表达水平和降低Bax蛋白水平的表达。柯楠因在蛋白水平降低了凋亡相关因子Bax，提高抗凋亡因和子Bcl-2(图6)