推定的细胞激动素受体和其应用方法

摘要

一种调节植物中至少一种性状表达的方法，该方法包括调节植物对至少一种多肽的表达的步骤，其中所述多肽选自以下组成的组：i)包括根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽；ii)包括选自以下任何一种或多种氨基酸序列组成的组的氨基酸序列并能够调节植物中细胞激动素信号转导的多肽：从SEQ ID NO：1的氨基酸1至氨基酸7，从氨基酸9至氨基酸230，从氨基酸1至氨基酸58，从氨基酸77至氨基酸485，从氨基酸59至氨基酸76，从氨基酸150至氨基酸191，从氨基酸231至氨基酸405，和从氨基酸406至氨基酸438，或在其同系物的相当位置；iii)包括与根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列并能够调节植物中细胞激动素信号转导的多肽；和iv)由根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的多肽，其中调节所述多肽的表达调节了植物中至少一种性状的表达。

说明书

技术领域

本发明涉及调节植物中性状表达，所述性状诸如植株高度、植物生物 量(biomass)、顶芽发育、发枝、能育性、开花、叶面积、衰老、种子萌发、 种子产量、种子重量、茎发育、粮食产量(grain yield)、分蘖数、花分生组 织发育和根发育。本发明还涉及调节植物中性状表达的方法和材料。

背景

已知传统植物育种技术导致了农作物的改良。这些技术诸如选择性育 种和杂交，包括将来自植物的基因与不同遗传背景杂交以产生各种特征的 后代。选择这些后代以获得表达期望的性状的植物，且经过多次回交或自 交消除有害的性状以最终产生具有期望的特征的后代。尽管已经证明传统 育种方法可用于增强或改善多种作物的特征，但是这些方法包括使数百或 数千个基因杂交，而其中为改进的特征或性状仅选择了数个基因。而且， 这些方法花费许多年来杂交、从大量后代群体选择大量株系并将其回交数 代以获得期望的性状。一些不期望的性状也可能出现在植物中，因为使用 传统育种方法通常难以选择一种性状而不影响其它性状。

传统植物选择的另一缺点是育种局限于性相容(sexually compatible)的 植物，且因此传统育种方法通常由于特定物种的种质中缺少遗传多样性而 受限。而且，已经证明传统育种方法在改良许多多基因性状诸如增加的疾 病抗性时相当无效。

尽管近年来作物产量有相当可观的进展，但仍需要实现主要粮食作物 的显著改良以满足全球的需求。包括在作物中表达单个转基因的植物生物 技术的最新进展已经导致成功地商业上引入新的植物性状诸如除草剂抗 性、昆虫抗性和病毒抗性。然而，有显著价值的单基因性状的名单相对较 少，因此作物中单个转基因表达对于改良作物不实用。

近年来，已经尝试分离各种植物物种中的一些已知化学地修饰植物中 的DNA序列的基因，从而可表征在植物形态学中的作用。一种已知的方 法包括分离S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶(SAHH)基因，该酶是已知调节 DNA甲基化的关键酶。尽管在植物中观察到一些形态学变化，但这些表型 性状都被证明不能对改进不同植物中作物产量有显著益处。由于SAHH基 因和下游分子之间相互作用的复杂性，对涉及DNA甲基化和基因表达的 机制了解匮乏，并因此限制了改良作物的现有方法。

因此，需要提供新方法来克服或至少改善上述缺点中的一种或多种。 需要产生具有可用于改良作物和其它商业和科学应用的性状的植物的新 方法。

概述

本发明人鉴定了包括根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽，其参 与植物中细胞激动素信号转导途径。细胞激动素是在响应性植物细胞中发 挥作用以提供特殊生物化学和生理作用的植物激素(或植物的激素)。植物 激素首先被特殊受体识别，所述受体开始激素信号的转导以刺激对植物生 长和发育重要的细胞响应。尽管激素受体在从开花植物到人类的许多真核 生物中已经广泛研究，但仍缺少对植物激素受体的详尽理解。已怀疑植物 激素结合蛋白提供了这种受体的候选物。

本发明人鉴定了当减少包括根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽 表达时，单子叶和双子叶物种中植物生物量和作物产量的显著增加。相反， 增加包括根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽的表达在一些植物提供 提早的开花。因此，可操纵包括根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽 的表达以获得对于改良作物和其它商业和科学应用重要的期望的性状。

因此根据本发明的第一方面，提供一种调节植物中至少一种性状表达 的方法，该方法包括调节植物对至少一种多肽的表达的步骤，其中所述多 肽选自以下组成的组：

i)包括根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽；

ii)包括选自以下任何一种或多种氨基酸序列组成的组的氨基酸序列 并能够调节植物中细胞激动素信号转导的多肽：从SEQ ID NO：1的氨基 酸1至氨基酸7，从氨基酸9至氨基酸230，从氨基酸1至氨基酸58，从 氨基酸77至氨基酸485，从氨基酸59至氨基酸76，从氨基酸150至氨基 酸191，从氨基酸231至氨基酸405，和从氨基酸406至氨基酸438，或在 其同系物的相当位置；

iii)包括与根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％序列同一 性的氨基酸序列并能够调节植物中细胞激动素信号转导的多肽；和

iv)由根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的多肽，

其中调节所述多肽的表达调节了植物中至少一种性状的表达。

在一实施方案中，调节植物对所述多肽的表达是通过将调节所述多肽 表达的至少一种多核苷酸引入所述植物的一个或多个细胞。

在另一实施方案中，提供如上限定的方法，其中调节多肽表达的步骤 包括减少所述多肽的表达。减少植物对多肽的表达的步骤可包括将减少所 述多肽表达的多核苷酸引入植物的一个或多个细胞。在一实施方案中，该 多核苷酸选自以下组成的组：

i)包括根据SEQ ID NO：15的核酸序列的反义多核苷酸；

ii)包括选自根据SEQ ID NO：15的核酸序列的至少15个相邻核酸残 基的反义多核苷酸；

iii)包括来自与编码一种多肽的核酸序列互补的多核苷酸的至少15个 相邻核酸残基的反义多核苷酸，所述多肽包括与根据SEQ ID NO：1的氨 基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；

iv)包括含有至少9个相邻核酸残基的核酸序列的RNA干扰的多核苷 酸，所述至少9个相邻核酸残基选自与由根据SEQ ID NO：15的核酸序列 组成的多核苷酸互补的核酸序列；和

v)由根据SEQ ID NO：15的核酸序列组成的反义多核苷酸。

在一实施方案中，所述多肽包括与根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列 具有至少80％序列同一性的氨基酸序列并能够调节植物中细胞激动素信号 转导。在另一实施方案中，所述多肽包括与根据SEQ ID NO：1的氨基酸 序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列并能够调节植物中细胞激动素 信号转导。在又另一实施方案中，所述多肽包括与根据SEQ ID NO：1的 氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列并能够调节植物中细胞 激动素信号转导。在又进一步实施方案中，所述多肽包括与根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列并能够调节植 物中细胞激动素信号转导。

在一实施方案中，提供如上限定的方法，其中调节所述多肽表达的步 骤包括增加所述多肽表达。增加植物对所述多肽的表达的步骤可包括将增 加所述多肽表达的多核苷酸引入所述植物的一个或多个细胞。在一实施方 案中，该多核苷酸选自以下组成的组：

i)包括编码SEQ ID NO：1的多肽的核酸序列的多核苷酸，

ii)编码包括选自以下任何一种或多种氨基酸序列组成的组的氨基酸 序列并能够调节植物中细胞激动素信号转导的多肽的多核苷酸：从SEQ ID NO：1的氨基酸1至氨基酸7，从氨基酸9至氨基酸230，从氨基酸1至 氨基酸58，从氨基酸77至氨基酸485，从氨基酸59至氨基酸76，从氨基 酸150至氨基酸191，从氨基酸231至氨基酸405，和从氨基酸406至氨 基酸438，或在其同系物的相当位置；和

iii)编码包括与根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％序列 同一性的氨基酸序列并能够调节植物中细胞激动素信号转导的多肽的多 核苷酸。

在某些实施方案中，部分ii)的多核苷酸编码的多肽包括胞内信号转导 域。在某些实施方案中，部分ii)的多核苷酸编码的多肽包括胞外细胞激动 素结合域。

在一实施方案中，植物中至少一种性状选自植株高度、植物生物量、 顶芽发育、发枝、能育性、开花、叶面积、衰老、种子萌发、种子产量、 种子重量、茎发育、粮食产量、分蘖数、花分生组织发育和根发育的任何 一种或多种组成的组。

在一实施方案中，如上限定的减少多肽表达导致植物中性状表达改 变，包括但不限于与其中所述多肽的表达未被调节的相同类型植物相比 时，所述植物中增加的发枝、提高的种子产量、提高的植物生物量、提高 的粮食产量、增加的分蘖数、增加的叶面积、延迟的种子萌发、减少的顶 端优势和延迟的开花的任何一种或多种或其组合。

在另一实施方案中，多肽表达增加调节至少一种性状，所述性状选自 相对于其中所述多肽的表达未被调节的相同类型植物，所述植物中提早的 开花、矮小、减少的叶数目、早衰、提早的种子萌发、延迟和减少的莲座 叶形成、增加的幼苗根生长的任何一种或多种或其组合组成的组。

植物生物量增加可有用于增加叶类蔬菜的产量和品质。增加的发枝和 生物量累积还可有用于生产牧草和各种谷类作物。植物生物量增加可导致 丰富的可用作生物燃料的来源的纤维素乙醇(诸如生物乙醇)。

也预期植物生物量的增加促进更有效地施用植物肥料。因此，植物生 物量增加可防止诸如肥料流失等环境问题，肥料流失会导致多种环境问题 诸如藻华。

而且，多肽的表达增加可导致植物诸如甘蔗提早开花。由于在常规植 物育种实践中可帮助植物育种者，这可有用于商业栽培品种。类似地，多 肽的表达增加造成的矮小表型在产生观赏植物方面也可为期望的。

在第二方面，提供一种分离的多核苷酸，其选自以下组成的组：

i)包括根据SEQ ID NO：15的核酸序列的反义多核苷酸；

ii)包括选自根据SEQ ID NO：15的核酸序列的至少15个相邻核酸残 基的反义多核苷酸；和

iii)包括来自与编码一种多肽的核酸序列互补的多核苷酸的至少15个 相邻核酸残基的反义多核苷酸，所述多肽包括与根据SEQ ID NO：1的氨 基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；

iv)包括包含选自根据SEQ ID NO：15的核酸序列的至少9个相邻核 酸残基的核酸序列的RNA干扰的多核苷酸；和

v)由根据SEQ ID NO：15的核酸序列组成的反义多核苷酸；

其中所述多核苷酸能够降低调节植物中至少一种性状的多肽的表达， 或

vi)与i)至v)的任一种多核苷酸互补的多核苷酸，或

vii)在严格性条件下与i)至v)的任一种多核苷酸杂交的多核苷酸。

根据第三方面，提供一种分离的多核苷酸，其选自以下组成的组：

i)包括编码SEQ ID NO：1的多肽的核酸序列的多核苷酸；

ii)编码包括选自以下任何一种或多种氨基酸序列组成的组的氨基酸 序列并能够调节植物中细胞激动素信号转导的多肽的多核苷酸：从SEQ ID NO：1的氨基酸1至氨基酸7，从氨基酸9至氨基酸230，从氨基酸1至 氨基酸58，从氨基酸77至氨基酸485，从氨基酸59至氨基酸76，从氨基 酸150至氨基酸191，从氨基酸231至氨基酸405，和从氨基酸406至氨 基酸438，或在其同系物的相当位置；

iii)编码包括与根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％序列 同一性的氨基酸序列并能够调节植物中细胞激动素信号转导的多肽的多 核苷酸；和

iv)由编码SEQ ID NO：1的多肽的核酸序列组成的多核苷酸；

其中所述多核苷酸能够增加调节植物中至少一种性状的多肽的表达， 或

v)与i)至iv)的任一种多核苷酸互补的多核苷酸；或

vi)在严格性条件下与i)至iv)的任一种多核苷酸杂交的多核苷酸。

根据第四方面，提供包括根据第二方面或第三方面的多核苷酸的载 体。

根据第五方面，提供以根据第二方面或第三方面的多核苷酸或根据第 四方面的载体转化的宿主细胞。

根据第六方面，提供包括根据第五方面的宿主细胞的植物。

根据第七方面，提供一种产生转基因植物的方法，其包括如下步骤：

(a)提供调节多肽的表达的多核苷酸，其中所述多肽选自以下组成的 组：

i)包括根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽；

ii)包括选自以下任何一种或多种氨基酸序列组成的组的氨基酸序列 并能够调节植物中细胞激动素信号转导的多肽：从SEQ ID NO：1的氨基 酸1至氨基酸7，从氨基酸9至氨基酸230，从氨基酸1至氨基酸58，从 氨基酸77至氨基酸485，从氨基酸59至氨基酸76，从氨基酸150至氨基 酸191，从氨基酸231至氨基酸405，和从氨基酸406至氨基酸438，或在 其同系物的相当位置；

iii)包括与根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％序列同一 性的氨基酸序列并能够调节植物中细胞激动素信号转导的多肽；和

iv)由根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的多肽；

(b)以步骤(a)的多核苷酸转化植物、植物部分或植物细胞，并

(c)栽培所转化的植物、植物部分或植物细胞以产生转基因植物。

在一实施方案中，第七方面的步骤(a)中的多核苷酸包括选自以下组成 的组的分离的多核苷酸：

i)包括根据SEQ ID NO：15的核酸序列的反义多核苷酸；

ii)包括选自根据SEQ ID NO：15的核酸序列的至少15个相邻核酸残 基的反义多核苷酸；和

iii)包括来自与编码一种多肽的核酸序列互补的多核苷酸的至少15个 相邻核酸残基的反义多核苷酸，所述多肽包括与根据SEQ ID NO：1的氨 基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；

iv)包括包含选自根据SEQ ID NO：15的核酸序列的至少9个相邻核 酸残基的核酸序列的RNA干扰的多核苷酸；和

v)由根据SEQ ID NO：15的核酸序列组成的反义多核苷酸；

其中所述多核苷酸能够调节调节植物中至少一种性状的多肽的表达， 或

vi)与i)至v)的任一种多核苷酸互补的多核苷酸，或

vii)在严格性条件下与i)至v)的任一种多核苷酸杂交的多核苷酸。

在另一实施方案中，第七方面的步骤(a)中的多核苷酸包括选自以下组 成的组的分离的多核苷酸：

i)包括编码SEQ ID NO：1的多肽的核酸序列的多核苷酸，

ii)编码包括选自以下任何一种或多种氨基酸序列组成的组的氨基酸 序列并能够调节植物中细胞激动素信号转导的多肽的多核苷酸：从SEQ ID NO：1的氨基酸1至氨基酸7，从氨基酸9至氨基酸230，从氨基酸1至 氨基酸58，从氨基酸77至氨基酸485，从氨基酸59至氨基酸76，从氨基 酸150至氨基酸191，从氨基酸231至氨基酸405，和从氨基酸406至氨 基酸438，或在其同系物的相当位置；

iii)编码包括与根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％序列 同一性的氨基酸序列并能够调节植物中细胞激动素信号转导的多肽的多 核苷酸；和

iv)由编码SEQ ID NO：1的多肽的核酸序列组成的多核苷酸，

其中所述多核苷酸能够增加调节植物中至少一种性状的多肽的表达， 或

v)与i)至iv)的任一种多核苷酸互补的多核苷酸，或

vi)在严格性条件下与i)至iv)的任一种多核苷酸杂交的多核苷酸。

在根据第七方面的方法的一实施方案中，步骤(c)中所述栽培是通过在 允许转化的植物、植物部分或植物细胞生长的条件下培养所述转化的植 物、植物部分或植物细胞。在某些实施方案中，所述植物部分选自根、茎、 叶、芽、花、茎干(shoot)、种子和枝的任何一种或多种组成的组。

在一实施方案中，提供根据第六方面的植物，其中所述植物是单子叶 植物。在另一实施方案中，提供根据第六方面的植物，其中所述植物是双 子叶植物。

在某些实施方案中，所述植物选自燕麦、大麦、小麦、黑麦、玉米、 水稻、高粱、黍(millet)、苋菜、芦苇、甜茅(sweet grass)、甘蔗、竹子、牧 草(fodder grass)、拂子茅(diamond grass)和草皮草(turfgrass)的任何一种或多 种组成的组。

根据第八方面，提供根据第七方面的方法产生的转基因植物，其中所 述植物选自燕麦、大麦、小麦、黑麦、玉米、水稻、高粱、黍、苋菜、芦 苇、甜茅、甘蔗、竹子、牧草、拂子茅和草皮草的任何一种或多种组成的 组。

在一实施方案中，该转基因植物能够产生能育的植物。

根据第九方面，提供如上限定的植物的部分或种子。所述部分可选自 根、茎、叶、芽、花、茎干、种子和枝的任何一种或多种组成的组。

根据第十方面，提供从如上限定的植物或如上限定的部分或种子再生 的植物或其繁殖材料。

根据第十一方面，提供以如上限定的多核苷酸转化的植物用于植物生 物量生产的应用。在某些实施方案中，所述植物选自燕麦、大麦、小麦、 黑麦、玉米、水稻、高粱、黍、苋菜、芦苇、甜茅、甘蔗、竹子、牧草、 拂子茅和草皮草的任何一种或多种组成的组。

根据第十二方面，提供根据第十一方面的应用，其中所述植物生物量 生产是为了生产生物燃料。

根据第十三方面，提供一种分离的多肽，其选自以下组成的组：

i)包括根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽；

ii)包括选自以下任何一种或多种氨基酸序列组成的组的氨基酸序列 并能够调节植物中细胞激动素信号转导的多肽：从SEQ ID NO：1的氨基 酸1至氨基酸7，从氨基酸9至氨基酸230，从氨基酸1至氨基酸58，从 氨基酸77至氨基酸485，从氨基酸59至氨基酸76，从氨基酸150至氨基 酸191，从氨基酸231至氨基酸405，和从氨基酸406至氨基酸438，或在 其同系物的相当位置；

iii)包括与根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％序列同一 性的氨基酸序列并能够调节植物中细胞激动素信号转导的多肽；和

iv)由根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的多肽，

其中调节所述多肽的表达调节了植物中至少一种性状的表达。 定义

本文所用的以下词和术语应具有所示的含义：

本文所用的术语“相邻”指分别存在于多肽或多核苷酸中的连续或不 间断的一系列氨基酸残基或核酸残基。例如，“相邻氨基酸残基”应理解 为包括至少约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约12、约15、约 20、约25、约30、约40、约50、约75、约100、约150、约200、约250、 约300、约350或约400、约450或约485个氨基酸左右的相邻氨基酸序 列。类似地，“相邻核酸残基”应理解为包括至少约12、约15、约18、约 21、约24、约27、约30、约36、约45、约60、约75、约90、约120、 约150、约225、约300、约450、约600、约750、约900、约1050、约 1200、约1350、约1450、约1550、约1650或约1775个核苷酸左右的相 邻核酸序列。

术语“细胞激动素信号转导”指分子跨细胞膜传播胞外信号到变成胞 内信号。随后该信号可刺激细胞响应。参与细胞激动素信号转导过程的多 肽分子通常是受体和非受体蛋白激酶、受体和非受体蛋白磷酸酶、以及转 录因子。细胞激动素信号转导活性可通过测量植物中表达的细胞激动素水 平或通过测量细胞激动素和参与细胞激动素信号转导过程的多肽分子之 间的结合活性来测量。

术语“杂交”当提到核酸时指其中两条单链多核苷酸非共价地结合以 形成稳定双链多核苷酸的过程。术语“杂交”还可指三链杂交。所得的双 链或三链多核苷酸是“杂合体(hybrid)”。多核苷酸群体中形成稳定杂合体 的比例本文称为“杂交程度”。杂交和杂交强度(即核酸之间缔合的强度) 取决于一些因素，诸如核酸之间互补程度、涉及的条件的严格性、形成的 杂合体的热熔点(thermal melting point，Tm)、和核酸中G∶C比，如下文进 一步详细讨论的。

本文所用的术语“引物”指在开始合成引物延伸产物的条件下，即， 存在溶于合适的缓冲液(通常包括pH缓冲剂和辅因子)中的四种不同核苷 酸三磷酸酯和聚合酶并在合适的温度，当与核酸模板退火时能够作为开始 DNA合成的点的核苷酸聚合物。本发明扩增步骤中使用的引物可与靶序列 完全互补或大致互补。

术语“性状”和“表型”互换地使用并包含任何特征，尤其是可使一 种植物区别于另一种的特征。示例性性状包括植株高度、植物生物量、顶 芽发育程度、发枝程度、植物、种子或花粉能育性、开花数或开始开花、 叶面积、衰老开始、种子萌发开始、种子产量、总种子重量或单个种子重 量、茎发育程度、粮食产量、分蘖数、花分生组织发育程度和根发育程度 的任何一种或多种。

术语“转基因”当使用涉及组织或植物时分别指包括含有转基因或通 过引入转基因而改变其基因组的一个或多个细胞的组织或植物。转基因细 胞、组织和植物可通过多种方法产生，包括通过人类干涉的方式(诸如以 本文所述的方法)引入包含核酸(DNA或RNA)的“转基因”到靶细胞中或 将转基因整合到靶细胞的染色体。

词“大致地”不排除“完全地”，如“大致地不含”Y的组合物可完全 不含Y。必要时，词“大致地”可从本发明定义中省略。

除非另外指明，否则术语“包括(comprising)”和“包括(comprise)” 和其语法变体意为代表“开放”或“内含”的说法，以使其包括所指出的 元素但也允许含有其它未指出的元素。

本文所用的术语“约”在制剂成分的浓度情况中通常指所示值的+/- 5％，更通常所示值的+/-4％，更通常所示值的+/-3％，更通常所示值的+/- 2％，甚至更通常所示值的+/-1％，且甚至更通常所示值的+/-0.5％。

在本公开中，某些实施方案可以一定范围的形式公开。应理解的是， 范围形式中的描述仅是为了方便和简洁，不应被解释为对所公开范围的固 定限制。因此，范围的描述应认为具有具体公开的所有可能子范围以及该 范围中的单独数值。例如，范围的描述诸如1到6应认为具有具体公开的 子范围，诸如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3 到6等，以及该范围中的单独数值，例如1、2、3、4、5和6。这适用于 所有范围而不论范围的宽度如何。

在范围描述多肽中的氨基酸残基或多核苷酸中的核酸残基的情况中， 应理解的是，范围的描述包括范围的第一数值和最后数值。此外在该情况 中，范围的描述不意为包含落入该范围的单独氨基酸或核酸残基。例如， 范围的描述诸如“从氨基酸1至氨基酸7”应认为是指跨越并包括位置1、 2、3、4、5、6和7的氨基酸的氨基酸序列，而不是指位于该范围内的任 何一个或多个单独氨基酸，例如仅氨基酸1、仅氨基酸2、氨基酸1和2 或等等。

实施方案的详细公开

下面将公开调节植物中性状表达的新方法以及用于该新方法和该新 方法产生的材料的示例性、非限制性实施方案。

本发明是基于鉴定到包括根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽参 与植物中的细胞激动素-信号转导途径。

细胞激动素是一类以多种方式调节植物生长和发育的植物激素。它们 积极地促进植物中细胞分裂、细胞生长和分化和其它生长调节功能。认为 细胞激动素在从细胞分裂和扩大到形成花和果实的植物发育的所有阶段 起重要作用。例如，细胞激动素能够促进芽伸长和叶生长，并抑制衰老， 累积氨基酸和开放气孔。

细胞激动素的基本结构包括6-氨基嘌呤，其氨基被通常携带5个碳原 子的取代基修饰。高等植物中天然产生的活性细胞激动素主要是从生物合 成的前体产生的玉米素和异戊烯基腺嘌呤。细胞激动素水平升高与高等植 物中种子的发育相关，因为已证明这些与发育中的玉米粒和其它谷物的胚 乳中的最大有丝分裂活性一致。

细胞激动素生物合成和信号转导的基本分子机制最近才变得清楚。细 胞激动素受体家族的三个成员，其为传感组氨酸激酶(sensor histidine kinase)，已被鉴定并具有类似于包含磷酸中继机制的细菌两成分信号转导 途径的功能。这三种细胞激动素受体AHK2、AHK3和CRE1/AHK4显示 高程度的序列同一性，但各具有独特的特征并对正常细胞激动素感知和植 物生长是需要的。尽管对这三种受体已经进行突变分析，但是这三种受体 的任何一种的突变都没有导致植物表型的显著变化。相反，所有三种受体 的突变(即三突变体)造成矮化和不育植物。这些表型未见于本发明的反义 突变体，如下文所述的。

在拟南芥(Arabidopsis)细胞激动素信号转导途径中，组氨酸蛋白激酶 (AHK)作为细胞激动素受体并经由组氨酸磷酸转移蛋白(AHP)从AHK传递 信号到核响应调节子(ARR)。AHP以细胞激动素依赖性方式从细胞质穿梭 到细胞核并发送信号到细胞核中的ARR，ARR可活化或抑制植物细胞中 参与植物生长和发育的基因的转录。

本文公开了从拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株纯化的分离的多肽 HOG1(包括列于SEQ ID NO：1的氨基酸序列)，其以高亲合力结合于细胞 激动素。而且，本发明人已经鉴定调节根据SEQ ID NO：1的多肽的表达 调节单子叶和双子叶植物二者中细胞激动素信号转导途径，导致植物中不 同性状的表达，尽管缺少组氨酸激酶域。在一些实施方案中，公开的多肽 还缺少SAHH活性。

在某些实施方案中，公开的多肽包括跨膜域。

因此本发明提供一种调节植物中至少一种性状表达的方法，该方法包 括调节植物对至少一种多肽的表达的步骤，其中所述多肽选自以下组成的 组：

i)包括根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽；

ii)包括选自以下任何一种或多种氨基酸序列组成的组的氨基酸序列 并能够调节植物中细胞激动素信号转导的多肽：从SEQ ID NO：1的氨基 酸1至氨基酸7，从氨基酸9至氨基酸230，从氨基酸1至氨基酸58，从 氨基酸77至氨基酸485，从氨基酸59至氨基酸76，从氨基酸150至氨基 酸191，从氨基酸231至氨基酸405，和从氨基酸406至氨基酸438，或在 其同系物的相当位置；

iii)包括与根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％序列同一 性的氨基酸序列并能够调节植物中细胞激动素信号转导的多肽；和

iv)由根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的多肽，

其中调节所述多肽的表达调节了植物中至少一种性状的表达。

使用本发明方法可调节任何细胞激动素的信号转导途径。目前已知有 超过200种天然和合成的细胞激动素 (http://www.plant-hormones.info/cytokinins.htm；Arteca，Plant Growth Substances：Principles and Applications(植物生长物质：原理和应用)，New York：Chapman & Hall(1996)；Salisbury和Ross，Plant Physiology pp. 357-407，531-548(1992))。示例性天然产生的细胞激动素包括玉米素、激动 素、异戊烯基腺嘌呤和6-苄基氨基嘌呤，而苯基脲类诸如二苯基脲代表示 例性合成的细胞激动素类型。可以多种方式产生的细胞激动素的轭合形式 也是已知的并包括在本发明范围中。例如，可通过连接葡萄糖的碳1到玉 米素侧链上的羟基而形成糖苷，或碳1可连接到腺嘌呤环上位置7或9的 C-N键的N原子。

此外公开的方法可应用于期望在其中调节一种或多种性状的任何植 物。本文所用的术语“植物”还包括全植株、植物的祖先和后代以及植物 部分，包括种子、茎干、茎、叶、根(包括块茎)、花以及组织和器官，其 中前述的每种包括本发明的多核苷酸或多肽。术语“植物”还包括植物细 胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和 小孢子，同样其中前述的每种包括目标多核苷酸。

尤其可用于本发明方法的植物包括所有单子叶和双子叶植物，诸如粮 食作物、草、草料或饲料豆类、观赏植物、树木或灌木以及用于生产乙醇 (生物燃料)的纤维素生物量的植物，选自包括如下的名单：槭属(Acer spp.)、 猕猴桃属(Actinidia spp.)、冰草属(Agropyron spp.)、葱属(Allium spp.)、苋属 (Amaranthus spp.)、菠萝(Ananas comosus)、番荔枝属(Annona spp.)、芹属 (Apium spp.)、拟南芥、落花生属(Arachis spp)、菠萝蜜属(Artocarpus spp.)、 芦笋(Asparagus officinalis)、燕麦(Avena sativa)、杨桃(Averrhoa carambola)、 冬瓜(Benincasa hispida)、巴西果(Bertholletia excelsea)、甜菜(Beta vulgaris)、 芸苔属(Brassica spp.)、Cadaba farinosa、茶(Camellia sinensis)、美人蕉 (Canna indica)、辣椒属(Capsicum spp.)、番木瓜(Carica papaya)、大花假虎 刺(Carissa macrocarpa)、红花(Carthamus tinctorius)、山核桃属(Carya spp.)、 栗属(Castanea spp.)、菊花(chrysanthemum)、苦苣(Cichorium endivia)、樟 属(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citnillus lanatus)、柑橘属(Citrus spp.)、椰子 属(Cocos spp.)、咖啡属(Coffea spp.)、可乐果属(Cola spp.)、芋(Colocasia esculenta)、榛属(Corylus spp.)、山楂属(Crataegus spp.)、黄瓜属(Cucumis spp.)、南瓜属(Cucurbita spp.)、菜蓟属(Cynara spp.)、胡萝卜(Daucus carota)、 山蚂蝗属(Desmodium spp.)、龙眼(Dimocarpus longan)、薯蓣属(Dioscorea spp.)、柿属(Diospyros spp.)、稗属(Echinochloa spp.)、穇子(Eleusine coracana)、枇杷(Eriobotrya japonica)、红果仔(Eugenia uniflora)、荞麦属 (Fagopyrum spp.)、水青冈属(Fagus spp.)、无花果(Ficus carica)、金橘属 (Fortunella spp.)、草莓属(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属 (Glycine spp.)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、向日葵属(Helianthus spp.)、 木槿属(Hibiscus spp.)、大麦属(Hordeum spp.)、番薯(Ipomoea batatas)、胡 桃属(Juglans spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、山黧豆属(Lathyrus spp.)、浮萍属 (Lemna spp.)、兵豆(Lens culinaris)、亚麻(Linum usitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、黑麦草(Lolium perenne)、百脉根属(Lotus spp.)、广东丝瓜(Luffa acutangula)、羽扇豆属(Lupinus spp.)、硬皮豆属(Macrotyloma spp.)、凹缘 金虎尾(Malpighia emarginata)、苹果属(Malus spp.)、美洲曼密苹果(Mammea americana)、芒果(Mangifera indica)、木薯属(Manihot spp.)、人心果 (Manilkara zapota)、紫苜蓿(Medicago sativa)、草木犀属(Melilotus spp.)、薄 荷属(Mentha spp.)、苦瓜属(Momordica spp.)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属 (Musa spp.)、烟草属(Nicotiana spp.)、木犀榄属(Olea spp.)、仙人掌属(Opuntia spp.)、Omithopus spp.、稻属(Oryza spp.)、黍(Panicum miliaceum)、西番莲 (Passiflora edulis)、欧防风(Pastinaca sativa)、鳄梨属(Persea spp.)、欧芹 (Petroselinum crispum)、矮牵牛(Petunia hybrida)、菜豆属(Phaseolus spp.)、 刺葵属(Phoenix spp.)、酸浆属(Physalis spp.)、松属(Pinus spp.)、阿月浑子 (Pistacia vera)、豌豆属(Pisum spp.)、早熟禾属(Poa spp.)、杨属(Populus spp.)、牧豆树属(Prosopis spp.)、李属(Prunus spp.)、番石榴属(Psidium spp.)、 石榴(Punica granatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属(Quercus spp.)、萝 卜(Raphanus sativus)、波叶大黄(Rheum rhabarbarum)、醋栗属(Ribes spp.)、 悬钩子属(Rubus spp.)、甘蔗属(Saccharum spp.)、接骨木属(Sambucus spp.)、 黑麦(Secale cereale)、胡麻属(Sesamum spp.)、茄属(Solanum spp.)、高粱 (Sorghum bicolor)、菠菜属(Spinacia spp.)、蒲桃属(Syzygium spp.)、酸豆 (Tamarindus indica)、可可(Theobroma cacao)、车轴草属(Trifolium spp.)、 Triücosecale rimpaui、小麦属(Triticum spp.)、越橘属(Vaccinium spp.)、野豌 豆属(Vicia spp.)、豇豆属(Vigna spp.)、葡萄属(Vitis spp.)、玉米(Zea mays)、 沼生菰(Zizania palustris)、枣属(Ziziphus spp.)以及其它植物。

在一实施方案中，所述植物是谷物作物诸如水稻、小麦、玉米、大豆、 黍、大麦、黑麦、燕麦或高粱。在另一实施方案中，所述植物是草诸如芦 苇、甜茅、甘蔗、竹子、牧草、拂子茅和草皮草。在又另一实施方案中， 所述植物是蔬菜诸如芥蓝(Brassica alboglabra)、朝鲜蓟(artichoke)、天门冬 (asparagus)、西兰花(broccoli)、抱子甘蓝(Brussels sprouts)、卷心菜、卡诺 拉油菜(canola)、胡萝卜、花椰菜、芹菜、绿羽衣甘蓝(collard greens)、亚 麻、羽衣甘蓝(kale)和扁豆，或具有商业或科学价值的其它植物(诸如拟南 芥、矮牵牛、菊花等)。

如以下在实施例1和2中讨论的，公开的方法已经在单子叶和双子叶 植物中得到证实。因此，由于SEQ ID NO：1的多肽序列在植物物种之间 高度保守，预期公开的方法将可应用于单子叶和双子叶植物。例如，如在 以下实施例2中描述的，由于已经在水稻(Oryza sativa)中证实公开的方法， 预期其可用于其它单子叶植物，诸如与水稻(SEQ ID NO：5)具有95％氨基 酸序列同一性的小麦(Triticum aestivum)(SEQ ID NO：7)。类似地，如在以 下实施例1中描述的，由于已经在拟南芥中证实公开的方法，预期其可用 于其它双子叶植物，诸如与拟南芥(SEQ ID NO：1)具有88％氨基酸序列同 一性的矮牵牛(SEQ ID NO：13)，和与拟南芥(SEQ ID NO：1)具有92％氨 基酸序列同一性的菊花(SEQ ID NO：9)。

本文所用的术语“表达”可指性状、基因、或包括编码的多肽的基因 产物在植物中的表达。

可由公开的方法调节的植物性状包括但不限于，植株高度、植物生物 量、顶芽发育、发枝、能育性、开花、叶面积、衰老、种子萌发、种子产 量、种子重量、茎发育、粮食产量、分蘖数、花分生组织发育和根发育。 根据一实施方案，相对于其中所述多肽的表达未被调节的相同类型植物， 植物中的性状表达可被调节以展现增加的发枝、提高的种子产量、提高的 植物生物量、提高的粮食产量、增加的分蘖数、增加的叶面积、延迟的种 子萌发、减少的顶端优势、延迟的开花或其组合。在另一实施方案中，相 对于其中所述多肽的表达未被调节的相同类型植物，植物中的性状表达可 被调节以展现提早的开花、矮小、减少的叶数目、早衰、提早的种子萌发、 延迟和减少的莲座叶形成、增加的幼苗根生长或其组合。

尤其是，相对于根据SEQ ID NO：1的多肽表达未降低的相同类型植 物，所述多肽的表达已经降低的植物的种子产量和植物生物量显著提高约 2至约5倍。取决于植物类型、对根据SEQ ID NO：1的多肽表达的调节、 和调节程度，预期种子产量和植物生物量可分别地提高约2倍、约2.5倍、 约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍或约5倍。

类似地，相对于根据SEQ ID NO：1的多肽表达未降低的相同类型植 物，所述多肽的表达已经降低的植物的粮食产量和分蘖数增加约2至约4 倍。取决于植物类型、对根据SEQ ID NO：1的多肽表达的调节、和调节 程度，预期粮食产量和分蘖数可分别地增加约2倍、约2.5倍、约3倍、 约3.5倍或约4倍。

在具体实施方案中，相对于根据SEQ ID NO：1的多肽表达未降低的 相同类型植物，所述多肽的表达已经降低的植物的叶面积也显著增加约2 至约6倍。取决于植物类型、对根据SEQ ID NO：1的多肽表达的调节、 和调节程度，预期叶面积可增加约2倍、约2.5倍、约3倍、约3.5倍、 约4倍、约4.5倍、约5倍、约5.5倍或约6倍。

相对于根据SEQ ID NO：1的多肽表达未提高的相同类型植物，对于 所述多肽的表达已经提高的植物，开花提早约5至约15天。如上讨论的， 开花时间的调节将取决于植物类型、对根据SEQ ID NO：1的多肽表达的 调节、和调节程度，但通常将提早约4天、约5天、约6天、约7天、约 8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天或约15 天。

在某些实施方案中，植物的能育性不被调节且转化的植物能够产生能 育的植物。

性状的表达可使用本领域已知的各种方法确定。例如，叶面积可通过 分别地使用以下等式以叶面积比率(LAR)、叶面积指数(LAI)或比叶面积 (SLA)测量总叶面积来确定：

LAR(m²g^-1或m²kg^-1)＝(总叶面积)/(总干重量)

LAI＝(作物的总叶面积)

(其所投射(stand)的总地面面积)

SLA(m²g^-1)＝(叶面积)/(叶干质量)

或者，叶面积可使用基于计算机的图像分析来测量。

还可以多种方式测量种子产量，例如以千粒重量的增加或减少，以饱 满种子数目的增加或减少，以总种子重量，以种子大小，或以收获指数。

植株高度的差异可通过直接测量并与未修饰的对照植物高度比较来 测量。

植物生物量可通过称重新收获的植物(鲜重量或湿重量)或恒定的干重 量而确定。干重量可在设定为约80℃的干燥烘箱中干燥收获的目标植物或 植物部分(如叶、种子)2天至7天后直到记录恒定重量(干重量)而确定。类 似地，可确定每株植物或每单位耕作面积(如每平方米、英亩或公顷)的种 子或谷粒重量(grain weight)和总种子或粮食产量。

顶芽发育和发枝以及能育性、开花和衰老的变化可通过比较修饰的植 物(如，如本公开描述的遗传修饰)的发育与在相同生长阶段的未修饰的植 物的外表而评估。

每株植物的分蘖数(或枝数目)可通过计数生长到已发育所有分蘖的植 物的代表性样品而确定(如，在水稻栽培品种中，分蘖达到最大数目之前可 花费约2个月)。这些可与未修饰的植物每株植物的分蘖数比较。

花分生组织发育和根发育可在宏观水平(例如通过在发育的相当阶段 肉眼观察)以及通过显微镜检查(例如以光学显微镜或电子显微镜检查)细 胞排列的差异等而检查。

基因的表达可例如通过测量所产生的信使RNA(mRNA)转录物水平而 确定。多肽基因产物的表达可例如通过使用与多肽结合的抗体的免疫测定 而确定。

术语“调节”指植物中性状、基因或基因产物(包括编码的多肽)的表 达的改变。通常，改变是相对于性状、基因或多肽的表达未被调节的相同 类型植物。例如，当使用涉及性状表达时，术语“调节”可指相对于其中 所述多肽的表达未被调节的相同类型植物，在已使用公开的方法调节多肽 表达的植物中植株高度增加或减少、植物生物量增加或减少、顶芽发育增 加或减少、发枝增加或减少、能育性增加或减少、开花增加或减少、叶面 积增加或减少、提早或延迟衰老、提早或延迟种子萌发、种子数目增加或 减少、种子产量增加或减少、种子重量增加或减少、提早或延迟茎发育、 茎发育增加或减少、粮食产量增加或减少、分蘖数增加或减少、花分生组 织发育增加或减少、提早或延迟花分生组织发育、根发育增加或减少、提 早或延迟根发育和类似性状。在一实施方案中，相对于其中所述多肽的表 达未被调节的相同类型植物，调节的性状可为在已使用公开的方法调节多 肽表达的植物中增加发枝、提高种子产量、提高植物生物量、提高粮食产 量、增加分蘖数、增加叶面积、延迟种子萌发、减少顶端优势、延迟开花 或其组合。在其它实施方案中，相对于其中所述多肽的表达未被调节的相 同类型植物，调节的性状可为在已使用公开的方法调节多肽表达的植物中 提早开花、矮小、减少叶数目、早衰、提早种子萌发、延迟和减少莲座叶 形成、增加幼苗根生长或其组合。

“发育”是指植物或植物部分经由细胞生长和分化而生长以达到成熟 的过程。

当使用涉及表达基因或基因产物时，术语“调节”通常是指表达水平 增加或减少。在一些实施方案中，基因或基因产物表达水平减少包括完全 抑制所述基因或基因产物的表达。在某些实施方案中，基因或基因产物表 达水平减少不是完全抑制所述基因或基因产物的表达。

在一些实施方案中，当HOG1多肽(SEQ ID NO：1)表达水平与野生型 相比增加约3至约20倍时，细胞激动素水平减少约20至约85％、约30 至约75％、约40至约65％、或约50至约55％。细胞激动素水平的这种减 少可导致性状表达的调节，诸如提前种子萌发约4至约5天、生长迟缓和 延迟新莲座叶形成和展开。在其它实施方案中，当HOG1多肽(SEQ ID NO： 1)表达水平与野生型相比减少约2至约10倍时，细胞激动素水平增加约 20至约85％、约30至约75％、约40至约65％或约50至约55％。细胞激 动素水平的这种增加可导致性状表达的调节，诸如延迟种子萌发约5天。 如可从以下实施例看到的，性状的表达与细胞激动素的表达水平相关。增 加或减少基因或基因产物表达水平的方法也在以下进一步讨论。

可选地，术语“调节”可指植物中基因或基因产物(包括编码的多肽) 的生物或功能特征改变。例如，调节可导致编码的多肽的结合亲合力改变。 在某些实施方案中，调节不导致基因的核酸序列或编码的多肽的氨基酸序 列改变。

通常，植物中一种或多种性状的表达的调节是通过调节包括根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽的表达。“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文 可交换地使用以指经由肽键或修饰的肽键连接的根据SEQ ID NO：1的氨 基酸残基聚合物(二肽或更大的肽)和相同物质的变体和合成的类似物。因 此，这些术语包括根据SEQ ID NO：1的氨基酸聚合物，其中一种或多种 氨基酸残基是合成的非天然产生氨基酸，诸如相应的天然产生的氨基酸的 化学类似物以及天然产生的氨基酸聚合物。本发明的多肽包括但不限于天 然纯化产物、化学合成程序的产物、和通过重组技术从原核或真核宿主(包 括例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)产生的产物。本发明 的多肽可包括非肽成分，诸如糖基。糖和其它非肽取代基可由多肽在其中 产生的细胞加至多肽，并将随细胞类型变化。对于重组制备的多肽，修饰 的性质和程度很大程度上将由具体宿主细胞的翻译后修饰能力和相关多 肽的氨基酸序列中存在的修饰信号确定。例如，不同类型宿主细胞之间的 糖基化方式不同。多肽在本文中以其氨基酸骨架结构来限定；取代基诸如 糖基通常不指定，但仍可存在。此外，本发明的多肽还可包括开始的修饰 的甲硫氨酸残基，在一些情形中是宿主介导的过程的结果。蛋白可以单体 或以多聚蛋白如以二聚体(同或异二聚体)或三聚体存在。

通常，本发明中待调节表达的多肽在其范围中包括其变体或片段，其 中所述变体或片段具有与SEQ ID NO：1限定的多肽功能上相同的生物活 性。在某些实施方案中，生物活性是细胞激动素结合和受体活性。受体活 性包括跨细胞膜传播胞外信号以变成胞内信号，在细胞激动素结合受体后 该信号可开始一种或多种细胞响应。鉴定细胞激动素结合和受体活性的方 法是本领域熟知的并描述于以下的实施例1和2。

片段可包含从多肽任一末端或从最初氨基酸序列的内部段(internal stretches)的单个或多个氨基酸缺失。片段优选地包括母体序列的至少n个 连续氨基酸，并且取决于具体序列，n优选地是7或更大(例如7、8、9、 10、12、15、17、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、 300、400或更大)。

在一实施方案中，n是7。

在一实施方案中，n是18。

在一实施方案中，n是33。

在一实施方案中，n是42。

在一实施方案中，n是58。

在一实施方案中，n是175。

在一实施方案中，n是222。

在一实施方案中，n是409。

这种片段可为“独立的”，即不是其它氨基酸或多肽的部分或融合至 其它氨基酸或多肽，或可被包括在更大的多肽中，在其中它们形成部分或 区域。当被包括在更大的多肽中时，本发明的片段最优选地形成单个连续 区域。此外，多个片段可被包括在单个更大的多肽中。

本发明还包括包含根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽的功能等 价物。本发明的多肽片段和功能等价物保持母体多肽的生物活性，即细胞 激动素结合和受体活性。鉴定细胞激动素结合和受体活性的方法是本领域 熟知的并描述于以下的实施例1和2。

本发明的功能等价的多肽包括与列于SEQ ID NO：1的多肽同源的多 肽。如果一条多肽的序列与另一多肽的序列具有足够高程度的同一性，则 认为这两条多肽是“同源”的。短语“同一性百分比”、“％同一性”、“蛋 白同一性”、“序列同一性”等当应用于多肽序列时，是指使用标准化算法 比对的至少两条多肽序列之间匹配的相同残基的百分比。这种算法可以标 准化和可再现的方式在被比序列中插入缺口以优化两条序列之间的比对， 并因此实现两条序列的更有意义的比较。

同一性百分比可使用本领域已知的或本文所述的一种或多种计算机 算法或程序确定。同一性程度可由本领域技术人员容易地计算(参见例如： Computational Molecular Biology(计算分子生物学)，Lesk，A.M.编辑，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing.Informatics and Genome Projects(生物计算机设计：信息学和基因组计划)，Smith，D.W.编辑， Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data(序列 数据的计算机分析)，第1部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology(分子生物学 中的序列分析)，von Heinje，G.，Academic Press，1987；和Sequence Analysis Primer(序列分析引物)，Gribskov，M.和Devereux，J.编辑，M Stockton Press， New York，1991)。

测量蛋白序列同一性的方法是本领域熟知的且本领域技术人员将理 解，在本文中序列同一性是基于氨基酸同一性(有时称为“硬同源性(hard homology)”)计算的。例如，UWGCG软件包提供BESTFIT程序，其可用 于计算序列同一性(例如以其默认设置使用)(Devereux等人(1984)Nucleic Acids Research 12，p387-395)。PILEUP和BLAST(基本局部比对搜索工具) 算法可用于计算序列同一性或排列序列(通常以其默认设置)，例如在 Altschul S.F.(1993)J Mol Evol 36：290-300和Altschul，S，F等人(1990)J Mol Biol 215：403中所述。

进行BLAST分析的软件从多种来源可得，包括美国国家生物技术信 息中心(NCBI)，Bethesda，MD和因特网上例如“www.ncbi.nlm.nih.gov/”。 该算法包括首先通过鉴定询问序列中长度W的短字来鉴定高得分的序列 对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字比对时，所述短字匹配或满足 一些正值的阈值得分T。T是指相邻字得分阈值(Altschul等人，同上)。这些 初始相邻匹配字串(word hits)作为种子用于开始搜索以发现含有它们的 HSP。只要累积的比对得分可增加，匹配字串就沿着每条序列以两个方向 一直延伸。

因此本文所称的序列同一性可例如使用BLAST 2.1.3版本(或其其它版 本)确定，使用NCBI(美国国家生物技术信息中心； http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)指定的默认参数[Blosum 62矩阵；空位开放罚 分＝11且空位延伸罚分＝1]。

在某些实施方案中，使用前述算法/程序的默认设置。

通常，认为两条多肽之间大于50％的同一性表示功能等价，只要保留 参考多肽的活性。更优选的多肽与SEQ ID NO：1代表的氨基酸具有大于 61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、 73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、 85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％或99％总序列同一性的同一性程度。

使用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST，显示本发明的拟南芥HOG1 多肽(SEQ ID NO：1)通常与其在水稻(即OsCBP)(SEQ ID NO：5)、小麦(SEQ ID NO：7)、菊花(SEQ ID NO：9)和矮牵牛(即PETCBP)(SEQ ID NO：13) 中的同系物共有约80至95％的氨基酸序列同一性。更具体地，拟南芥 HOG1多肽(SEQ ID NO：1)与其在水稻中的同系物(SEQ ID NO：5)共有约 90％的氨基酸序列同一性，与其在小麦中的同系物(SEQ ID NO：7)共有约 91％的氨基酸序列同一性，与其在菊花中的同系物(SEQ ID NO：9)共有约 92％的氨基酸序列同一性，与其在矮牵牛中的同系物(SEQ ID NO：13)共有 约88％的氨基酸序列同一性，与其在芥蓝中的同系物(SEQ ID NO：11)共 有约99％的氨基酸序列同一性，与其在马铃薯(Solanum tuberosum)中的同 系物(SEQ ID NO：29)共有约90％的氨基酸序列同一性，和与其在番茄 (Lycopersicon esculentum)中的同系物(SEQ ID NO：27)共有约89％的氨基酸 序列同一性。

根据本发明的功能等价的多肽意为包括其中在一个或多个位置有保 守的或非保守的氨基酸插入、缺失或取代的多肽，只要这种改变造成保留 母体多肽的细胞激动素结合和受体活性的蛋白。这些类型改变的每种可单 独或联同其它改变在给定序列发生一次或多次。这种变体可例如使用蛋白 工程和位点定向诱变的方法制备。

还可制造融合蛋白以改进HOG1蛋白和其同系物、或它们的变体或片 段的特征。例如，一段其它氨基酸尤其是带电荷的氨基酸可加至HOG1蛋 白和其同系物、或它们的变体或片段的N-末端，以改进从宿主细胞纯化过 程中的稳定性。可选地，肽部分可加至所述多肽以便于纯化。在最后制备 所述多肽之前可除去这种区域。加入肽部分以便于操纵多肽是本领域技术 人员熟知的常规技术。

本发明多肽可由多种方法制备，诸如从植物纯化和通过重组方法。本 发明的多肽，尤其是短的肽片段，还可通过化学合成制备，诸如通过常规 液相或固相合成技术(参见例如描述于Solid Phase Peptide Synthesis(固相 肽合成)，第2版，1984The Pierce Chemical Co.，Rockford，Ill的方法)。可选 地，肽可通过以蛋白酶类诸如endoLys-C、endoArg-C、endoGlu-C和葡萄 球菌V8-蛋白酶消化本发明的多肽而制备。

纯化本发明多肽可通过诸如尺寸排阻色谱、离子交换色谱和反相高效 液相色谱的技术的任何一种或组合来实现。体外检测本发明的多肽或其变 体或片段可使用多种技术实现，包括ELISA(酶联免疫吸附测定)、蛋白质 印迹法、免疫沉淀、免疫荧光、薄层色谱、反相高效液相色谱、酸水解后 的氨基酸分析和通过快原子轰击(FAB)质谱分析。这种技术是本领域技术 人员常用的技术。

使用本领域已知的方法，显示本发明的多肽(SEQ ID NO：1)包括两个 保守的SAHH标志。在第二个SAHH标志，鉴定了表示二核苷酸结合域的 三个保守的甘氨酸残基。由于细胞激动素是核苷酸衍生物，预测这些残基 可形成细胞激动素结合域。还在SEQ ID NO：1的氨基酸位置1至7(在 N-末端)，位置150至191和位置59至76鉴定了推定的跨膜域。

在氨基酸位置9至230(在N-末端)、位置77至485和位置406至438 (在C-末端)鉴定了其它推定的细胞激动素结合域。在氨基酸位置231至405 鉴定了推定的NAD⁺-结合域。在氨基酸位置1-58鉴定了N-末端胞内域。

在某些实施方案中，植物中多肽表达的调节是通过将调节多肽表达的 多核苷酸引入植物的一个或多个细胞。本发明的多核苷酸可以RNA的形 式，诸如mRNA，或以DNA的形式，包括例如可通过克隆获得或可合成 地制备的cDNA和基因组DNA。DNA可为双链或单链的。单链DNA或 RNA可为编码链，也称为有义链，或可为非编码链，也称为反义链，如以 下进一步讨论的。

适合用于公开的方法的多核苷酸可包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸 或肽核酸(PNA)等核苷酸，其包括嘌呤和嘧啶碱基，或其它天然、化学或 生物化学修饰的非天然或衍生化的核苷酸碱基。多核苷酸的骨架可包括如 可通常见于RNA或DNA的糖和磷酸基团，或修饰的或取代的糖或磷酸基 团。多核苷酸还可包括修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。 核苷酸的序列可被非核苷酸成分中断。因此，术语核苷、核苷酸、脱氧核 苷和脱氧核苷酸通常包括具有与天然产生的核苷或核苷酸共同的一些结 构特征的类似物，以使当它们并入多核苷酸序列时，允许与溶液中天然产 生的多核苷酸序列杂交。通常，这些类似物通过替代和/或修饰碱基、核糖 或磷酸二酯部分衍生自天然产生的核苷和核苷酸。可定制改变以如期望的 使杂合体形成稳定或不稳定或增强与互补多核苷酸序列杂交的特异性。

本发明的多核苷酸在其范围中还包括多核苷酸序列的变体或片段，其 中所述变体或片段编码与本发明多核苷酸(尤其是SEQ ID NO：2限定的多 核苷酸序列)编码的多肽(或其片段)功能上相同的具有生物活性的多肽，其 中所述变体可使用分子生物学的标准技术来定位和分离，而不需要过度试 验和实验。

两条多核苷酸序列之间的同源性程度可通过本领域已知的计算机程 序手段确定，诸如GCG程序包(Wisconsin软件包的程序手册，版本8，1996 年8月，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin， USA 53711)(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，443-453)中提供的GAP，使用例如，GAP产生罚分为5和GAP 宽度罚分为0.3的默认设置。多核苷酸分子的同系物是在不同物种中编码 具有大致相同功能和类似特征的多肽的多核苷酸分子，其中所述编码的多 肽可在至少区域中共有至少50％氨基酸同一性，且对编码的总氨基酸序列 具有至少约30％氨基酸同一性、至少约40％氨基酸同一性、至少约50％氨 基酸同一性、至少约60％氨基酸同一性、至少约70％氨基酸同一性、至少 约80％氨基酸同一性、至少约90％氨基酸同一性或至少约95％同一性。以 上已经描述了HOG1多肽(SEQ ID NO：1)与其在水稻(SEQ ID NO：5)、小 麦(SEQ ID NO：7)、菊花(SEQ ID NO：9)和矮牵牛(SEQ ID NO：13)中的 同系物的示例性序列同一性水平。由于遗传密码的简并性，和不同植物属 和种之间优先密码子使用的差异，相应的多核苷酸同系物可共有显著地小 于50％的同一性。例如，使用CLUSTAL W(1.83)，显示编码本发明的HOG1 多肽(SEQ ID NO：1)的多核苷酸与其在水稻中的同系物(SEQ ID NO：6)具 有82％序列同一性，与其在小麦中的同系物(SEQ ID NO：8)具有83％序列 同一性，与其在菊花中的同系物(SEQ ID NO：10)具有82％序列同一性， 与其在矮牵牛中的同系物(SEQ ID NO：14)具有78％序列同一性，与其在 芥蓝中的同系物(SEQ ID NO：12)具有98％序列同一性，与其在番茄中的 同系物(SEQ ID NO：28)具有79％序列同一性，与其在马铃薯中的同系物 (SEQ ID NO：30)具有80％序列同一性，和与编码烟草品种Xanthi(Nicotiana tabacum cv.Xanthi)的SAHH1多肽的多核苷酸(SEQ ID NO：4)具有78％序 列同一性。

多核苷酸分子在其范围中还可包括在低严格性，更优选地中严格性和 还更优选地高严格性条件下，能够杂合于本发明多核苷酸分子尤其是SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14和15限定的多核苷酸序列的变体。低严格 性杂交条件可对应于在50℃在2x SSC中进行杂交。

用于确定给定多核苷酸分子是否杂交于指定多核苷酸的合适的实验 条件可包括将含有待检查的多核苷酸相关样品的滤膜(filter)预浸渍在5x SSC 10min，并在5x SSC、5x Denhardt溶液、0.5％SDS和100μg/ml变 性的超声处理的鲑精DNA的溶液中将滤膜预杂交，随后在含有浓度为10 ng/ml的³²p-dCTP-标记的探针的相同溶液中在大约45℃杂交12小时，根 据Sambrook等人所述的杂交方法(1989；Molecular Cloning，A Laboratory Manual(分子克隆实验室手册)，第2版，Cold Spring Harbour，New York)。

随后在至少55℃(低严格性)、至少60℃(中严格性)、至少65℃(中/高 严格性)、至少70℃(高严格性)或至少75℃(非常高严格性)，将滤膜在2x SSC、0.5％SDS中洗涤30分钟两次。通过将滤膜暴露于x-射线胶片可检 测杂交。

进一步地，有本领域技术人员熟知的多种条件和因素可用来改变杂交 的严格性。例如，待杂交于指定多核苷酸的多核苷酸的长度和性质(DNA、 RNA、碱基组成)；盐和其它成分的浓度，诸如甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙 二醇等的存在或不存在；和改变杂交和/或洗涤步骤的温度。

进一步地，还可能理论地预测两条给定多核苷酸序列在某些指定条件 下是否将杂交。因此，作为上述经验方法的代替，确定变体多核苷酸序列 是否将杂交于根据第二方面或第三方面限定的多核苷酸分子或更具体地 SEQ ID NO：2或15的多核苷酸，可基于理论计算具有已知序列的两条异 源多核苷酸序列在指定条件诸如盐浓度和温度下将杂交的T_m(解链温度)。

确定异源多核苷酸序列的解链温度(T_m(异源))时，必须首先确定同源多核 苷酸序列的解链温度(T_m(同源))。两条完全互补多核苷酸链(同源双链体形成) 之间的解链温度(T_m(同源))可根据下式确定，如Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学最新方案)，John Wiley and Sons，1995中概述的：

T_m(同源)＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L

M＝表示单价阳离子的摩尔浓度，

％GC＝鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)占序列中总碱基数目的％，

％甲酰胺＝杂交缓冲液中的％甲酰胺，且

L＝多核苷酸序列的长度。

上式确定的T_m是两条完全互补多核苷酸序列之间的同源双链体形成 的T_m(T_m(同源))。为了使T_m值适于两条异源多核苷酸序列，假定两条异源序 列之间核苷酸序列的1％差异等于T_m减少1℃。因此，异源双链体形成的 T_m(异源)通过从T_m(同源)减去所讨论的类似序列与上述核苷酸探针之间的同源 性％差异而获得。

通常SEQ ID NO：2或15限定的多核苷酸分子在其范围中还包括为其 寡核苷酸片段的多核苷酸分子。通常，寡核苷酸片段长度为约15至约1775 核苷酸。更通常地，寡核苷酸片段长度为约15至约1200核苷酸。甚至更 通常地，寡核苷酸片段长度为约15至约700核苷酸。还甚至更通常地， 寡核苷酸片段长度为约15至约200核苷酸。而仍更通常地，寡核苷酸片 段长度为约15至约75核苷酸。

通常，寡核苷酸片段长度为约15至约1775核苷酸。更通常地，寡核 苷酸片段长度为约100至约1775核苷酸。甚至更通常地，寡核苷酸片段 长度为约500至约1775核苷酸。还甚至更通常地，寡核苷酸片段长度为 约1000至约1775核苷酸。而仍更通常地，寡核苷酸片段长度为约1200 至约1775核苷酸。

术语“互补”是指核苷酸或核酸之间的杂交或碱基配对，诸如例如， 双链DNA分子的两条链之间或寡核苷酸引物与待测序或扩增的单链核酸 上引物结合位点之间。互补核苷酸通常是A和T(或A和U)，或C和G。 当最佳地比对和比较并带有适当的核苷酸插入或缺失的一条链的核苷酸 与另一链的核苷酸的至少约80％，通常为另一链的核苷酸的至少约90％至 95％、和更优选地约98至100％匹配时，两条单链RNA或DNA分子被称 为互补。可选地，当RNA或DNA链将在选择性杂交条件下杂交于其互补 物(complement)时，存在互补性。通常，当对至少14至25核苷酸的整段 序列有至少约65％互补性，优选地至少约75％，和更优选地至少约90％互 补性时，将发生选择性杂交。

本发明的多肽和多核苷酸分子是“分离的”。本文所用的术语“分离 的”是指大致地或实质上不含在其天然状态通常伴随其的成分的物质。例 如，本文所用的“分离的多核苷酸”是指一种多核苷酸，其已经从在天然 产生的状态在其侧翼的序列纯化。“分离的”物质以比在自然中或以其天 然产生的状态中所见的物质浓度高的浓度存在于制剂中或该物质在含有 在自然中不伴随该物质的其它材料的制剂中存在。

在某些实施方案中，本发明的多肽和多核苷酸分子是外源分子。术语 “外源”当使用涉及多核苷酸或多肽分子时是指多核苷酸或多肽分离和/ 或衍生自所述多核苷酸或多肽将被引入的靶细胞物种以外的物种。

在一实施方案中，减少根据SEQ ID NO：1的多肽表达的多核苷酸被 引入目标植物。多核苷酸可为抑制性多核苷酸，例如反义多核苷酸(诸如反 义RNA)、RNA干扰的构建体(诸如siRNA)和催化性反义核酸构建体(诸如 核酶)。多核苷酸可使用本领域技术人员已知的方法制备，例如通过化学合 成、重组DNA程序，或在反义RNA的情形中，通过体外或体内(当连接 至启动子时)转录。

在某些实施方案中，多核苷酸是反义多核苷酸。“反义多核苷酸”是 与本发明的编码序列的任何一种或所有(包括其部分序列)互补的多核苷酸 序列，并因此可与其杂交。

全长反义分子可用于该目的。可选地，可使用靶向编码HOG1的RNA 的特定区域的双链寡核苷酸、有义和/或反义寡核苷酸或其组合。使用寡核 苷酸分子来减少预先确定的基因的表达水平是本领域已知的(参见例如， Hamilton，A.J.和Baulcombe，D.C.(1999)，″A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants(植物中转录后基因沉默中的一 类小反义RNA)″，Science 286：950-952；Waterhouse P.M.等人(1998)，″Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA(植物中的病毒抗性和基因沉默可被 同时表达有义和反义RNA诱导)″，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13959-13964；和国际专利公布WO 99/53050、WO 99/49029、WO 99/32619)。寡核苷酸分子可通过以DNA构建体转化植物细胞而原位提供， 该DNA构建体在转录后产生可为全长或部分序列的双链和/或反义RNA 序列。基因沉默效应可通过过量产生(over-producing)有义和/或反义序列(可 为全长或部分的)而增强，从而产生高量的双链RNA。

如上讨论的，反义构建体的序列可衍生自HOG1基因的不同区域。例 如，反义序列可包括来自与编码一种多肽的核酸序列互补的多核苷酸的至 少15、至少20或至少25个相邻核酸残基，所述多肽包括与根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。反义序列可 包括约20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、 500、600、700、800或850个相邻核酸残基。可使用包括期望数目的残基 的任何相邻序列。可使用本领域已知的任何方法和算法设计相邻序列。作 为一个实例，当期望反义多核苷酸包括15个相邻核酸残基时，第一多核 苷酸可包括开始于多核苷酸序列的位置301并结束于多核苷酸序列的位置 315的15个相邻核酸残基，第二多核苷酸可包括开始于多核苷酸序列的位 置302并结束于多核苷酸序列的位置316的15个相邻核酸残基，第三多 核苷酸可包括开始于多核苷酸序列的位置303并结束于多核苷酸序列的位 置317的15个相邻核酸残基，且第四多核苷酸可包括开始于多核苷酸序 列的位置304并结束于多核苷酸序列的位置318的15个相邻核酸残基。 通过沿着多核苷酸链顺序地鉴定15个相邻核酸残基的段可获得包括15个 相邻核酸残基的另外多核苷酸。对本领域技术人员明显的是，使用类似策 略可制备其它长度的相邻序列。

在一实施方案中，包括开始于SEQ ID NO：2的多核苷酸序列的位置 271并结束于位置286的15个相邻核酸残基的第一反义多核苷酸具有以下 核酸序列：CTC GGC GCG GAA GTC(SEQ ID NO：16)。使用上述策略， 包括开始于SEQ ID NO：2的多核苷酸序列的位置272并结束于位置287 的15个相邻核酸残基的第二反义多核苷酸具有以下核酸序列：TCG GCG CGG AAG TCA(SEQ ID NO：17)。第三和第四反义多核苷酸分别地具有以 下核酸序列：CGG CGC GGA AGT CAG(SEQ ID NO：18)和GGC GCG GAA GTC AGA(SEQ ID NO：19)。可如上所述获得包括15个相邻核酸残 基的另外的反义多核苷酸。

在某些实施方案中，反义多核苷酸包括15个相邻核酸残基。在特定 实施方案中，反义多核苷酸包括至少100个相邻核酸残基。

反义构建体可设计为靶向并结合于核苷酸序列的调节区域诸如启动 子，或于编码(外显子)或非编码(内含子)序列。在一实施方案中，使用靶向 SEQ ID NO：2的反义多核苷酸，其导致根据SEQ ID NO：1的多肽表达 减少。在一实施方案中，使用根据SEQ ID NO：15(SEQ ID NO：2的跨两 个SAHH标志域的850bp片段)的反义多核苷酸。可产生沿着其长度与所 讨论的HOG1基因(SEQ ID NO：2)的区域至少大致地互补的本发明的反义 构建体。反义构建体与其互补细胞序列的结合可干扰转录、RNA加工、转 运、翻译和/或mRNA稳定性。合适的反义多核苷酸可由本领域技术人员 熟知的方法制备。通常，反义多核苷酸将在自动合成仪上合成。合适的反 义多核苷酸可包括设计以改善它们向细胞的递送、它们进入细胞后的稳定 性和/或它们与适当的靶结合的修饰。例如，反义多核苷酸可通过在骨架中 添加一种或多种硫代磷酸酯键或并入一个或吗啉环而修饰。

可选地，根据本领域已知方法RNAi构建体可用于减少编码包括SEQ ID NO：1的多肽的多核苷酸的表达(例如Fire等人(1998)Nature 391： 806-811；Hammond等人(2001)Nature Rev，Genet.2：110-1119；Hammond 等人(2000)Nature 404：293-296；Bernstein等人(2001)Nature 409：363-366； Elbashir等人(2001)Nature 411：494-498；WO 99/49029和WO 01/70949， 其公开通过引用并入本文)。RNAi是指由小干扰RNA分子(siRNA)破坏具 体mRNA的选择性转录后基因沉默手段。siRNA通常通过裂解双链RNA 产生，其中一条链与待失活的信息相同。可合成并直接引入双链RNA分 子，其中一条链与mRNA转录物的特异区域相同。可选地，可采用相应的 双链DNA，其在胞内呈递后被转化为双链RNA。合成合适的用于RNAi 并实现转录后基因沉默的siRNA分子的方法是本领域技术人员已知的。本 领域技术人员将理解，基于所讨论的基因的序列知识，使用本领域技术人 员已知的常规程序而不需过多的实验，即可鉴定和产生能够减少包括SEQ ID NO：2的多核苷酸的表达的各种合适的siRNA构建体。

本领域技术人员还将理解，靶序列与siRNA序列之间不必需要100％ 的核苷酸序列匹配。错配的能力很大程度上取决于错配在序列中的位置。 在一些情形中，2或3个核苷酸的错配是可接受的但在其它情形中，单个 核苷酸错配足以否定siRNA的有效性。使用本领域技术人员已知的常规程 序而不需过多的实验，即可确定具体siRNA分子的适合性。例如，可使用 包括含有至少9个相邻核酸残基的核酸序列的RNA干扰的多核苷酸，所 述至少9个相邻核酸残基选自与由根据SEQ ID NO：2的核酸序列组成的 多核苷酸互补的核酸序列。在一些实施方案中，可使用包括含有约9、10、 11或12个相邻核酸残基的核酸序列的RNA干扰的多核苷酸。可使用包括 期望的数目的残基的任何相邻序列。可使用本领域已知的任何方法和算法 设计相邻序列。作为一个实例，当期望RNA干扰的多核苷酸包括9个相 邻核酸残基时，第一多核苷酸可包括开始于多核苷酸序列的位置61并结 束于多核苷酸序列的位置69的9个相邻核酸残基，第二多核苷酸可包括 开始于多核苷酸序列的位置62并结束于多核苷酸序列的位置70的9个相 邻核酸残基，第三多核苷酸可包括开始于多核苷酸序列的位置63并结束 于多核苷酸序列的位置71的9个相邻核酸残基，且第四多核苷酸可包括 开始于多核苷酸序列的位置64并结束于多核苷酸序列的位置72的9个相 邻核酸残基。通过沿着多核苷酸链顺序地鉴定9个相邻核酸残基的段可获 得包括9个相邻核酸残基的另外多核苷酸。对本领域技术人员明显的是， 使用类似策略可制备其它长度的相邻序列。

在一实施方案中，包括开始于SEQ ID NO：2的多核苷酸序列的位置 42并结束于位置50的9个相邻核酸残基的第一RNA干扰的多核苷酸具有 如下序列：AGA TCC GAA(SEQ ID NO：20)。使用上述策略，包括开始于 SEQ ID NO：2的多核苷酸序列的位置43并结束于位置51的9个相邻核 酸残基的第二RNA干扰的多核苷酸具有如下序列：GAT CCG AAA(SEQ ID NO：21)。第三和第四RNA干扰的多核苷酸分别地具有如下序列：ATC CGA AAA(SEQ ID NO：22)和TCC GAA AAA(SEQ ID NO：23)。可如上 所述获得包括9个相邻核酸残基的另外的RNA干扰的多核苷酸。关于设 计和使用siRNA的进一步信息还可见于在www.mpibpc.gwdg. de/abteilungen/10-0/105/sirna.html可得的“The siRNA User Guide(siRNA使 用者指南)”。

减少编码包括SEQ ID NO：1的多肽的多核苷酸表达的进一步手段可 通过引入催化性反义核酸构建体诸如核酶来实现，其能够裂解RNA转录 物并从而阻止野生型蛋白产生。借助于和核酶催化位点侧翼的靶具有序列 互补性的两个区域，核酶靶向于特定序列并与之退火。结合后，核酶以位 点特异性方式裂解靶。特异性识别并裂解目标序列的核酶的设计和测试可 通过本领域技术人员熟知的技术实现(例如Lieber和Strauss，(1995)Mol. Cell.Biol.15：540-551，其公开通过引用的方式并入本文)。

在某些实施方案中，编码包括SEQ ID NO：1的多肽的多核苷酸的表 达的减少是共抑制的结果。共抑制是指由引入转基因导致的内源基因的抑 制。通常，共抑制在以与内源基因相同或共有核苷酸序列同源性的基因构 建体的一个或多个拷贝转化的转基因植物中观察到。在一些这种转化的植 物中，对引入的转基因以及内源同系物都可发生抑制，例如由于偶然地产 生反义RNA，或由于引入的转基因和内源同系物之间反常的染色体相互作 用(Hooper，The petunia paradox：added copies of genes have puzzling effects in plants(矮牵牛花自相矛盾：增加的基因拷贝在植物中具有令人迷惑的作 用)，J.NIH Res.3：49-54，(1991)。因此，不是导致引入的转基因表达水平 增加，共抑制导致根据SEQ ID NO：1的多肽的表达水平减少。

如以下的实施例2、图9c、11a、11b、11d和11g以及表8所述的，以 过表达构建体转化的一些转基因水稻植物表现出在以反义构建体转化的 植物中观察到的性状，作为共抑制的结果。例如，与WT相比时，这些共 抑制植物表现出从主分蘖的地上节发枝(这导致每株植物的圆锥花序数目 显著总体增加)，以及种子平均数和植物生物量2至超过3倍的增加。

还考虑了引入包括单个或多个核苷酸插入、缺失或取代的突变以减少 根据SEQ ID NO：1的多肽的表达的多核苷酸。单个或多个核苷酸插入、 缺失或取代可经由靶突变位点与引入的靶核苷酸序列之间的重组而引入。 这种引入的核苷酸序列可例如包括待引入基因组中的核苷酸序列，其任一 侧的侧翼为与相邻于或位于期望的突变插入点任一侧的靶序列同源的核 苷酸序列。与靶序列同源的核苷酸序列可与靶序列等基因从而提高同源重 组的频率。

还可使用不是严格地与靶序列等基因的同源核苷酸序列。尽管同源核 苷酸序列与靶序列之间的错配可不利地影响同源重组频率，但是等基因性 不是严格地需要的，大致的同源性即可足够。为了本发明目的，同源序列 与靶序列之间的同源性水平可为至少约90％同一性、至少约95％同一性、 至少约99％同一性或100％同一性。

突变可通过化学或物理诱变技术，或使用插入突变手段诸如转座子或 T-DNA引入，且外源核酸可通过重组手段引入，采取例如，化学辅助的细 胞渗透(使用例如钙、锂、PEG)、电穿孔、显微注射、脂质体介导的转染、 微粒轰击(生物弹法)、农杆菌(Agrobacterium)介导的转化、病毒感染、原生 质体融合或本领域已知的任何其它适当的手段。

编码根据SEQ ID NO：1的多肽的多核苷酸的表达的减少或增加可为 稳定或瞬时的(例如，在一代或两代中仅在特定发育阶段或组织)，取决于 植物是稳定地还是瞬时地转化的。“稳定地转化的”是指引入并整合一种 或多种转基因到细胞基因组。细胞的稳定转化可通过本领域已知技术检 测，例如通过细胞的基因组DNA与能够结合至一种或多种转基因的核酸 序列的Southern印迹杂交，或通过对细胞的基因组DNA进行聚合酶链式 反应以扩增转基因序列。

相反，术语“瞬时地转化的”是指引入一种或多种转基因到细胞，其 中转基因不整合入转化的细胞的基因组。可检测瞬时转化，例如，通过使 用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测一种或多种转基因编码的多肽的存在或 通过检测转基因编码的蛋白(如β-葡糖醛酸糖苷酶)的活性。因此，稳定转 化体可区别于瞬时转化体，因为尽管稳定转化体的基因组DNA含有一个 或多个转基因，瞬时转化体的基因组DNA不含有转基因。

本发明的多核苷酸可以裸DNA质粒或以载体形式施用。裸DNA质粒 可通过本领域已知方法引入宿主细胞，例如，转染、电穿孔、显微注射、 转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、使用基因枪、或使用DNA 载体转运物(transporter)。

在一些优选实施方案中，本发明的多核苷酸可以载体施用。载体可为 质粒载体、病毒载体、或适于插入外源序列并引入到真核细胞中的任何其 它合适的运载体(诸如粘粒)。在某些实施方案中，载体是能够指导本发明 的抑制性多核苷酸分子的DNA序列转录为RNA的表达载体。病毒表达载 体包括，例如基于埃巴病毒、牛乳头瘤病毒、腺病毒和腺伴随病毒的载体。 在一实施方案中，载体是附加型的。使用合适的附加型载体提供了在靶细 胞中以高拷贝数染色体外维持抑制性核酸分子的手段从而消除了染色体 整合的可能效应。

载体还可包括包含表达控制元件的核酸，所述表达控制元件诸如转录 /翻译控制信号、复制起点、多腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点、启动 子、增强子等，其中所述控制元件可操作地与编码基因产物的核酸连接。 例如，编码区与启动子的可操作连接使得由特异性地识别、结合并转录编 码区的RNA聚合酶从启动子转录编码区。在某些实施方案中，编码区置 于强有力的组成型启动子之下，诸如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子或 玄参花叶病毒35S启动子。预期用于本发明的其它组成型启动子包括但不 限于：T-DNA甘露碱合成酶、胭脂碱合酶(NOS)和章鱼碱合酶(OCS)启动 子。

可选地，可使用诱导型启动子诸如胁迫诱导型启动子(如，高度光照、 干旱、盐度或温度诱导启动子)。示例性诱导型启动子包括用于在转化的植 物的光合组织中表达的核酮糖二磷酸羧化酶(RuBisCo)小亚基基因启动子 或叶绿素a/b结合蛋白(CAB)基因启动子、用于在转化的植物的种子中表达 的各种种子储藏蛋白基因启动子和用于在转化的植物的根系中表达的根 特异性谷氨酰胺合成酶基因启动子。

载体可为双元载体。例如，可使用农杆菌双元载体系统，其包括置于 如上所述的组成型或诱导型启动子控制下的选择的编码区，并连接至核药 物抗性标记，诸如卡那霉素抗性。其它有用的选择性标记系统包括但不限 于：赋予抗生素抗性(如对潮霉素或双丙氨膦(bialaphos)的抗性)或除草剂抗 性(如对磺酰脲、草丁膦(phosphinothricin)或草甘膦的抗性)的其它基因。常 用的双元载体包括pBIN19、pPVP和pGreen。

在一些实施方案中，除去、添加或改变克隆的5′未翻译部分以消除额 外的、可能不适当的替代翻译开始(即起始)密码子或在转录或翻译水平可 干扰或减少表达的其它序列也可为有益的。可选地，共有核糖体结合位点 (参见如，Kozak，J Biol.Chem.，266：19867-19870(1991))可紧密插入到起 始密码子的5′以增强表达。可经验地确定对这种修饰的需求(或需要)，且 选择这些和其它常用的载体元件是常规的。许多这种序列还可从商业可得 的载体衍生。(参见例如，Sambrook，J.等人，Molecular Cloning(分子克隆)， Cold Spring Harbor Laboratory(1989)，Sambrook，J.和Russell，D.W.(2001)， “Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆实验室手册)”，第3版， Cold Spring Harbor Laboratory Press和其中引用的参考文献、以及Ausubel 等人(编辑)Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学最新方案)， John Wiley & Sons(2000))。

本发明的载体可使用本领域已知的用于将DNA引入细胞的任何合适 的方法引入靶细胞，包括但不限于显微注射、电穿孔、磷酸钙沉淀、脂质 体介导的递送、病毒感染、原生质体融合和颗粒介导的摄取。任选地，本 发明的多核苷酸与重组酶例如recA共同施用于靶细胞，从而增强同源重组 率。如果需要，靶细胞可已经包括合适的重组酶靶序列，或已被转化以包 括合适的重组酶靶序列。例如，可将重组酶蛋白负载到靶向DNA上，如 美国专利第6,255,113号所述的。为了强化负载过程，本发明的多核苷酸可 含有一种或多种重组发生的成核序列，或通过以重组酶预培养多核苷酸而 包被有重组酶蛋白，从而重组酶非共价地结合于多核苷酸(参见例如，A. Vergunst等人(1998)，Nucleic Acids Res.26：2729和A.Vergunst和P. Hooykaas(1998)，Plant Molec.Biol.38：393 406，国际专利公布WO 99/25821、WO 99/25840、WO 99/25855和WO 99/25854，和美国专利第 5,780,296、6,255,113和6,686,515号)。

带有本发明多核苷酸之一的转基因植物可使用本领域技术人员已知 的标准植物转化方法产生，包括但不限于，农杆菌介导的转化、阳离子或 聚乙二醇处理原生质体、电穿孔、微粒子轰击、以包被有转化DNA的微 珠或微粒在溶液中搅动细胞悬浮液、直接DNA摄取、脂质体介导的DNA 摄取和类似方法，如在大范围的公众可得教科书中描述的，诸如：″Methods for Plant Molecular Biology(植物分子生物学的方法)″(Weissbach & Weissbach编辑，1988)；Clough，S.J.和Bent，A.F.(1998)″Floral dip：a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana(浸花法：农杆菌介导的转化拟南芥的简化方法)″Plant J.16， 735-743；″Methods in Plant Molecular Biology(植物分子生物学方法)″ (Schuler & Zielinski编辑，1989)；″Plant Molecular Biology Manual(植物分子 生物学手册)″(Gelvin，Schilperoort，Verma，编辑，1993)；和″Methods in Plant Molecular Biology-A Laboratory Manual(植物分子生物学方法-实验室手 册)″(Maliga，Klessig，Cashmore，Gruissem & Varner，编辑，1994)。还参见 Sambrook，J.等人，Molecular Cloning(分子克隆)，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)，Sambrook，J.and Russell，D.W.(2001)，″Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆实验室手册)″，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press和其中引用的参考文献，和Ausubel等人(编辑) Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学最新方案)，John Wiley & Sons(2000)，这些参考文献通过交叉引用的方式并入本文。

优选的转化方法可取决于待转化的植物。农杆菌载体通常用于转化双 子叶物种。为了转化单子叶物种，以包被有转化DNA的颗粒和包被有转 化DNA的硅纤维生物弹轰击通常可用于核转化。然而，农杆菌介导的包 括小麦的单子叶物种的转化也是已知的(参见例如，国际专利公布WO 97/48814；还参见Hiei，Y.等人(1994)，Plant J.6(2)：271-282和国际专利公布 WO 92/06205)。

使用本发明的方法和材料可转化任何植物细胞以产生遗传修饰的植 物、植物细胞、植物组织、种子及类似物。根据本领域已知的常规方法， 已经转化的植物细胞可生长为植株(参见例如，McCormick，S.等人(1986)， Plant Cell Reports 5：81-84))。所得的植物可自花授粉、以相同的转化株系或 不同株系授粉或杂交，且鉴定具有与SEQ ID NO：1或其同系物相关的期 望的性状的所得植物。可栽培两代或更多代以确保该表型特征被稳定地保 持。可选地，在无性繁殖作物中，成熟突变体/转基因植物可通过切割或通 过组织培养技术繁殖以产生相同植物。为了商业应用，可进行突变体/转基 因植物的选择且可获得新品种并无性繁殖。

还提供了从由本发明方法获得的植物获得的植物部分，包括但不限于 根、茎、叶、芽、花、茎干、种子、块茎、果实和枝。

由本发明方法转化的植物或植物部分可基于性状表达肉眼鉴定。更优 选地，使用分子分析鉴定转化的植物或植物部分，所述分子分析采用了靶 基因的特异性寡核苷酸探针和/或靶基因的扩增。来自待分析的主题植物或 植物部分的DNA或RNA可由本领域技术人员已知的许多合适的方法提 取，诸如大范围的熟知教科书中描述的，包括(但不限于)Sambrook，J.等人， Molecular Cloning(分子克隆)，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)， Sambrook，J.和Russell，D.W.(2001)，″Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆实验室手册)″，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press和其中引用的参考文献，和Ausubel等人(编辑)Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学最新方案)，John Wiley & Sons(2000)，通过交 叉引用并入本文。还参见以下描述的方法：Lukowitz，W.，Gillmor，C.S.和 Scheble，W-R.(2000)″Positional Cloning in Arabidopsis：Why It Feels Good to Have a Genome Initiative Working for You(拟南芥中的位置克隆：为什么 对你来说具有基因组创始工作很好)″Plant Physiology 123，795-805和其中 引用的参考文献。

可由本领域中已知的任何合适方法分析提取的DNA或RNA中是否存 在转基因，且采用何种方法/策略可取决于期望的特异性、和合适的序列和 /或酶的可获得性。例如，可使用TRIzol方法分析提取的RNA，并在进行 定量PCR之前以无RNA酶的DNA酶I处理提取的RNA。

用于扩增HOG1部分的合适的引物对包括：PET1：5′-A(AG) ATGCC(CT)GG(ACT)CT(ACT)ATG(GT)C(ACT)T-3′(SEQ ID NO：24) 和PET2：5′-TC(AG)AACTTGCTCTTGGT(AG)AC(AG)-3′(SEQ ID NO： 25。用于分析HOG1基因或其同系物的其它合适的引物或引物对可基于 SEQ ID NO：1设计。

用于PCR扩增反应的方法和试剂是本领域技术人员熟知的。合适的方 案和试剂将很大程度上取决于具体的情况。可从多种来源获得指导，诸如 例如Sambrook，J.等人，Molecular Cloning(分子克隆)，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)，Sambrook，J.和Russell，D.W.(2001)，″Molecular Cloning： A Laboratory Manual(分子克隆实验室手册)″，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press和其中引用的参考文献，和Ausubel等人(编辑)Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学最新方案)，John Wiley & Sons (2000)，通过交叉引用并入本文。本领域技术人员还将易于理解，可改变 PCR反应的各种参数而不影响扩增期望的产物的能力。例如可改变采用的 Mg²⁺浓度和温度。类似地，还可改变用作模板的基因组DNA的量，取决 于可得的DNA的量。

其它分析方法包括电泳，诸如琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，这是本 领域技术人员基于大小分离DNA片段的常用技术。凝胶中琼脂糖或聚丙 烯酰胺的浓度很大程度上决定了凝胶的分辨能力，且琼脂糖或聚丙烯酰胺 的适当浓度因此将取决于待分辨的DNA片段的大小。

检测和/或确定转基因或其同系物的存在可辅助以使用任何适当的软 件的计算机分析。用于比较确定的核苷酸序列的合适的软件包是本领域熟 知的并易于获得。

缩写

2iP-2-异戊烯基腺嘌呤

AHK-拟南芥组氨酸激酶

AHP-拟南芥组氨酸磷酸转移蛋白

AMM-天冬酰胺最低限度培养基

ARR-拟南芥响应调节子

AS-反义抑制

A-腺苷

BA-苄基腺嘌呤

BLAST-基本局部比对搜索工具

CAB-叶绿素a/b结合蛋白基因

CaMV-花椰菜花叶病毒

CRE-细胞激动素响应

cDNA-互补脱氧核糖核酸

DNA-脱氧核糖核酸

ELISA-酶联免疫吸附测定

ETR1、ERS2、ETR2和EIN4-乙烯受体

FAB-快原子轰击

G-鸟嘌呤

GFP-绿色荧光蛋白

HOG1-同源性依赖性基因沉默1

HSP-高得分序列对

ITC-等温滴定量热法

KD-解离常数

KNAT1-拟南芥打结同系物1

LAI-叶面积指数

LAR-叶面积比率

mRNA-信使RNA

NCBI-美国国家生物技术信息中心

NOS-胭脂碱合酶

OCS-章鱼碱合酶

OE-过表达

OsCBP-水稻细胞激动素结合蛋白

PCR-聚合酶链式反应

PNA-肽核酸

PETCBP-矮牵牛细胞激动素结合蛋白

RNA-核糖核酸

RNAi-RNA干扰

RuBisCo-核酮糖二磷酸羧化酶

SAH-S-腺苷高半胱氨酸

SAM-S-腺苷甲硫氨酸

siRNA-小干扰RNA

SSC-1-2X氯化钠和柠檬酸钠

SAHH-S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶

SLA-比叶面积

STM-无茎干分生组织(Shoot Meristemless)转录因子

T-胸腺嘧啶

TDNA-转移的DNA

Tm-热熔点

U-尿嘧啶

WT-野生型

ZR-玉米素核苷

附图简述

附图示意公开的实施方案并用于解释公开的实施方案的原理。然而应 理解的是，设计这些图只是为了示意，不作为对本发明范围的限定。

图1显示等温滴定量热法、HOG1定位和表达分析的结果。A)以ITC 进行细胞激动素结合测定。上图显示将原始热数据对从注射0.1μM玉米素 到含有2μM纯化TAP-HOG1的样品细胞获得的基线漂移校正。下图显示 将热峰面积对加至HOG1的玉米素摩尔比绘图产生的结合等温线。插图显 示从转基因植物纯化的TAP-HOG1蛋白(60kDa)。B)对尿素衍生的合成细 胞激动素噻苯隆的测定的执行同玉米素。C)HOG1-细胞激动素结合是吸热 的，具有2∶1的化学计量。对所测试的三种细胞激动素即玉米素、苄基 腺嘌呤(BA)和2-异戊烯基腺嘌呤(2iP)的KD值的范围为从16.9nM至20.6 nM。对腺嘌呤和NAD+的KD值分别为2.1μM和39.5μM，显示HOG1 的细胞激动素特异性。D)表达GFP-HOG1融合蛋白的转基因株系展现与 35S:HOG1株系相同的表型，显示融合蛋白保留其功能。E)GFP-HOG1融 合蛋白定位在质膜中。以488nm氩激光连同505-至530-nm带通的过滤设 置使用共聚焦激光扫描显微镜(Zeiss CLSM 510)进行活幼苗根细胞成 像。插图显示在单个细胞中，蛋白定位于质膜。F)定量实时PCR分析HOG1 的表达显示基因在检查的所有植物部分中组成型地表达。

图2显示通过定量实时PCR分析HOG1在拟南芥的过表达和反义抑 制株系中的表达。A)与野生型相比，八个独立的过表达株系显示HOG1 转录物水平增加3至20倍。B)和C)用于实时PCR分析的过表达株系的 表型一致，尽管转录物水平有差异。D)与野生型相比，HOG1反义抑制株 系显示转录物表达水平减少2至10倍。E)和F)用于表达分析的八个反义 株系的开花时间表型与HOG1转录物的抑制水平直接相关。G)、H)、I)和 J)对OE株系6的三株单独幼苗和两株WT植物以玉米素(0.01μM)隔天喷 洒持续四周时间，以观察外源施加的细胞激动素是否可在OE株系中延迟 开花到与WT相同的阶段。G)与对照OE株系(无玉米素)相比，以玉米素 喷洒的OE植物显示抽薹延迟，而I)对照OE株系在4莲座叶阶段抽薹。 H)以玉米素喷洒的OE植物在到达6至7叶阶段后才显示抽薹，与WT 植物几乎在相同阶段，显示外源施加细胞激动素拯救OE株系。J)OE株系 的对照个体(未喷洒玉米素)在此阶段已经完全开花并生长到其最大生产 量。

图3显示HOG1过表达(OE)、反义抑制(AS)和野生型(WT)植物的表型。 A)HOG1 OE株系当其发育了仅四片莲座叶时就显示开花，此时WT还未 开始开花。B)HOG1的AS株系显示延迟开花(抽薹时为14叶阶段)，此时 WT已经充分发育花序。C)比较OE、WT和AS株系成熟时的表型。当与 WT相比时，观察到萌发30天后OE株系的总生长延迟和AS株系的大量 发枝的表型。D)与WT和OE株系相比，AS株系中莲座叶大小增加。E)与 WT相比，AS株系中长角果大小增加，而OE株系中的显著减少(比例尺 ＝1cm)。F)在生长素吲哚丁酸(0.2μg/ml)存在下，愈伤组织对各种浓度的 外源细胞激动素(玉米素)的响应。AS株系的愈伤组织展现强的细胞激动素 不敏感表型，即，培养3周后的弱细胞增殖刺激和缺失不定芽(adventitious shoot)诱导。OE株系的愈伤组织的响应与WT类似，即，都展现正常愈 伤组织发育和不定芽诱导，显示HOG1是细胞激动素的正调节子。G)定 量OE、WT和AS株系中的细胞激动素水平。使用异戊烯基腺苷和玉米素 核苷检测试剂盒(Sigma)，以单克隆抗体iPA和ZR通过免疫测定方法定量 内源细胞激动素。给出的值代表三次独立提取的三次重复的平均值±SD。 测量的细胞激动素是异戊烯基腺嘌呤(iP)、异戊烯基腺苷(iPA)、玉米素(Z) 和玉米素核苷(ZR)。H)分光光度测定各株系和纯化的TAP-HOG1蛋白的 S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)活性。WT、OE和AS株系的粗蛋白提取 物未观察到显著的活性差异，而纯化的TAP-HOG1蛋白不具有可测的 SAHH活性。

图4显示所选的细胞激动素响应基因和HOG1-AHP1相互作用的定量 实时PCR分析。在用苄基腺嘌呤(BA)以0μM、0.01μM、0.1μM、1μM 或5μM脉冲处理数个时间间隔(5min、15min、30min和1h)之前和之后 从三个独立的反义抑制(AS1、AS8、AS21)和过表达(OE1、OE12、OE18) 株系收获幼苗以进行RNA提取。施加BA导致KNAT1和STM转录物剂 量依赖性增加。A)在不存在外源BA下，AS株系显示上调KNAT1和STM (参与分生组织功能的同源异型框基因)，而OE株系显示下调这两种基因。 以5μM BA处理1h后，KNAT1和STM的表达显示少于两倍的改变，与 WT相比不显著。B)ARR4和ARR6(细胞激动素诱导的A型响应调节子) 也显示表达水平的类似趋势。C)纯化TAP-HOG1复合体。从35S: TAP-HOG1植物提取总蛋白(泳道1)且使用ProtA和CBP标签的亲合柱纯 化后导致鉴定大约24kDa的条带(星号)，由N-末端测序证实该条带为 AHP1(泳道2)。以针对ProtA标签的抗体为探针的总蛋白的蛋白质印迹显 示存在对应于TAP-HOG1的71kDa条带。D)重组AHP1纯化的SDS-聚 丙烯酰胺凝胶电泳。在大肠杆菌中表达AHP1为带有6-His和硫氧还蛋白 标签。泳道1是总细胞裂解物，且带有标签的纯化的AHP1在泳道2中。 E)以ITC进行的TAP-HOG1和AHP1相互作用。E)的上图显示将原始热 数据对从注射0.1μM纯化的AHP1进入含有2μM纯化的TAP-HOG1的样 品细胞获得的基线漂移校正。下图显示将热峰面积对加至HOG1的AHP1 的摩尔比绘图产生的结合等温线。TAP-HOG1和AHP1结合是吸热的，KD 值为23.8nM。

图5是经由HOG1的细胞激动素信号转导途径的图示。细胞激动素信 号由HOG1在质膜感知。HOG1二聚体经由AHP1开始信号转导级联，AHP1 可与B型ARR(如ARR1、ARR2)和A型ARR(如ARR4、ARR5)相互作用。

图6显示HOG1与同系物的多序列比对。将HOG1的推论的氨基酸序 列(SEQ ID NO：1)与来自矮牵牛(SEQ ID NO：13)、烟草(SEQ ID NO：3)、 水稻(SEQ ID NO：5)、小麦(SEQ ID NO：7)和人类(SEQ ID NO：26)的SAHH 序列比对。SAHH的两个保守的标志标为粗体。在SAHH的第2个标志中， 代表二核苷酸结合域的三个保守的甘氨酸残基标有下划线。7(HOG1的位 置1-7)氨基酸的N-末端段和41氨基酸(HOG1的位置150-191)的另外段以 及螺旋跨膜区(HOG1的位置59-76)标为斜体。

图7显示外源施加细胞激动素对HOG1的野生型(WT)、过表达(OE) 和反义抑制(AS)株系的效应。对OE株系6和AS株系12的三株单独幼苗 以玉米素或激动素(0.01μM)隔天喷洒持续四周时间。类似地处理两株WT 植物以比较。A)和C)在生长的4叶阶段，当与对照OE株系相比时，以 玉米素和激动素喷洒的三株单独OE株系6不显示任何抽薹。E)对照OE 株系在4叶阶段抽薹。B)和D)分别地以玉米素和激动素喷洒的三株单独 OE株系6显示仅在达到6-7叶阶段后抽薹。这显示外源施加的细胞激动素 部分地拯救OE株系。F)OE株系6的对照个体在此阶段已经成熟。G)、 H)、I)、J)和K)当与对照AS株系相比时，接受细胞激动素喷洒的AS株 系未显示表型的任何显著差异。这显示过表达HOG1导致损耗内源细胞激 动素含量(如表1中所示)并因此影响表型。(注意图A、B、E和F为主图2 中的图G、H、I和J，它们包括在此处仅为了便于比较)。

图8显示转基因拟南芥植物。(a)与野生型(WT)对照相比，在约3周 时，过表达(OE)HOG1的拟南芥幼苗显示提早抽薹，但HOG1的反义抑制 (AS)导致延迟开花。(b)在萌发30天后，对与野生型(WT)相比的各为OE (OE8、OE12)和AS(AS8、AS21)的两株单独转基因株系的成熟植物拍照。 与OE和WT植物相比，AS株系的花序大量分枝且生物量显著更高。(c)AS 株系的叶面积和(d)长角果长度以及种子(图f的插图)显著高于OE和WT 的。(e)定量实时PCR分析(d)中的植物中的HOG1转录物的表达水平。(f) 定量叶面积、种子重量、每个长角果的种子数目和细胞激动素异戊烯基腺 嘌呤的内源浓度显示AS中的值最高，随后分别是WT和OE株系。

图9显示以过表达(OE)或反义抑制(AS)含有拟南芥HOG1 cDNA的转 基因水稻(粳稻品种日本晴(Oryza sativa ssp.japonica cv Nipponbare))植物 导致OsCBP水平改变。(a)萌发约四周后分蘖开始时OE和AS株系的幼 苗。(b)萌发后约90天时OE和AS株系的成熟植物。与WT相比，AS株 系展现大量分蘖和生物量增加，而OE植物保持矮小。(c)连根拔起的OE、 WT、AS和共抑制(CS)成熟植物显示AS和CS植物具有相当的更高的每植 物的分蘖数。(d)CS植物显示从地上节的发枝，导致每植物的圆锥花序数 目总体增加。(e)与其它株系相比，OE株系的圆锥花序显著更小。(f)定 量实时PCR分析WT中OsCBP转录物的表达水平、OE株系(S-2L、S-9T) 中引入的拟南芥HOG1转录物水平、CS株系(CS-4T、CS-1)和AS株系 (AS-1S-2、AS-4S-2)中内源OsCBP转录物水平减少。(g)定量每植物的分 蘖数目、圆锥花序、叶面积、鲜重和种子总数显示，与WT相比，AS和 CS株系中测量的参数显著较高，这与在拟南芥中的观察结果一致。

图10显示：(a)HOG1(SEQ ID NO：1)、PETCBP(SEQ ID NO：13) 和OsCBP(SEQ ID NO：5)的多比对。PETCBP(SEQ ID NO：13)和OsCBP (SEQ ID NO：5)显示88％同一性。与PETCBP(SEQ ID NO：13)和HOG1 (SEQ ID NO：1)的88％同一性相比，HOG1(SEQ ID NO：1)和OsCBP(SEQ ID NO：5)显示90％同一性。(b)OsCBP的基因组blast显示其存在于染色 体11(Os11g0455500)，说明其在水稻基因组中为单拷贝 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。

图11显示以ITC进行的细胞激动素结合测定结果。上图显示将原始 热数据对从注射0.1μM苄基腺嘌呤进入含有2μM纯化的TAP-HOG1的样 品细胞获得的基线漂移校正。下图显示将热峰面积对加至HOG1的苄基腺 嘌呤的摩尔比绘图产生的结合等温线。

图12显示具有过表达(OE)拟南芥HOG1或由拟南芥HOG1诱导的反 义抑制(AS)OsCBP的转基因水稻(粳稻品种日本晴)植物的表型。(a)具有共 抑制效应的OE株系(图右边，对照在左边)显示每植物的分蘖数目增加。(b) 成熟的AS、野生型(WT)和共抑制(CS)株系。与杂交(hybrid)母体株系(WT) 相比，AS和CS株系表现每植物的更多分蘖(发枝)数目。(c)WT和AS株 系的种子大小无显著差异。当与WT相比时，在OE观察到种子大小的一 些减少。(d)和(e)OE和AS株系在T1代的Southern印迹。(d)第1泳道是 标记物。泳道2至11是独立的OE株系。泳道2(OE株系S1)、泳道5(OE 株系4)和泳道8(OE株系7)显示单个插入。泳道4(OE株系3)、泳道7(OE 株系6)、泳道9(OE株系9)、泳道10(OE株系10)和泳道11(OE株系11) 显示双插入，而泳道3(OE株系2)和泳道6(OE株系5)各显示三插入。(e) 泳道2(株系AS1)、泳道3(株系AS2)、泳道4(株系AS3)和泳道6(株系 AS5)显示单插入。泳道5(株系AS4)显示双插入。对各泳道，使用从叶提 取，以EcoRI酶消化的基因组DNA(6μg)。使用的探针是DIG标记的潮霉 素磷酸转移酶基因。在信号显现之前，以高严格性洗涤印迹。

最佳方式

包括最佳方式和对比实例的本发明的非限制性实例将通过参考具体 实施例而进一步更详细地描述，具体实施例不应以任何方式解释为限制本 发明范围。

实施例1

拟南芥同源性依赖性基因沉默1(HOG1)是推定的细胞激动素受体

材料和方法

植物材料和生长条件

本研究中使用拟南芥哥伦比亚生态型。植物在22℃、16h光/8h暗下 生长。对于幼苗测定，将种子表面灭菌并在4℃黑暗中层化2天，随后暴 露于白光(75μE.m^-2.s^-1)。幼苗在22℃下在含有3％蔗糖和0.9％琼脂的 Murashige-Skoog(MS)培养基上生长。对于萌发实验，将特定批次的种子 播种在无蔗糖的MS培养基。

质粒构建和遗传转化拟南芥

以5′和3′RACE策略扩增全长拟南芥HOG1 cDNA(SEQ ID NO：2)。 SMARTTM RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech Laboratories)用于鉴定 cDNA的5′-和3′-cDNA(5′/3′-RACE)末端序列。对这些PCR产物测序。将 部分序列和RACE PCR产物一起比对以获得拟南芥HOG1的全长cDNA 序列(SEQ ID NO：2)。

pGreen 0229双元载体(Yu等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：7827-7832，2004)用于所有转基因构建体。对于反义抑制，使用HOG1 的跨两个SAHH标志的850bp片段(SEQ ID NO：15)。HOG1 cDNA的完 整开放读码框用于过表达构建体和用于GFP-HOG1构建体。

以Prot A和钙调蛋白结合肽标签制备TAP-标签化的HOG1，两个标签 之间有TEV裂解位点(Forler等人Nature 21：89-92，2003)。通过根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)介导的真空渗透方法(Hiei等人，同上)将构建体 引入拟南芥。

实时PCR分析

以TRIzol方法(Invitrogen)从幼苗提取总RNA。以无RNA酶的DNA 酶I处理的总RNA(0.5μg)用于每个定量PCR反应，根据制造商的说明书 以一步RT试剂盒(Qiagen)进行定量PCR反应。使用SYBR green进行定量 实时PCR。将Ct值对微管蛋白2Ct值标准化以根据制造商的方案计算变 化倍数。

等温滴定量热法(ITC)

以ITC(MCSITC，Microcal，Northampton，USA)检查HOG1与细胞激动 素的相互作用的细胞激动素结合亲合力和热力学分析。使用三种天然产生 的细胞激动素(玉米素、苄基腺嘌呤和异戊烯基腺嘌呤)和噻苯隆(一种尿素 衍生的合成的细胞激动素)。此外，腺苷和NAD用作对照分子以证实HOG1 对细胞激动素的结合特异性。由MICROCAL ORIGIN 2.9版本分析数据， 使用用于一个结合位点的最佳拟合的非线性最小平方方法。从拟合的曲线 计算结合化学计量(n)和缔合常数(KA)。随后，计算KD为1/KA。将原始 热数据对从注射0.1μM纯化的AHP1进入含有2μM纯化的TAP-HOG1 的样品细胞获得的基线漂移校正。将热峰面积对加至HOG1的AHP1的摩 尔比绘图而产生结合等温线。

亚细胞定位GFP-HOG1融合蛋白

根据其表型选择表达单个35S：GFP-HOG1融合构建体的转基因植物。 切下5天幼苗的根并放入强度减半的MS培养基，紧接着以488nm氩激光 连同505-至530-nm带通的过滤设置进行共聚焦激光扫描显微镜检(Zeiss CLSM 510)。

愈伤组织的细胞激动素响应测定

幼苗根段在愈伤组织诱导培养基(补充0.5μg/ml 2，4-二氯苯氧乙酸和 0.05μg/ml激动素的MS培养基)培养4天。所得的愈伤组织在茎干诱导培 养基(补充0.2μg/ml吲哚丁酸和各种浓度玉米素的MS培养基)培养30天， 每10天间隔将其继代培养到新鲜培养基，根据Inoue等人(Nature 409：1060-1063，2001)的方法。

细胞激动素含量和SAHH酶测定

以100％甲醇从全植株提取细胞激动素并使用异戊烯基腺苷和玉米素 核苷检测试剂盒(Sigma)定量，如Yang等人(FEBS 555：291-296，2003)所述 的。对抽薹植物的粗蛋白提取物进行SAHH分光光度测定，如Rocha等人 (Plant Cell 17：404-417，2005)所述的。

细胞激动素初级响应基因的表达

对于细胞激动素可诱导的基因表达的定量实时PCR(qRT-PCR)分析， 种子在含有3％(w/v)蔗糖的MS培养基上萌发并生长6天。通过在补充0、 0.01、0.1、1或5μM[溶解于0.1％二甲亚砜(DMSO)并以MS培养基稀释] 的相同MS+蔗糖液体培养基(无琼脂)培养幼苗5min、15min、30min或1 h进行细胞激动素处理。以DMSO(0.1％，用于溶解用于处理的细胞激动 素的浓度)培养对照幼苗相应的时间并用于表达分析。在制备RNA之前， 将WT、OE和AS幼苗集中在一起并储存在RNAlater溶液(Qiagen，Valencia， CA)。使用Rneasy Plant Mini试剂盒(Qiagen)提取总RNA。SYBRgreen RT-PCR试剂(Applied Biosystems)用于合成双链cDNA。从三次独立重复确 定有或没有BA和DMSO的WT、OE和AS幼苗各自的生物重复中存在的 转录物数目。根据制造商的说明(ABI Prism 7700Sequence Detection System， User Bulletin#2)计算转录物的诱导倍数。

TAP-HOG1和AHP1相互作用研究

使用ProtA和CBP标签纯化TAP-HOG1蛋白复合体，如之前在Forler 等人(同上)中所述的。对于ProtA下拉(pulldown)，使用IgG琼脂糖珠 (Amersham Biosciences#17-0969-01)和对于CBP下拉，使用钙调蛋白亲合 树脂(Stratagene#214303-52)。对纯化的蛋白进行SDS-PAGE并使用标准方 案印迹于PVDF膜，以用于蛋白质印迹分析。而且，对下拉的HOG1-复合 体进行SDS-PAGE电泳，并进行N-末端测序以鉴定获得的主要条带。由 于AHP1是主要的推定的相互作用蛋白条带，从拟南芥克隆AHP1的cDNA 且将重组AHP1在大肠杆菌BL21中表达为带有6-HIS标签和硫氧还蛋白 标签(在表达载体PET32EK/LIC中，Novagen)。使用HIS-标签亲合柱(BioRad) 纯化带有标签的重组AHP1。如上所述的由ITC(MCS-ITC，Microcal， Northampton，USA)进行蛋白相互作用(HOG1-AHP1)研究。

结果和讨论

本发明人使用反义抑制和过表达策略来分析HOG1牵涉在细胞激动素 信号转导和调节植物发育中。

HOG1的cDNA克隆(SEQ ID NO：2)与多个物种的植物和动物的S- 腺苷-L-高半胱氨酸水解酶(SAHH)展现显著的序列相似性。与从多个植物 物种分离的同系物的比较表示HOG1在不同植物物种中是保守的(图6)。 尤其是，矮牵牛中的同系物(SEQ ID NO：14)与HOG1共有78％的序列相 似性，烟草中的同系物(SEQ ID NO：4)与HOG1共有78％的序列相似性， 水稻中的同系物(SEQ ID NO：6)与HOG1共有82％的序列相似性，和小麦 中的同系物(SEQ ID NO：4)与HOG1共有83％的序列相似性。

为了检查HOG1的细胞激动素结合亲合力，从转基因拟南芥(含有35S: TAP-HOG1)纯化TAP-HOG1蛋白，该植物也用于蛋白-蛋白相互作用研究。 标签化的蛋白是功能性的，因为转基因植物显示与HOG1过表达株系相同 的表型。使用蛋白A(Prot-A)和CBP(钙调蛋白结合肽)标签纯化蛋白。纯 化后，蛋白保留TAP标签的CBP部分，产生60kDa的大小(图1A插图)， 而无TAP标签的CBP部分的单独HOG1应为56kDa。

(a)HOG1以高亲合力结合细胞激动素

细胞激动素分子有效地结合纯化的蛋白，如纯化的TAP-HOG1与各种 细胞激动素的等温滴定量热法(ITC)所指示的。ITC是一种用于研究配体- 受体结合动力学的生物物理技术，其产生相互作用的重要热动力学参数， 包括结合亲合力(KA)、和因此的解离常数(KD)、以及结合化学计量(n)。

细胞激动素分子(玉米素、苄基腺嘌呤和异戊烯基腺嘌呤)和噻苯隆(一 种合成的尿素衍生的分子，具有细胞激动素活性)用于结合研究。腺嘌呤和 NAD用作对照来确定HOG1的结合特异性。

ITC确定的结合化学计量显示两个HOG1单体结合一个细胞激动素分 子(化学计量为2∶1)(图1A-1C)，但不结合噻苯隆(图1B和1C)。这显示 HOG1结合细胞激动素的特异性。

如从图1C可见的，所测试的不同细胞激动素的解离常数(KD)为从16.9 到20.6nM。而且，腺嘌呤的KD为2.1μM，这暗示HOG1对腺嘌呤的亲 合力比对细胞激动素分子的显著较低。这与腺嘌呤当在一些组织培养物中 以相当高浓度使用时仅引起弱的细胞激动素响应的事实一致。

由于NAD⁺是SAHH的已知辅因子，由ITC测量HOG1和NAD⁺复合 体的KD值，为39.5μM(图1C)，这进一步暗示HOG1是细胞激动素受体， 而不太可能是功能性的SAHH酶。

(b)HOG1定位于质膜上

使用哥伦比亚大学的PHDhtm网络资源(www.cubic.bioc.columbia.edu) 进行对HOG1蛋白的结构域搜索。搜索显示HOG1蛋白具有典型的受体样 结构。HOG1蛋白具有预测的跨膜螺旋(跨SEQ ID NO：1的残基59到76 的18个氨基酸)，和位于膜外的预测的细胞激动素结合域(跨SEQ ID NO： 1的残基77到485的409个氨基酸)。所述蛋白还具有推定的细胞质内的 位点，用于与下游信号转导中间物相互作用，其包括在N-末端的58个氨 基酸(从SEQ ID NO：1的残基1到58)。

为了物理地确定HOG1蛋白的亚细胞定位，产生表达绿色荧光蛋白 (GFP)-HOG1融合体的转基因拟南芥植物。在分离的七种独立GFP株系中， 选择三种用于分析。表达GFP-HOG1融合蛋白的T3代转基因植物显示与 HOG1过表达株系相同的表型(图1D)，这表示融合蛋白保留了其功能。

共聚焦激光扫描显微镜检从所选株系新鲜切下并置于强度减半的MS 培养基的根显示，GFP-HOG1位于质膜上(图1E)，这暗示HOG1是细胞激 动素的膜受体。作为对照，使用对拟南芥的较早研究报告，其中显示35S： GFP在细胞质和核中相当均匀地表达(Zhang Plant Cell 17：1306-1316， 2005)。基于序列分析，螺旋跨膜域(跨18个氨基酸)存在于HOG1和其它 植物同系物，但不存在于人类和大鼠SAHH(图6)，后两者是细胞质蛋白 (Shu等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103：19788-19793)。而且，预期活性 SAHH酶是可溶性蛋白，而不是保持结合于质膜，因为该酶与发生在各细 胞区室的甲基化反应密切相关。因此，以GFP-HOG1的本实验结果暗示 HOG1蛋白是膜受体。

(c)HOG1过表达和反义抑制植物显示相反表型

定量实时PCR分析指出HOG1在拟南芥中组成型地表达，在叶和花 序茎中有相对较高水平(图1F)。这暗示HOG1可在调节植物发育中起基本 作用。

为了检查调节HOG1表达水平对植物生长和发育的效应，产生了各种 HOG1过表达和反义抑制株系。与野生型相比时，各种HOG1过表达株系 显示HOG1转录物水平增加3至20倍(图2A)，而反义株系显示2至10倍 的抑制(图2B)。

转基因表达影响植物发育的所有阶段并在多种独立转基因株系中展 现一致的表型(图2C、2D、2E和2F)。记录28株独立转基因过表达株系和 21株反义抑制株系的表型以提供对改变是由引入的基因产物所导致的进 一步的支持。与野生型相比，过表达株系中种子萌发发生早4至5天，而 与野生型相比，反义抑制株系中晚大约5天(表1)。不过，在过表达株系萌 发后很快观察到显著的生长延迟。在过表达株系的营养生长期间，新莲座 叶的形成和展开也受到延迟和限制。

表1.种子萌发、开花开始和衰老：每种观察使用五株独立株系。对 每种株系，数据是三次独立重复的平均值。反义株系显示晚萌发、晚抽薹 和延迟衰老。

反义抑制株系显示茎干生长无延迟，尽管种子萌发延迟。当与野生型 拟南芥和反义株系相比时，在过表达转基因植物观察到更早开始开花，其 在4莲座叶阶段抽薹(图3A、表1)，野生型拟南芥和反义株系在抽薹时分 别地具有至少8和14叶(图3B、表1)。

开始开花后，过表达株系未显示叶生物量的任何进一步增加，且甚至 在生长30天后当这些株系开始衰老时还无叶腋花序枝形成(图3C)。相反， 此期间反义株系显示大量发育叶腋花序枝且在这些株系衰老不明显(图 3C)。反义株系还具有最大的叶面积(每叶2.94±0.15cm²)。过表达株系 (0.38±0.06cm²)和野生型植物(1.00±0.06cm²)中叶面积显著较低(图3D、表 2和3)。过表达株系中总植物高度、长角果大小以及作为结果的每长角果 的种子数目和重量(表2和3)显著减少，而反义抑制株系中长角果长度显著 地高于野生型的(图3E)。转基因株系中叶面积和每长角果的种子重量以及 叶面积和每长角果的种子数目之间有正相关性(表3)。

表2.叶面积、每长角果的种子重量和种子数目：数据代表三次独立 重复的平均值±SD。每种情形使用五株独立株系。与野生型相比，反义株 系的叶生物量有三倍增加，且种子产量有两倍增加。

表3.对生物量和种子产量有贡献的参数的皮尔逊氏(Pearson′s)相关 系数(r)：检验以下之间的相关系数：叶面积(cm²)x每长角果的种子重量 (mg)(A)；叶面积(cm²)x每长角果的种子数目(B)；和每长角果的种子重 量(mg)x每长角果的种子数目(C)。相关性分析后，进行学生t-检验(Student′s t-test)。t-检验值在括号中给出。‘r’值显示所有检验中的正相关性。基于 此，预测HOG1的反义抑制导致对叶生物量和种子产量有贡献的关键参数 增加。

  植物基因型   A   B   C   野生型   0.898   (t＝2.043)   0.857   (t＝2.755)   0.795   (t＝3.84)   HOG1反义株系   0.763   (t＝2.043)   0.847   (t＝2.755)   0.912   (t＝3.84)   HOG1过表达株系   0.769   (t＝2.078)   0.979   (t＝2.878)   0.767   (t＝2.269)

当与野生型植物相比时，过表达株系成熟较早，过表达株系成熟早于 野生型植物大约一周(图3A)，而反义抑制株系成熟晚于野生型两周。而且， 当与野生型拟南芥相比时，HOG1反义抑制株系中衰老延迟两周(图3C、 表1)。

为了研究HOG1作为细胞激动素受体的作用，检查转基因HOG1植物 的愈伤组织培养物对外源细胞激动素的敏感性，类似于对CRE1的研究 (Inoue等人，同上)。不同于全植株中的茎干顶端分生组织，愈伤组织培养 物具有响应于营养培养基中提供的外源细胞激动素的潜力并不取决于如 在完整植物中的激素长途运输。来自HOG1过表达株系和野生型的愈伤组 织培养物展现正常的细胞增殖和不定芽诱导(图3F)。相反，来自反义HOG1 株系的愈伤组织展现强的细胞激动素不敏感表型，即，在提供的所有浓度 玉米素下不存在细胞增殖和缺乏不定芽诱导(图3F)。这些数据显示HOG1 的作用为细胞激动素响应的正调节子。

(d)转基因植物的对比表型与内源细胞激动素水平相关

AHK-型细胞激动素受体的功能丧失三突变体导致(Higuchi等人Proc. Natl.Acad.Sci.USA 101：8821-8826，2004)与本HOG1反义抑制观察到的相 反的表型。这种相反表型可由在过表达株系中HOG1蛋白可能阻碍细胞激 动素运输而解释。

对三株独立株系(各为野生型、过表达和反义抑制株系)确定内源细 胞激动素含量。与野生型相比，过表达株系中测量的不同细胞激动素浓度 显著减少(图3G)。异戊烯基腺嘌呤是拟南芥的主要细胞激动素，且与野生 型相比，过表达株系中其浓度减少约60％(图3G)。过表达株系中蛋白的更 高可得性可造成对细胞激动素跨质膜运输的障碍，尤其是因为细胞激动素 必须被从根运输到茎干顶端分生组织。这将导致明显的功能丧失表型，即， 观察到植物高度减少和缺乏营养生物量(图3A)。

相反，与野生型相比，在反义株系中异戊烯基腺嘌呤浓度增加超过 60％，这对应于比过表达株系增加多于四倍(图3G)。这导致大量发枝和生 物量显著增加的相反表型。

为了对此进行实验检测，研究了外源施加细胞激动素对转基因株系表 型的效应。当与未处理的过表达株系相比时，从幼苗阶段隔天接受0.01μM 玉米素或0.01μM激动素喷洒的过表达株系在6至7叶阶段显示抽薹，未 处理的过表达株系在4叶阶段抽薹(图2G、2H、2I、2J和图7)。野生型拟 南芥在大约8叶阶段抽薹，表示过表达株系被外源施加细胞激动素“部分 地拯救”。

而且，反义抑制株系未显示响应于外源施加的细胞激动素的显著改变 (图7)，支持观点对细胞激动素运输的阻碍很可能造成我们研究中观察到的 相反表型。

(e)纯化的HOG1缺少SAHH酶活性

野生型(2.92±0.15nmol/min/mg蛋白)、反义(2.84±0.21 nmol/min/mg蛋白)和过表达株系(3.02±0.19nmol/min/mg蛋白)的粗蛋白提 取物中SAHH活性无显著差异(图3H)，尽管之前报道hog1点突变体的粗 蛋白提取物与野生型的相比具有略低的SAHH活性(Rocha等人Plant Cell 17：404-417，2005)。更重要地，本研究数据显示，纯化的TAP-HOG1蛋白 缺少SAHH酶活性(图3H)。这些结果暗示本研究的HOG1蛋白可为细胞 激动素受体。

而且，Rocha等人(同上)中强调，点突变体(hog1-1)的粗蛋白提取物中 测量的SAHH活性的微小差异可取决于一些其它位点。此外，SAHH活性 减少应导致SAH水平增加和SAM∶SAH比率减少。然而，显示hog1-1 纯合子显示SAH水平可忽略的增加，且SAM∶SAH比率的变化相对小。 这些突变体中显示的基因组广泛甲基化不足也与(S)-9-(2，3-二羟丙基)腺嘌 呤诱导的悬浮培养物中烟草基因组的甲基化不足不同，后者仅当相对于未 处理材料SAM∶SAH比率减少300倍时发生。这些结果暗示，与植物中 SAHH具有序列相似性的细胞激动素结合蛋白可能不是活性SAHH酶，但 相反可为细胞激动素受体。

(f)HOG1影响细胞激动素初级响应基因的表达

尽管组织培养物的响应支持HOG1是细胞激动素响应的正调节子的观 点，但组织培养包括超过6周的体外生长，在此期间其它过程也可对表型 起作用。因此，还检查了已知在相对短的时间内被细胞激动素直接诱导的 选择基因的表达(图4A、4B和表4)。这些基因包括KNAT1和STM(参与 分生组织功能的同源异型框基因，在施加外源细胞激动素后5分钟内被诱 导)以及ARR4、ARR5和ARR6(为细胞激动素诱导的A型响应调节子)。 使用来自在以细胞激动素(苄基腺嘌呤BA，以0μM、0.01μM、0.1μM、1 μM或5μM)脉冲处理之前和之后的野生型、HOG1过表达和HOG1反义 抑制株系的幼苗RNA进行定量实时PCR分析。对经数个时间间隔(5min、 15min、30min和1h)收获的组织进行RNA提取。施加BA导致KNAT1 和STM转录物的剂量依赖性增加，这与株系中HOG1的表达水平和内源 细胞激动素浓度相称(图4A、4B、表4)。当与未处理的野生型相比时，在 HOG1反义抑制株系中甚至无BA处理时KNAT1和STM的转录物水平显 著上调6至8倍，而未处理的过表达株系显示这些转录物的4至7倍减少 (图4A)。然而，与未处理的野生型植物相比，在施加5μM BA后1h内， 过表达株系(如OE1和OE12)的KNAT1和STM转录物水平未显示显著差 异(图4A、表4)。这与此株系的内源细胞激动素水平减少的观察结果一致。

表4.定量实时PCR分析选择的细胞激动素响应基因：来自以细胞激 动素(苄基腺嘌呤BA，以0μM、0.01μM、0.1μM、1μM或5μM)脉冲处 理之前和之后的野生型、HOG1过表达和反义抑制株系幼苗的RNA。使用 从三株独立反义抑制(AS1、AS8、AS21)和过表达(OE1、OE12、OE18)株 系经数个时间间隔(5min、15min、30min和1h)收获的组织进行RNA提 取。分析的基因包括KNAT1、STM(参与分生组织功能的同源异型框基因)、 ARR4、ARR5和ARR6(细胞激动素诱导的A型响应调节子)。施加BA导 致KNAT1和STM转录物剂量依赖性增加(变化倍数值后的箭头表示上调 ↑或下调↓)。还分析了ARR1、ARR2(B型响应调节子)、AHK2、AHK3、 AHK4(组氨酸激酶细胞激动素受体)。然而，其数据未显示在该表中，因为 这些基因的表达展现少于两倍的改变。

在具有约4倍更高的细胞激动素内源浓度的反义株系中，所检查的基 因的表达水平高3至6倍。因此，显示HOG1表达与这些植物中的细胞激 动素响应相关。这与之前报道具有过表达细菌ipt基因导致的细胞激动素 生物合成增加的拟南芥植物中STM和KNAT1表达显著增加类似(Rupp等 人Plant J 18：557-563，1999)。这些观察结果表示HOG1直接参与在植物发 育期间调节细胞激动素响应。

此外，为了确定HOG1转基因株系的表型是否与细胞激动素信号转导 相关，研究了细胞激动素诱导的极早期基因的最熟知类型，即，A型ARR 基因-ARR4、ARR5和ARR6(图4B)。本数据显示这些基因在单次细胞激 动素脉冲处理后数分钟内被上调，这与之前在拟南芥的观察结果一致 (Brandstatter和Kieber Plant Cell 10：1009-1020，1998；D′Agostino等人Plant Physiol 124：1706-1717，2000；Taniguchi等人FEBS Lett.429：259-262，1998； To等人Plant Cell 16：658-671，2004)。

发现内源细胞激动素水平显著减少(图3G)的HOG1过表达株系(如 OE12)，显示研究的三种A型ARR基因表达水平的3至9倍减少。这很大 程度上可由BA处理克服(图4B)，与经由主要细胞激动素信号转导途径的 流量减少一致。类似地，具有更高内源细胞激动素水平的反义HOG1株系 (如AS8)具有相应更高水平(4至9倍增加)的ARR表达(图4B和表4)。这 些数据显示A型ARR基因是新细胞激动素受体HOG1的下游。类似地， 此前显示ARR6在CRE1过表达株系中响应于外源细胞激动素而被诱导， 这证实ARR6为细胞激动素受体(Hwang和Sheen Nature 413：383-389， 2001)。

而且，研究这些转基因株系中两种B型ARR(ARR1和ARR2)的转录 物水平以确保对A型ARR的观察结果是特异性的响应。在本实验条件下 ARR1和ARR2不被BA处理显著影响(表4)，这与此前的结果一致(Imamura 等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：2691-2696，1998；Kiba等人Plant Cell Physiol.40：767-771，1999；Hutchison等人Plant Cell 18：3073-3087，2006)。

为了排除AHK-类型细胞激动素受体即AHK2、AHK3和CRE1/AHK4 的参与，确定它们在不同转基因株系中的转录物水平。与野生型的相比， 在HOG1过表达和反义抑制株系中未观察到显著差异(数据未显示)，显示 HOG1独立于这三种已知细胞激动素受体起作用。

(g)TAP-HOG1与AHP1相互作用

为了确定HOG1蛋白形成的信号转导复合体和进一步支持其作为细胞 激动素受体的作用，分离和鉴定与HOG1相互作用的蛋白。

产生表达带有N-末端TAP标签的HOG1(TAP-HOG1)的六株独立转基 因拟南芥株系。这些植物与HOG1过表达株系具有相同表型，显示融合蛋 白在植物中是功能性的。下拉测定以从3周大的TAP-HOG1转基因植物提 取的总蛋白进行。当使用PAP抗体进行免疫印迹分析以检测这些植物中 TAP-HOG1融合蛋白的存在时，检测到71kDa的蛋白条带(图4C)。预测 HOG1的分子量为56kDa且标签为15kDa，从而造成71kDa的融合蛋白 条带。具有TAP-HOG1的蛋白复合体从总蛋白提取物洗脱，使用标签和IgG 珠，使用Forler等人(同上)的方法。对蛋白复合体进行SDS-PAGE，且主 要蛋白条带的N-末端测序揭示其为AHP1。随后，从拟南芥由PCR克隆 AHP1的cDNA并将重组AHP1表达于大肠杆菌(图4D)。使用ITC显示， AHP1与纯化的TAP-HOG1蛋白直接相互作用(图4E)。ITC中，这两种纯 化蛋白形成的复合体的解离常数KD值为23.8nM。

拟南芥组氨酸磷酸转移蛋白(AHP1、AHP2、AHP3、AHP4和AHP5) 是细胞激动素信号转导的关键中间物，因为它们作用为膜受体和核响应调 节子之间的细胞质核穿梭体。证实HOG1与细胞激动素信号转导的关键中 间物AHP1相互作用，进一步确认了HOG1蛋白的受体功能。

本数据显示，HOG1是此前描述的AHK-家族受体之外的新细胞激动 素受体。从芥蓝、菊花、苋属和水稻分离多种同系物。这显示，HOG1存 在于不同植物物种并对调节植物发育重要。上述的细胞激动素信号转导途 径是类似于细菌两成分响应系统的磷酸中继途径。这与细胞激动素在调节 植物发育中起多种作用和多于一种类型的细胞激动素受体的存在可促进 这种多效性功能的事实一致。这种现象已在乙烯信号转导中观察到，其中 牵涉多于一种受体(如ETR1、ERS2、ETR2和EIN4)。而且，HOG1在所 有植物部分组成型表达暗示该蛋白在植物发育中的关键作用。

基于组氨酸激酶细胞激动素受体的三突变体 (cre1-12ahk3-3ahk2-2(Col))产生植物(虽然具有严重矮小和不育表型)的观 察结果，对于细胞激动素可存在其它受体的可能性是突出的。与本研究的 反义抑制HOG1基因观察到的相比，这三种AHK-类型细胞激动素受体的 功能丧失突变体导致相反的表型。本研究中观察到的相反表型表现为是茎 干中内源细胞激动素水平改变的结果。HOG1蛋白对细胞激动素分子的高 亲合力结合由低KD值表示。当本研究中使用两拷贝的强启动子(花椰菜花 叶病毒35S启动子)显著地过表达基因时，所得到的蛋白增加以及异位表达 导致可得的游离细胞激动素显著减少(图3G)。这可能是由于该蛋白作用为 细胞激动素跨质膜运输的障碍。这是重要的，因为茎尖(shoot apex)必须接 受来自根尖(为细胞激动素生物合成的主要位置)的细胞激动素。这导致明 显的功能丧失表型，即，植物高度减少和缺乏营养生物量。

相反，在反义植物中，在茎干顶端分生组织可得的游离细胞激动素分 子显著增加，导致大量发枝和生物量增加显著的相反表型(图3G)。

在植物中应用纯化的TAP标签蛋白允许表征多种蛋白复合体，包括烟 草中的抗性蛋白Cf9和拟南芥中的CTR1蛋白。本研究鉴定拟南芥组氨酸 磷酸转移(AHP1)为与HOG1相互作用的蛋白，显示AHP1是HOG1的下 游信号转导中间物。表达重组AHP1并显示与纯化的TAP-HOG1蛋白直接 相互作用。ITC中，两种纯化蛋白形成的复合体的解离常数值为23.8nM， 这提供对HOG1的受体功能的重要支持。

(h)HOG1是细胞激动素信号转导途径的新受体

为了更好地理解新细胞激动素受体HOG1在介导细胞激动素响应中的 作用，分析细胞激动素诱导的初级响应基因，即，A型ARR基因(即ARR4、 ARR5和ARR6)。ARR表达水平的改变见于图4B和表4，其在HOG1反 义和过表达株系中测量的细胞激动素含量之外暗示对内源细胞激动素的 响应被HOG1影响。这证实HOG1蛋白为新受体且ARR与AHP1一起为 HOG1细胞激动素信号转导途径的下游信号转导级联元件。

因此，本数据提供除了此前描述的两成分系统以外，拟南芥中经由 HOG1的细胞激动素信号转导途径(图5)。重要的是注意以前报道的组氨酸 激酶受体的遗传修饰未显示影响营养和生殖生长，这不同于反义抑制 HOG1。本数据显示该受体将作为生物技术改良作物植物的关键靶以增加 生物量和谷粒的产量。

实施例2

通过反义抑制推定的细胞激动素受体的基因增加水稻中生物量和粮 食产量

材料和方法

植物材料

对于水稻粳稻，使用栽培品种日本晴。这是源自日本的商业栽培品种。 还可以其它水稻栽培品种(籼稻(indica)亚种)进行类似研究。从LEHLE SEEDS(1102 South Industrial Blvd.，Suite D，Round Rock TX 78681 USA)获 得野生型拟南芥种子。

细菌菌株

除非另外指出，用于本研究中DNA克隆的细菌菌株是大肠杆菌 DH5a，其在37℃生长于液体LB培养基(Sambrook等人，1989)。使用的根 癌农杆菌菌株是GV3101(Koncz和Schell，1986)。

以简并引物进行PCR以克隆基因

提取RNA后，使用AMV(禽类成髓细胞性白血病病毒)反转录酶 (AMV-RT，Promega)进行反转录(RT)。cDNA产物用于PCR，使用简并引物 PET1：5′-A(AG)ATGCC(CT)GG(ACT)CT(ACT)ATG(GT)C(ACT)T-3′(SEQ ID NO：24)和PET2：5′-TC(AG)AACTTGCTCTTGGT(AG)AC(AG)-3′ (SEQ ID NO：25)以从拟南芥和水稻分离部分片段。克隆和测序PCR片段。

快速扩增5′-和3′-cDNA末端

SMARTTM RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech Laboratories)用于鉴定 cDNA的5′-和3′-cDNA(5′/3′-RACE)末端序列。对这些PCR产物测序。将 部分序列和RACE PCR产物一起比对以获得拟南芥(HOG1)和水稻(OsCBP) 的全长cDNA序列。

用于农杆菌介导的植物转化的基因构建体是反义基因抑制(35S: asHOG1)构建体。使用的启动子是花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子。

水稻的农杆菌介导的植物转化

使用Hiei等人(Plant Journal UK第6卷，第271-282页，1994)的方法。

1.水稻愈伤组织的诱导

将成熟水稻种子以70％乙醇表面灭菌1.5min。在100ml无菌烧瓶中 加入漂白剂(20％)和一滴Tween-20，在摇床上以120rpm摇动45min。随 后把处理的种子用无菌蒸馏水彻底漂洗。

将无菌的种子置于无菌9cm深的塑料皮氏培养皿中30ml含有2.0 mg/l 2，4-D的固化NBO培养基(愈伤组织诱导培养基)的表面。将培养皿包 上带子并置于组织培养室的盒子里并允许水稻种子在25℃在黑暗中萌发。

10天后，切下衍生自盾片的愈伤组织并继代培养到新鲜愈伤组织诱导 培养基。每4周进行继代培养，直到获得旺盛生长、浅黄色、胚发生的愈 伤组织。

2.共培养农杆菌和水稻愈伤组织

将含有反义构建体的双元质粒(基于pCAMBIA1301，R.Jefferson， CAMBIA，Australia)引入根癌农杆菌菌株AGL1。根癌农杆菌在28℃在含 有10mg/L利福平、50mg/L卡那霉素和50mg/L潮霉素的固化YEP培养 基上储存生长48-73小时。在28℃将1ml细菌培养物加入250ml烧瓶中 100ml含有相同选择性抗生素的AB培养基。使细菌生长达到OD595为 0.8-1.0的密度。通过在室温在4,000rpm离心10min来收集细菌。随后除 去上清液和以相同体积AMM培养基重悬小团而洗涤一次细菌，并在室温 以4,000pm再次离心10分钟。丢弃上清液。

以AMM培养基稀释细菌到OD595为0.4的密度(约：每ml 109个细 胞)。约20-25ml稀释的细菌用于在无菌9cm塑料皮氏培养皿中的农杆菌 接种。选择大小为直径约5mm的旺盛生长、浅黄色、胚发生的愈伤组织 并置入细菌悬液和浸泡30分钟，在无菌层流罩中偶尔摇动。通过将愈伤 组织置于干燥无菌绵纸(tissue paper)垫上除去愈伤组织的过量细菌悬液。将 接种的愈伤组织转移到(不漂洗)无菌9cm塑料皮氏培养皿中的2N6-AS培 养基，并在25℃黑暗中培养2-3天。

3.选择和再生转化体

收集100ml无菌烧瓶中共培养的愈伤组织并使用50-75ml无菌蒸馏水 伴随轻摇洗涤至少10次。愈伤组织在无菌绵纸垫上干燥以除去多余的表 面的水。将愈伤组织块转移到含有500mg/l头孢噻肟和200mg/l氨苄青霉 素的100ml无菌蒸馏水，并在25℃以120rpm摇动两小时。除去水并将愈 伤组织块在无菌纸垫上印干。将愈伤组织块转移到无菌9cm皮氏培养皿中 的含有2mg/L 2.4-D、250mg/l头孢噻肟、200mg/l氨苄青霉素和50mg/l 潮霉素的NBO培养基(选择培养基)用于选择转化的细胞。在25℃黑暗中 培养密封的培养皿。

在4周选择后，从共培养的愈伤组织提取推定的潮霉素抗性微愈伤组 织，转移到相同的新鲜选择培养基以证实抗性和组织增殖，并培养3周。

将旺盛生长的潮霉素抗性愈伤组织转移到含有1.0mg/l 6-BA、2.0mg/l NAA、5.0mg/l ABA和50mg/l潮霉素的NBO培养基(预再生培养基)并在 25℃黑暗中培养3周。将白色密实的潮霉素抗性胚发生的愈伤组织从预再 生培养基转移到含有2.0mg/l 6-BA、1.0mg/l IAA、1.0mg/l NAA、1.0mg/l KT和50mg/l潮霉素的NBO培养基(再生培养基)，并在25℃以14小时光 照(约2000lux)和8小时黑暗培养。

三周后将再生的潮霉素抗性小植株转移到Phytacon瓶中100ml含有 50mg/l潮霉素的1/2MS培养基(小植株生长培养基)用于茎干诱导和根伸 长。继续所述培养条件直到小植株达到容器顶端。从培养瓶移出发育良好 的潮霉素抗性小植株并立即置于塑料盘的自来水中以除去附带的培养基。 将小植株转移到含有1/2MS培养基(溶液)的54孔(直径约5cm)的塑料盘。 将小植株的每个给定簇(推定的转基因株系)置入单独孔。在生长室中以 90％湿度在20℃以14小时光照(约400lux)和8小时黑暗训练小植株7-10 天。

将植物移植到小盆中的土壤里并在温室培养(同非转基因植物)，持 续三代以获得纯合的转基因植物。

补充方法

植物材料和生长条件

对于拟南芥，使用哥伦比亚生态型并将植物在22℃生长室中以16小 时光照和8小时黑暗培养。粳稻栽培品种日本晴用于水稻遗传转化实验。

质粒构建和遗传转化拟南芥

全长HOG1 cDNA由5′和3′RACE策略扩增。pGreen 0229双元载体(Yu 等人，同上)用于所有转基因构建体。对于反义抑制，使用跨两个SAHH 标志的HOG1的850bp片段(SEQ ID NO：15)。HOG1 cDNA的完整开放 读码框用于过表达构建体(SEQ ID NO：2)。TAP-标签化的HOG1带有Prot A和钙调蛋白结合肽标签，两个标签之间有TEV裂解位点。通过根癌农杆 菌介导的浸花方法(Clough，S.和Bent，A.The Plant Journal 16(6)：735-743 (1998))将构建体引入拟南芥。

定量实时PCR分析

以TRIzol方法(Invitrogen)从拟南芥幼苗或水稻叶提取总RNA。以无 RNA酶的DNA酶I处理的总RNA(0.5μg)用于每个定量PCR反应，根据 制造商的说明书以一步RT试剂盒(Qiagen)进行定量PCR反应。使用SYBR green(Applied Biosystems Inc.)进行定量实时PCR。将Ct值对微管蛋白2Ct 值标准化以根据制造商的方案计算变化倍数。

等温滴定量热法(ITC)

以ITC(MCSITC，Microcal，Northampton，USA)检查HOG1与细胞激动 素的相互作用的细胞激动素结合亲合力和热力学分析。使用公开的方案 (Forler等人，同上)从具有35S::TAP-HOG1构建体的转基因拟南芥植物 纯化TAP-HOG1融合蛋白。0.01μM苄基腺嘌呤(一种天然产生的细胞激动 素)和0.1μM纯化的TAP-HOG1蛋白用于25次注射的每次ITC测定(在37 ℃每次注射2μl，以3s间隔)。由MICROCAL ORIGIN 2.9版本分析数据， 使用用于一个结合位点的最佳拟合的非线性最小平方方法。从拟合的曲线 计算结合化学计量(n)和缔合常数(KA)。随后，计算KD为1/KA。

细胞激动素含量

以100％甲醇从全植株提取细胞激动素并使用异戊烯基腺苷检测试剂 盒(Sigma)定量，如Yang等人(同上)所述的。

水稻愈伤组织诱导

诱导表面灭菌和剥壳的水稻种子产生愈伤组织，通过将其置于补充2 mg/L 2，4-D的NBO培养基(愈伤组织诱导培养基)和随后在25℃黑暗中培养 30天。30天后，进一步继代培养出现的愈伤组织，直到获得脆的胚愈伤 组织。

共培养农杆菌与水稻愈伤组织

使用GIBCO-BRL Cell-Porator通过电穿孔，将含有全长HOG1(分别为 有义或反义方向用于过表达和反义抑制)的双元质粒pCAMBIA 1300引入 根癌农杆菌AGL1。通过限制性酶切消化证实转化的质粒。在含有10mg/l 羧苄青霉素、50mg/l卡那霉素和50mg/l潮霉素的YEP培养基中培养含有 质粒构建体的农杆菌并在25℃培养48h。将1ml这种小规模培养物接种 到100ml含有相同的选择抗生素的AB液体培养基，并在25℃培养直到培 养物达到OD595为0.8至0.9。在4000rpm离心培养物10min。将细菌小 团以AMM培养基悬浮到OD595为0.4的密度。将20-25ml该细菌悬液倒 入9cm深皮氏培养皿，并将旺盛生长的浅黄色脆的胚发生的愈伤组织(大 小约5mm)浸泡30min，偶尔摇动。通过将愈伤组织置于无菌干燥绵纸垫 上而从愈伤组织除去多余细菌悬液。随后，将接种的愈伤组织在无菌9cm 深皮氏培养皿的2N6-AS培养基中培养并在25℃黑暗中培养2-3天。

选择和再生水稻转化体

使用50-75ml无菌水伴随轻摇洗涤共培养的愈伤组织至少10次，并 通过放在无菌绵纸上而干燥。将愈伤组织块转移到无菌皮氏培养皿中的含 有2mg/l 2，4-D、250mg/l头孢噻肟、和50mg/l潮霉素的NBO培养基用于 选择。在4周选择后，将潮霉素抗性的微愈伤组织选择为推定的转基因愈 伤组织，从共培养的愈伤组织切下，转移到新鲜的选择培养基以进一步增 殖，并培养3周。将旺盛生长的潮霉素抗性愈伤组织转移到含有1mg/l BA、 2mg/l NAA、5mg/l ABA和50mg/l潮霉素的NBO培养基(预再生培养基) 并在25℃黑暗中培养3周。将白色密实的潮霉素抗性愈伤组织从预再生培 养基转移到含有2mg/l BA、1mg/l IAA、1mg/l NAA、1mg/l激动素和50 mg/l潮霉素的NBO培养基(再生培养基)，并在25℃以14小时光照(25 μmol/m²/s)的光周期培养。3周后，将包括附带的愈伤组织的再生的潮霉素 抗性小植株转移到Phytacon瓶中100ml含有50mg/l潮霉素的1/2MS培 养基(小植株培养基)用于茎干生长和根伸长。培养小植株直到它们达到容 器顶端。将小植株的每个簇转移到含有1/2MS溶液的54孔塑料盘中的单 个孔。在生长室中以90％相对湿度在20℃以14h光照(25μmol/m²/s)的光周 期驯化小植株7-10天。随后将植物转移到小盆中的土壤里。

从愈伤组织获得的转基因水稻植物称为T0代，从单独植物获得的种 子在潮霉素存在下萌发且存活的植物称为T1代。来自T1植物的种子再次 经受潮霉素选择并在本研究中称为T2代。

结果和讨论

定量实时PCR分析指出，HOG1在拟南芥中组成型地表达，在叶和花 序茎中具有相对较高水平，如在实施例1(c)中所述的，暗示HOG1可在调 节植物发育中起基本作用。纯化的HOG1显示对细胞激动素分子(玉米素、 苄基腺嘌呤和异戊烯基腺嘌呤)结合的高亲合力，如在实施例1(a)中所述 的。

对苄基腺嘌呤的解离常数(KD)为20.6nM(图11)，暗示与HOG1蛋白 结合的高亲合力。

当与野生型相比时，各种HOG1拟南芥OE株系显示HOG1转录物水 平的5至8倍增加(图8e)，而拟南芥AS株系显示6至10倍抑制(图8e)。 转基因表达显著地影响植物发育并在许多独立转基因株系中展现一致的 表型。记录28株独立OE转基因株系和21株AS株系的表型，说明改变 是由引入的基因产物导致的。与野生型(WT)相比，OE株系中种子萌发发 生早4至5天，而在AS株系中晚大约5天(表5)。然而，OE株系萌发后 不久即观察到显著的生长延迟，而AS株系尽管种子萌发延迟，却未显示 茎干生长延迟。

在OE株系的营养生长期间新莲座叶的形成和展开受到延迟和限制。 在OE植物观察到提早开始开花和在4莲座叶阶段抽薹(图8a和表5)，与 之相比WT和AS株系在抽薹时分别具有至少8和14叶(图8b和表5)。

表5.种子萌发、开花开始和衰老：对每次观察使用五株独立株系。 对每种株系，数据代表三次独立重复的平均值。反义株系显示晚萌发、晚 抽薹和延迟的衰老。

开始开花后，OE株系未显示叶生物量的任何进一步增加，且甚至在 生长30天后当这些株系开始衰老时还未形成叶腋花序枝(图8b)。然而， AS株系显示花序茎的大量发枝(图8b)和延迟的衰老。AS株系具有最高叶 面积(每叶2.9±0.1cm²)，而OE株系(0.4±0.1cm²)和WT(1.0±0.1cm²)中 的显著减少(图8c和表7)。与WT相比，在OE株系中总植物生物量、长 角果大小以及作为结果的每长角果的种子数目和重量(图8c、8d、8f和表 6)显著减少，而AS株系中显著提高(图8c、8d、8f)。OE株系比WT早约 10天开始衰老，而AS株系比WT晚两周开始衰老(图8a、8b和表6)。

表6.叶面积、每长角果的种子重量和种子数目：数据代表三次独立 重复的平均值±SD。每种情形使用五株独立株系。与野生型相比，反义株 系显示叶生物量的三倍增加和种子产量的两倍增加。

由于已确立植物中发枝和衰老与细胞激动素水平之间的关联，对WT、 OE和AS株系各三株独立株系确定内源细胞激动素含量。异戊烯基腺嘌呤 是主要细胞激动素，且OE株中与WT相比其浓度减少约60％(图8f)。这 可能是图8b和8a中观察到OE株系中植物高度和生物量减少的主要原因。 相反，AS株系中与WT相比异戊烯基腺嘌呤浓度增加超过60％，或比OE 株系增加约四倍(图8f)。这导致相反表型，即，大量发枝和生物量显著增 加。

本拟南芥研究的结果暗示，在作物物种中遗传操纵HOG1或其直系同 源物可提供提高产量的手段。在多种其它物种中进行HOG1直系同源物的 筛选。从水稻、芥蓝、菊花和苋属成功地鉴定和获得cDNA。通过反转录 -PCR从水稻(粳稻栽培品种日本晴)分离OsCBP(水稻细胞激动素结合蛋白； Os11g0455500)的全长cDNA。得到的OsCBP氨基酸序列(SEQ ID NO：5) 与HOG1(SEQ ID NO：1)显示90％序列同一性，且水稻中该基因表现为只 有一个拷贝(图10)。由于HOG1(SEQ ID NO：1)和OsCBP(SEQ ID NO： 5)之间的高序列相似性，使用HOG1 cDNA产生转基因水稻株系以检测产 量提高性状是否可在水稻中实现。通过农杆菌介导的转化，获得多种独立 水稻株系并通过定量实时PCR和T1代基因组Southern印迹证实为转基因 的(图9、12d和12e)。T2代OE株系和AS株系的表型一致地随转基因分 离(分离株系不能幸免于潮霉素选择)。选择培养基中T3种子萌发显示多种 所选株系对转基因是纯合的(数据未显示)。

在OE和AS株系和杂交母体(WT)株系中进行OsCBP的表达分析。当 与WT中内源OsCBP表达水平相比时，过表达株系(图9f)显示HOG1表 达水平增加几乎5倍。此外，一些OE株系中OsCBP表达减少6倍(图9f)， 证实这些是共抑制株系。基因共抑制的现象是植物中熟知的。因此，观察 到的表型是由于引入的基因的功能而不是转化的任何非特异性效应。转基 因植物的表型与拟南芥的结果一致。

OE株系中，与WT相比时每株植物的分蘖数没有显著改变(表8)，但 许多OE株系在高度和总生物量增加上显著减少(图9a、9b、9c和表8)。 当与WT相比时，水稻OE株系显示早开花7-10天。相反，与杂交母体株 系相比，AS株系显示内源OsCBP表达水平的高达6倍的减少并展现每株 植物分蘖数的显著增加(图9b、9c和12b)。WT具有7至9个分蘖，而AS 株系显示每株植物18至28个分蘖(表8)。共抑制株系的表型与AS株系的 相同(图9c、9e、12a、12b和表8)。此外，共抑制和AS株系显示从主分 蘖的地上节发枝(图12d)，导致每株植物圆锥花序数目显著总增加(表8)。 当与WT相比时，AS和共抑制株系中平均种子数和植物生物量增加2至 超过3倍(表8)。与WT植物相比，AS和共抑制株系的表型没有其它大的 改变。在温室生长条件下，每株植物粮食产量的最大增加为比WT高出超 过两倍(从1.5至2.7倍)。通常，水稻的温室生长条件的产量数据低于理想 田间条件的。因此，清楚的是如果使用本文所述策略，可导致田间条件下 产量显著增加。

表7.对生物量和种子产量有贡献的参数的皮尔逊氏相关系数(r)：检 验以下之间的相关系数：叶面积(cm²)x每长角果的种子重量(mg)(A)；叶 面积(cm²)x每长角果的种子数目(B)；和每长角果的种子重量(mg)x每长 角果的种子数目(C)。相关性分析后，进行学生t-检验。t-检验值在括号中 给出。‘r’值显示所有检验中的正相关性。基于此，预测HOG1的反义抑 制导致对叶生物量和种子产量有贡献的关键参数增加。

  植物基因型   A   B   C   野生型   0.898   (t＝2.043)   0.857   (t＝2.755)   0.795   (t＝3.84)   HOG1反义株系   0.763   (t＝2.043)   0.847   (t＝2.755)   0.912   (t＝3.84)   HOG1过表达株系   0.769   (t＝2.078)   0.979   (t＝2.878)   0.767   (t＝2.269)

表8.定量含有以有义(过表达和共抑制)或反义方向(由水稻泛素启动 子驱动)导致操纵内源OsCBP基因的表达的全长拟南芥HOG1 cDNA的 T2代转基因水稻植物中产量参数。基于每株植物分蘖数将每个转基因株系 中的植物分组为‘高’、‘中’和‘低’。每株植物的分蘖总数、圆锥花序 数和种子数表示为平均值±SD。每株植物中仅计数完全饱满的谷粒。叶 面积值表示单个叶的面积。测量每株植物第二分蘖的完全张开的第二叶作 为指示参数。对全株连根拔起的植物确定鲜重并仅测量不同株系的选择的 植物。

拟南芥和水稻的本研究结果暗示可使用HOG1的直系同源物以改进多 种作物。每株植物的分蘖数是确定主要谷类作物产量的关键因素。因此， 使用该方法，可能增加主要谷类作物如水稻、小麦、玉米和大麦的产量。

生物量增加也是对用于纤维素乙醇生产的植物和叶类蔬菜以及牧草 的高度期望的特征。此外，过表达观赏物种中的HOG1或其直系同源物可 帮助诱导矮化和提早开花。

应用

本发明人使用SEQ ID NO：2的分离的多核苷酸，鉴定了具有调节植 物中性状的能力的方法。本文公开的方法能够增强农业生产力和每单位耕 作面积的粮食产量。本文公开的方法可用于提高牧草中生物量生产，和增 加叶类蔬菜和观叶植物中的发枝。本文公开的分离的多核苷酸可施用于单 子叶和双子叶植物以产生具有调节的可用于改进作物和其它商业和科学 用途的性状的植物。

尤其是，生物量产生是不断增长的工业，由于对可持续的燃料来源的 兴趣在不断增长。不受理论束缚，推测由本文公开的方法产生的丰富生物 量可转化为生物燃料诸如木煤气(woodgas)、生物甲醇或生物乙醇燃料。例 如，通过已知的水解、发酵和蒸馏方法可从纤维素材料产生醇。因此，使 用生物量燃料被视为可恢复的能源，被一些人认为是减少温室气体排放和 提供石油燃料的替代品的手段。

明显的是，在阅读前述公开后，对本领域技术人员来说，对本发明的 各种其它修饰和改编将是明显的，并不偏离本发明的主旨和范围，并且预 期所有这种修饰和改编在所附权利要求书的范围内。

序列表

<110>库马尔·P；新加坡国立大学

<120>推定的细胞激动素受体和其应用方法

<130>10104SG744

<140>US 60/888,136

<141>2007-02-05

<160>30

<170>PatentIn版本3.3

<210>1

<211>485

<212>PRT

<213>HOG1拟南芥

<400>1

Met Ala Leu Ile Val Glu Lys Thr Ser Gly Gly Arg Glu Tyr Lys Val

1               5                   10                  15

Lys Asp Met Ser Gln Ala Asp Phe Gly Arg Leu Glu Leu Glu Leu Ala

            20                  25                  30

Glu Val Glu Met Pro Gly Leu Met Ala Cys Arg Thr Glu Phe Gly Pro

        35                  40                  45

Ala Gln Pro Phe Lys Gly Ala Arg Ile Thr Gly Ser Leu His Met Thr

    50                  55                  60

Ile Gln Thr Ala Val Leu Ile Glu Thr Leu Thr Ala Leu Gly Ala Glu

65                  70                  75                  80

Val Arg Trp Cys Ser Cys Asn Ile Phe Ser Thr Gln Asp His Ala Ala

                85                  90                  95

Ala Ala Ile Ala Arg Asp Ser Ala Ala Val Phe Ala Trp Lys Gly Glu

            100                 105                 110

Thr Leu Gln Glu Tyr Trp Trp Cys Thr Glu Arg Ala Leu Asp Trp Gly

        115                 120                 125

Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Ile Val Asp Asp Gly Gly Asp Ala Thr

    130                 135                 140

Leu Leu Ile His Glu Gly Val Lys Ala Glu Glu Ile Phe Glu Lys Thr

145                 150                 155                 160

Gly Gln Val Pro Asp Pro Thr Ser Thr Asp Asn Pro Glu Phe Gln Ile

                165                 170                 175

Val Leu Ser Ile Ile Lys Glu Gly Leu Gln Val Asp Pro Lys Lys Tyr

            180                 185                 190

His Lys Met Lys Gly Arg Leu Val Gly Val Ser Glu Glu Thr Thr Thr

        195                 200                 205

Gly Val Lys Arg Leu Tyr Gln Met Gln Glu Ser Gly Ala Leu Leu Phe

    210                 215                 220

Pro Ala Ile Asn Val Asn Asp Ser Val Thr Lys Ser Lys Phe Asp Asn

225                 230                 235                 240

Leu Tyr Gly Cys Arg His Ser Leu Pro Asp Gly Leu Met Arg Ala Thr

                245                 250                 255

Asp Val Met Ile Ala Gly Lys Val Ala Val Ile Cys Gly Tyr Gly Asp

            260                 265                 270

Val Gly Lys Gly Cys Ala Ala Ala Met Lys Thr Ala Gly Ala Arg Val

        275                 280                 285

Ile Val Thr Glu Ile Asp Pro Ile Cys Ala Leu Gln Ala Met Met Glu

    290                 295                 300

Gly Leu Gln Val Leu Thr Leu Glu Asp Val Val Ser Glu Ala Asp Ile

305                 310                 315                 320

Phe Val Thr Thr Thr Gly Asn Lys Asp Ile Ile Met Val Asp His Met

                325                 330                 335

Arg Lys Met Lys Asn Asn Ala Ile Val Cys Asn Ile Gly His Phe Asp

            340                 345                 350

Asn Glu Ile Asp Met Gln Gly Leu Glu Thr Phe Pro Gly Val Lys Arg

        355                 360                 365

Ile Thr Ile Lys Pro Gln Thr Asp Arg Trp Val Phe Pro Asp Thr Lys

    370                 375                 380

Ser Gly Ile Ile Val Leu Ala Glu Gly Arg Leu Met Asn Leu Gly Cys

385                 390                 395                 400

Ala Thr Gly His Pro Ser Phe Val Met Ser Cys Ser Phe Thr Asn Gln

                405                 410                 415

Val Ile Ala Gln Leu Glu Leu Trp Asn Glu Lys Ser Ser Gly Lys Tyr

            420                 425                 430

Glu Lys Lys Val Tyr Val Leu Pro Lys His Leu Asp Glu Lys Val Ala

        435                 440                 445

Ala Leu His Leu Gly Lys Leu Gly Ala Lys Leu Thr Lys Leu Thr Lys

    450                 455                 460

Asp Gln Ser Asp Tyr Val Ser Ile Pro Ile Glu Gly Pro Tyr Lys Pro

465                 470                 475                 480

Pro His Tyr Arg Tyr

                485

<210>2

<211>1775

<212>DNA

<213>HOG1拟南芥CDNA

<400>2

ggccgcggga attcgatttc taccccccct gccccaatct tagatccgaa aaaatggcgt      60

tgatcgttga gaagacgtcg ggtggccgtg agtacaaggt caaggacatg tctcaggccg     120

acttcggtcg tctcgagctc gagctcgccg aagttgagat gccaggactc atggcttgcc     180

gtaccgagtt cggcccagct cagcccttca aaggcgctag aatcaccgga tctctccaca     240

tgacgatcca gaccgccgtc ctcatcgaaa ccctaaccgc cctcggcgcg gaagtcagat     300

ggtgctcctg caacatcttc tcaacccaag accacgccgc cgccgcaatc gcccgtgact     360

ccgccgccgt tttcgcctgg aaaggtgaga cgcttcagga gtactggtgg tgcacggagc     420

gtgctctcga ctggggccca ggtggtggtc cagatctgat cgtcgatgac ggtggcgacg     480

ccacgctttt gatccacgag ggagtgaagg ccgaggagat ctttgagaag acgggtcagg     540

ttcctgatcc cacttccact gacaaccctg agttccagat cgtgctttcg atcatcaagg     600

aaggtctcca ggttgatcct aagaagtacc acaagatgaa ggggagactc gtcggtgtct     660

ctgaggagac caccaccggt gtcaagaggc tttaccagat gcaggaaagt ggagcccttt     720

tgttcccagc cattaacgtc aacgactccg tcaccaagag caagttcgac aacttgtacg     780

gttgccgtca ctctctacct gatggtctca tgagggccac tgatgtcatg atcgccggaa     840

aggttgcggt tatctgtggt tatggtgatg tcggtaaggg ttgtgccgct gccatgaaaa     900

ccgctggtgc tagagtcatt gtgaccgaga tcgaccccat ctgtgcccta caagctatga     960

tggaagggct tcaagttctg acccttgagg atgtcgtctc tgaagctgac atctttgtca    1020

ccaccaccgg taacaaagac atcatcatgg ttgaccacat gaggaagatg aagaacaacg    1080

ctatcgtctg caacattggt cactttgaca acgagattga catgcaagga cttgagacct    1140

tccctggagt gaagcgtatc accatcaagc cccagaccga caggtgggtg ttcccagaca    1200

ccaagtccgg aatcattgtt ttggccgagg gtcgtctcat gaacttgggt tgtgccactg    1260

gtcacccaag tttcgtgatg tcttgctctt tcaccaacca ggtgattgcc cagcttgagc    1320

tttggaacga gaagtcgagc ggtaagtacg agaagaaggt gtacgttcta cccaagcatt    1380

tggatgagaa ggttgcggca cttcacttgg gcaagcttgg agctaagctc actaagctga    1440

caaaggacca atctgactac gtcagcattc caattgaggg accatacaag cctcctcact    1500

acaggtactg agagagagag agagtcgaca aagcggttca ggttcggatc tacttgtggt    1560

tttgtgttgg gttgtggtgg gagagtggaa cagtttgaga tattggtctt ctgatgaagt    1620

tgaccaaata tcagtattaa taagggttat tggcttttga aggttgtgct tggtttctcc    1680

atttttcatg aaacttaaat tagtttttgg tttagtttcc ctcttgattt tattttgtgt    1740

gttctgttta gcgttgtact cttcaaacaa atgag                               1775

<210>3

<211>485

<212>PRT

<213>烟草品种Xanthi同系物(氨基酸序列)

<400>3

Met Ala Leu Leu Val Glu Lys Thr Thr Ser Gly Arg Glu Tyr Lys Val

1               5                   10                  15

Lys Asp Met Ser Gln Ala Asp Phe Gly Arg Leu Glu Ile Glu Leu Ala

            20                  25                  30

Glu Val Glu Met Pro Gly Leu Met Ala Cys Arg Thr Glu Phe Gly Pro

        35                  40                  45

Ser Gln Pro Phe Lys Gly Ala Lys Ile Thr Gly Ser Leu His Met Thr

    50                  55                  60

Ile Gln Thr Ala Val Leu Ile Glu Thr Leu Thr Ala Leu Gly Ala Glu

65                  70                  75                  80

Val Arg Trp Cys Ser Cys Asn Ile Phe Ser Thr Gln Asp His Ala Ala

                85                  90                  95

Ala Ala Ile Ala Arg Asp Ser Ala Ala Val Phe Ala Trp Lys Gly Glu

            100                 105                 110

Thr Leu Gln Glu Tyr Trp Trp Cys Thr Glu Arg Ala Leu Asp Trp Gly

        115                 120                 125

Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Ile Val Asp Asp Gly Gly Asp Ala Thr

    130                 135                 140

Leu Leu Ile His Glu Gly Val Lys Ala Glu Glu Glu Phe Ala Lys Asn

145                 150                 155                 160

Gly Thr Ile Pro Asp Pro Asn Ser Thr Asp Asn Ala Glu Phe Gln Leu

                165                 170                 175

Val Leu Thr Ile Ile Lys Glu Ser Leu Lys Thr Asp Pro Leu Lys Tyr

            180                 185                 190

Thr Lys Met Lys Glu Arg Leu Val Gly Val Ser Glu Glu Thr Thr Thr

        195                 200                 205

Gly Val Lys Arg Leu Tyr Gln Met Gln Ala Asn Gly Thr Leu Leu Phe

    210                 215                 220

Pro Ala Ile Asn Val Asn Asp Ser Val Thr Lys Ser Lys Phe Asp Asn

225                 230                 235                 240

Leu Tyr Gly Cys Arg His Ser Leu Pro Asp Gly Leu Met Arg Ala Thr

                245                 250                 255

Asp Val Met Ile Ala Gly Lys Val Ala Leu Val Ala Gly Tyr Gly Asp

            260                 265                 270

Val Gly Lys Gly Cys Ala Ala Ala Leu Lys Gln Ala Gly Ala Arg Val

        275                 280                 285

Ile Val Thr Glu Ile Asp Pro Ile Cys Ala Leu Gln Ala Thr Met Glu

    290                 295                 300

Gly Leu Gln Val Leu Thr Leu Glu Asp Val Val Ser Asp Val Asp Ile

305                 310                 315                 320

Phe Val Thr Thr Thr Gly Asn Lys Asp Ile Ile Met Val Asp His Met

                325                 330                 335

Arg Lys Met Lys Asn Asn Ala Ile Val Cys Asn Ile Gly His Phe Asp

            340                 345                 350

Asn Glu Ile Asp Met Leu Gly Leu Glu Thr Tyr Pro Gly Val Lys Arg

        355                 360                 365

Ile Thr Ile Lys Pro Gln Thr Asp Arg Trp Val Phe Pro Asp Thr Asn

    370                 375                 380

Ser Gly Ile Ile Val Leu Ala Glu Gly Arg Leu Met Asn Leu Gly Cys

385                 390                 395                 400

Ala Thr Gly His Pro Ser Phe Val Met Ser Cys Ser Phe Thr Asn Gln

                405                 410                 415

Val Ile Ala Gln Leu Glu Leu Trp Asn Glu Lys Ser Ser Gly Lys Tyr

            420                 425                 430

Glu Lys Lys Val Tyr Val Leu Pro Lys His Leu Asp Glu Lys Val Ala

        435                 440                 445

Ala Leu His Leu Gly Lys Leu Gly Ala Lys Leu Thr Lys Leu Ser Lys

    450                 455                 460

Asp Gln Ala Asp Tyr Ile Ser Val Pro Val Glu Gly Pro Tyr Lys Pro

465                 470                 475                 480

Ala His Tyr Arg Tyr

                485

<210>4

<211>1812

<212>DNA

<213>烟草品种Xanthi同系物(核苷酸序列)

<400>4

gaagagaaaa aagcctctca aatctcatct ctaaccaccc aatttctcat actcgctcta      60

cccatggctc tattagtcga gaagaccacc tctggccgcg agtacaaggt caaggacatg     120

tctcaggccg atttcggccg gcttgaaatc gagctggccg aagttgaaat gcctggtctc     180

atggcttgtc gtactgaatt tggcccttca cagccattta aaggtgctaa gattactgga     240

tctttacata tgaccattca aactgcagtt ttgattgaaa cccttactgc tttgggtgct     300

gaagttagat ggtgttcttg caacatcttc tccactcaag atcacgccgc tgctgccatt     360

gcacgtgaca gcgccgccgt gttcgcgtgg aagggtgaga ctctgcagga gtattggtgg     420

tgtactgaga gggcacttga ctggggtcca ggtggtgggc ccgacttgat cgtcgacgat     480

ggtggtgatg ctacactctt gattcatgag ggtgttaagg cagaagaaga gtttgctaag     540

aatgggacaa tcccagatcc taactctacc gataatgctg agtttcagct tgtacttact     600

attattaagg aaagtttgaa gactgatcct ttaaaatata ccaagatgaa ggaaagactc     660

gtcggtgttt ctgaggaaac taccactgga gttaagaggc tttatcagat gcaggctaat     720

ggaactttgc ttttccctgc tattaatgtt aatgattctg ttaccaagag caagttcgac     780

aacttgtacg gatgccgcca ctcactgccc gatggtctca tgagggctac tgatgttatg     840

attgccggaa aggttgccct tgttgctggt tatggagatg tcggcaaggg ttgtgctgct     900

gccttgaaac aagccggtgc ccgtgtgatt gtgaccgaga ttgaccctat ctgtgctctc     960

caggctacca tggaaggcct ccaggtcctt actctagagg atgtcgtttc tgatgttgat    1020

atctttgtca ccacgaccgg taacaaggac attatcatgg ttgaccacat gaggaagatg    1080

aagaacaatg ccattgtttg caacattggt cactttgaca acgaaatcga catgcttggt    1140

ctcgagacct accctggtgt caagaggatc acaattaagc ctcaaaccga cagatgggtc    1200

ttccctgaca ccaacagtgg catcattgtc ttggctgagg gtcgtctcat gaacttggga    1260

tgtgccacag gacaccctag ttttgtgatg tcgtgctcgt tcactaacca agtcattgcc    1320

caactcgagt tgtggaatga aaagagcagt gggaagtatg agaagaaagt gtatgtcttg    1380

ccaaaacacc tcgacgagaa ggttgctgca cttcatctcg gaaagctcgg agccaagctt    1440

accaaacttt cgaaggatca agctgactac attagcgttc cagttgaggg tccttacaag    1500

cctgctcact acaggtactg agcgaaaaca aatcgacaga ggagaacagc attgtcgcgg    1560

catgattgtt ttgcatttaa tactttgatt ttgtttagga tactagtatt ttgaatattg    1620

gtggtgatat atttgggagg aagtggcatg ttttgctgga aaagaaatgg gtcttatttg    1680

aaagtaagac caaaatgtgt tgaataagat tatggttggt ggtgtgatat gatattgtag    1740

taagttagaa ccatttgctt tttggtgtat ggtttttgtt tcaagaaatc aaagcaacac    1800

ttttaccttt tc                                                        1812

<210>5

<211>485

<212>PRT

<213>水稻同系物(氨基酸序列)，OSCBP

<400>5

Met Ala Leu Ser Val Glu Lys Thr Ser Ser Gly Arg Glu Tyr Lys Val

1               5                   10                  15

Lys Asp Leu Ser Gln Ala Asp Phe Gly Arg Leu Glu Ile Glu Leu Ala

            20                  25                  30

Glu Val Glu Met Pro Gly Leu Met Ala Cys Arg Ala Glu Phe Gly Pro

        35                  40                  45

Ser Gln Pro Phe Lys Gly Ala Arg Ile Ser Gly Ser Leu His Met Thr

    50                  55                  60

Ile Gln Thr Ala Val Leu Ile Glu Thr Leu Thr Ala Leu Gly Ala Glu

65                  70                  75                  80

Val Arg Trp Cys Ser Cys Asn Ile Phe Ser Thr Gln Asp His Ala Ala

                85                  90                  95

Ala Ala Ile Ala Arg Asp Ser Ala Ala Val Phe Ala Trp Lys Gly Glu

            100                 105                 110

Thr Leu Glu Glu Tyr Trp Trp Cys Thr Glu Arg Cys Leu Asp Trp Gly

        115                 120                 125

Val Gly Gly Gly Pro Asp Leu Ile Val Asp Asp Gly Gly Asp Ala Thr

    130                 135                 140

Leu Leu Ile His Glu Gly Val Lys Ala Glu Glu Glu Phe Glu Lys Ser

145                 150                 155                 160

Gly Lys Val Pro Asp Pro Glu Ser Thr Asp Asn Ala Glu Phe Lys Ile

                165                 170                 175

Val Leu Thr Ile Ile Arg Asp Gly Leu Lys Ser Asp Pro Ser Lys Tyr

            180                 185                 190

Arg Lys Met Lys Glu Arg Leu Val Gly Val Ser Glu Glu Thr Thr Thr

        195                 200                 205

Gly Val Lys Arg Leu Tyr Gln Met Gln Glu Thr Gly Ala Leu Leu Phe

    210                 215                 220

Pro Ala Ile Asn Val Asn Asp Ser Val Thr Lys Ser Lys Phe Asp Asn

225                 230                 235                 240

Leu Tyr Gly Cys Arg His Ser Leu Pro Asp Gly Leu Met Arg Ala Thr

                245                 250                 255

Asp Val Met Ile Ala Gly Lys Val Ala Val Val Cys Gly Tyr Gly Asp

            260                 265                 270

Val Gly Lys Gly Cys Ala Ala Ala Leu Lys Gln Ala Gly Ala Arg Val

        275                 280                 285

Ile Val Thr Glu Ile Asp Pro Ile Cys Ala Leu Gln Ala Leu Met Glu

    290                 295                 300

Gly Leu Gln Val Leu Thr Leu Glu Asp Val Val Ser Glu Ala Asp Ile

305                 310                 315                 320

Phe Val Thr Thr Thr Gly Asn Lys Asp Ile Ile Met Val Asp His Met

                325                 330                 335

Arg Lys Met Lys Asn Asn Ala Ile Val Cys Asn Ile Gly His Phe Asp

            340                 345                 350

Asn Glu Ile Asp Met Leu Gly Leu Glu Thr Tyr Pro Gly Val Lys Arg

        355                 360                 365

Ile Thr Ile Lys Pro Gln Thr Asp Arg Trp Val Phe Pro Glu Thr Asn

    370                 375                 380

Thr Gly Ile Ile Val Leu Ala Glu Gly Arg Leu Met Asn Leu Gly Cys

385                 390                 395                 400

Ala Thr Gly His Pro Ser Phe Val Met Ser Cys Ser Phe Thr Asn Gln

                405                 410                 415

Val Ile Ala Gln Leu Glu Leu Trp Lys Glu Lys Ser Thr Gly Lys Tyr

            420                 425                 430

Glu Lys Lys Val Tyr Val Leu Pro Lys His Leu Asp Glu Lys Val Ala

        435                 440                 445

Ala Leu His Leu Gly Lys Leu Gly Ala Arg Leu Thr Lys Leu Ser Lys

    450                 455                 460

Ser Gln Ala Asp Tyr Ile Ser Val Pro Val Glu Gly Pro Tyr Lys Pro

465                 470                 475                 480

Ala His Tyr Arg Tyr

                485

<210>6

<211>1458

<212>DNA

<213>水稻同系物(核苷酸序列)，OSCPB

<400>6

atggcgctct ccgtggagaa gacctcgtcg gggagggagt acaaggtgaa ggacctctcc      60

caggcggact tcggccgcct cgagatcgag ctcgccgagg tcgagatgcc ggggctcatg     120

gcgtgccgcg ccgagttcgg cccctcccag ccgttcaagg gcgcccggat ctccgggtcc     180

ctccacatga ccatccagac cgccgtcctc atcgagaccc tcaccgccct tggcgccgag     240

gtccgctggt gctcctgcaa catcttctcc acgcaggacc acgccgccgc cgccatcgcc     300

agggactccg ccgccgtgtt cgcctggaag ggggagaccc tcgaggagta ctggtggtgc     360

accgagcgct gcctcgactg gggcgtcggc ggcggccccg acctcatcgt cgacgacggc     420

ggcgacgcca cgctgctcat ccacgagggc gtcaaggccg aggaggagtt cgagaagtca     480

ggcaaggtcc ccgacccgga gtccaccgac aacgccgagt tcaagatcgt gctcaccatc     540

atccgcgacg gcctcaagtc cgaccccagc aagtaccgca agatgaagga gaggctcgtc     600

ggagtctccg aggagaccac caccggtgtc aagaggctct accagatgca ggagaccggc     660

gccctcctct tccccgccat caacgtcaac gactccgtca ccaagagcaa gtttgacaac     720

ctgtatggtt gccgccactc tctccctgat ggtctcatga gggctaccga tgttatgatc     780

gctggcaagg ttgccgtggt ctgcggttat ggtgatgttg gcaagggctg tgctgctgct     840

ctcaagcagg ctggtgcccg tgtcattgtt actgagattg accccatctg tgccctccag     900

gcccttatgg agggtctcca ggtcctcacc ttggaggatg ttgtctcgga ggctgacatc     960

tttgtgacca ccactggcaa caaggacatc ataatggttg accacatgag gaagatgaag    1020

aacaatgcca tcgtttgcaa cattggtcac tttgacaatg agattgacat gctcggcctt    1080

gagacctacc ctggtgtcaa gcgcatcacc atcaagcctc agaccgaccg ctgggtcttc    1140

cctgagacca acactggcat cattgtcctt gctgagggtc gtctcatgaa ccttgggtgc    1200

gctactggcc accccagttt tgtcatgtcc tgctcattca ctaaccaggt cattgctcag    1260

cttgagctgt ggaaggagaa gagcactggc aagtacgaga agaaggtgta cgttcttccc    1320

aagcacctcg acgagaaggt ggccgccctc cacttgggca agcttggtgc caggctgacc    1380

aagctctcca agtcgcaggc tgactacatc agcgttccag ttgagggtcc ctacaagccc    1440

gcgcactacc ggtactag                                                  1458

<210>7

<211>485

<212>PRT

<213>小麦同系物(氨基酸序列)

<400>7

Met Ala Leu Ser Val Glu Lys Thr Ser Ser Gly Arg Glu Tyr Lys Val

1               5                   10                  15

Lys Asp Leu Phe Gln Ala Asp Phe Gly Arg Leu Glu Leu Glu Leu Ala

            20                  25                  30

Glu Val Glu Met Pro Gly Leu Met Ala Cys Arg Thr Glu Phe Gly Pro

        35                  40                  45

Ser Gln Pro Phe Lys Gly Ala Arg Ile Ser Gly Ser Leu His Met Thr

    50                  55                  60

Ile Gln Thr Ala Val Leu Ile Glu Thr Leu Thr Ala Leu Gly Ala Glu

65                  70                  75                  80

Val Arg Trp Cys Ser Cys Asn Ile Phe Ser Ser Gln Asp His Ala Ala

                85                  90                  95

Ala Ala Ile Ala Arg Asp Ser Ala Ala Val Phe Ala Trp Lys Gly Glu

            100                 105                 110

Thr Leu Glu Glu Tyr Trp Trp Cys Thr Glu Arg Cys Leu Asp Trp Gly

        115                 120                 125

Val Gly Gly Gly Pro Asp Leu Ile Val Asp Asp Gly Gly Asp Ala Thr

    130                 135                 140

Leu Leu Ile His Glu Gly Val Lys Ala Glu Glu Glu Phe Glu Lys Ser

145                 150                 155                 160

Gly Lys Val Pro Asp Pro Glu Ser Thr Asp Asn Pro Glu Phe Lys Ile

                165                 170                 175

Val Leu Thr Ile Ile Arg Asp Gly Leu Lys Thr Asp Ala Ser Lys Tyr

            180                 185                 190

Arg Lys Met Lys Glu Arg Leu Val Gly Val Ser Glu Glu Thr Thr Thr

        195                 200                 205

Gly Val Lys Arg Leu Tyr Gln Met Gln Glu Ser Gly Thr Leu Leu Phe

    210                 215                 220

Pro Ala Ile Asn Val Asn Asp Ser Val Thr Lys Ser Lys Phe Asp Asn

225                 230                 235                 240

Leu Tyr Gly Cys Arg His Ser Leu Pro Asp Gly Leu Met Arg Ala Thr

                245                 250                 255

Asp Val Met Ile Ala Gly Lys Val Ala Val Val Cys Gly Tyr Gly Asp

            260                 265                 270

Val Gly Lys Gly Cys Ala Ala Ala Leu Lys Gln Ala Gly Ala Arg Val

        275                 280                 285

Ile Val Thr Glu Ile Asp Pro Ile Cys Ala Leu Gln Ala Leu Met Glu

    290                 295                 300

Gly Ile Gln Ile Leu Thr Leu Glu Asp Val Val Ser Glu Ala Asp Ile

305                 310                 315                 320

Phe Val Thr Thr Thr Gly Asn Lys Asp Ile Ile Met Val Asp His Met

                325                 330                 335

Arg Lys Met Lys Asn Asn Ala Ile Val Cys Asn Ile Gly His Phe Asp

            340                 345                 350

Asn Glu Ile Asp Met Asn Gly Leu Glu Thr Tyr Pro Gly Val Lys Arg

        355                 360                 365

Ile Thr Ile Lys Pro Gln Thr Asp Arg Trp Val Phe Pro Glu Thr Lys

    370                 375                 380

Thr Gly Ile Ile Val Leu Ala Glu Gly Arg Leu Met Asn Leu Gly Cys

385                 390                 395                 400

Ala Thr Gly His Pro Ser Phe Val Met Ser Cys Ser Phe Thr Asn Gln

                405                 410                 415

Val Ile Ala Gln Leu Glu Leu Trp Asn Glu Lys Ala Ser Gly Lys Tyr

            420                 425                 430

Glu Lys Lys Val Tyr Val Leu Pro Lys His Leu Asp Glu Lys Val Ala

        435                 440                 445

Ala Leu His Leu Gly Lys Leu Gly Ala Arg Leu Thr Lys Leu Thr Lys

    450                 455                 460

Ser Gln Ser Asp Tyr Ile Ser Ile Pro Ile Glu Gly Pro Tyr Lys Leu

465                 470                 475                 480

Arg Leu Tyr Arg Tyr

                485

<210>8

<211>1708

<212>DNA

<213>小麦同系物(核苷酸序列)

<400>8

aatccaccaa ccttctccat ggcgctctcc gtggagaaga cctcgtcggg ccgggagtac     60

aaggtcaagg acctcttcca ggccgacttc ggccgcctcg agctcgagct cgccgaggtc    120

gagatgcccg gcctcatggc ctgccgcacc gagttcggcc cctcgcagcc cttcaagggc    180

gcccggatct ccggctccct ccacatgacc atccagaccg ccgtcctcat cgagaccctc    240

accgccctcg gcgccgaggt ccgctggtgc tcctgcaaca tcttctccag ccaggaccac    300

gccgccgccg ccatcgcccg cgactccgcg gccgtcttcg cctggaaggg cgagaccctc     360

gaggagtact ggtggtgcac cgagcgctgc ctcgactggg gcgtcggcgg cggccccgac     420

ctcatcgtcg acgacggcgg tgacgccacg ctgctcatcc acgagggcgt caaggccgag     480

gaggagttcg agaaatccgg caaggttccc gacccggagt ccaccgacaa ccccgagttc     540

aagatcgtcc tcaccatcat ccgcgacggg ctcaagaccg acgccagcaa gtaccgcaag     600

atgaaggaga ggctcgtcgg tgtctccgag gagaccacca ccggcgtcaa gaggctctac     660

cagatgcagg agtccggcac cctcctcttc cccgccatca acgtcaacga ctccgtcacc     720

aagagcaagt ttgacaacct ttacggttgc cgtcactcgc tccctgatgg tcttatgagg     780

gccactgatg ttatgatcgc cggcaaggtc gccgtggtct gcggttacgg tgatgttggc     840

aagggctgtg ccgccgcact caagcaggct ggtgcccgtg tgatcgtgac agagattgac     900

cccatctgtg cccttcaggc cctgatggag ggtatccaga tcctcacctt ggaggatgtt     960

gtctctgagg ctgacatctt tgtgaccacc accggaaaca aggacatcat catggtcgac    1020

cacatgagga agatgaagaa caacgccatt gtctgcaaca ttggtcactt tgacaatgag    1080

atcgacatga acggccttga gacctaccct ggtgtcaagc gcatcaccat caagccccag    1140

actgaccgtt gggtcttccc cgagaccaag actggcatca ttgttcttgc tgagggtcgt    1200

ctgatgaacc ttggatgtgc cactggccac cccagctttg tcatgtcctg ctcattcacc    1260

aaccaggtta ttgctcagct tgagttgtgg aacgagaagg ccagtggcaa gtatgagaag    1320

aaggtgtacg ttctccccaa gcacctcgac gagaaggtcg cggccctcca cttgggcaag    1380

ctcggcgcca ggctgaccaa gctcaccaag tcccagtctg actacattag catcccaatt    1440

gagggtcctt acaagctgcg gctttaccgg tactagtgtg tccagcatga ctagcggctg    1500

gcctgagcct gagtcggagc agcggcacca acgggaactc tatcaactat cctgtttccc    1560

ttctattatc ttacatgctg tctcttaggc ggaggatttg ttattatggt tatgttttga    1620

gccttgtgag ggttgggaga ggcggcgttt gcttttgccc agaaataatg gcattattat    1680

tggtttaagt gaggaggtgt gcttttcc                                       1708

<210>9

<211>485

<212>PRT

<213>菊花同系物(氨基酸序列)

<400>9

Met Ser Leu Thr Val Glu Lys Thr Thr Ser Gly Arg Glu Tyr Lys Val

1               5                   10                  15

Lys Asp Met Ser Leu Ala Asp Phe Gly Arg Leu Glu Leu Glu Leu Ala

            20                  25                  30

Glu Val Glu Met Pro Gly Leu Met Ser Cys Arg Thr Glu Phe Gly Pro

        35                  40                  45

Ser Gln Pro Phe Lys Gly Ala Arg Ile Thr Gly Ser Leu His Met Thr

    50                  55                  60

Ile Gln Thr Gly Val Leu Ile Glu Thr Leu Thr Ala Leu Gly Ala Glu

65                  70                  75                  80

Val Arg Trp Cys Ser Cys Asn Ile Phe Ser Thr Gln Asp His Ala Ala

                85                  90                  95

Ala Ala Ile Ala Arg Asp Ser Ala Ala Val Phe Ala Trp Lys Gly Glu

            100                 105                 110

Thr Leu Gln Glu Tyr Trp Trp Cys Thr Glu Arg Ala Leu Asp Trp Gly

        115                 120                 125

Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Ile Val Asp Asp Gly Gly Asp Ala Thr

    130                 135                 140

Leu Leu Ile His Glu Gly Val Lys Ala Glu Glu Glu Phe Ala Lys Ser

145                 150                 155                 160

Gly Lys Leu Pro Asp Pro Thr Ser Thr Asp Asn Ala Glu Phe Gln Ile

                165                 170                 175

Val Leu Ser Ile Ile Lys Glu Gly Leu Ser Thr Asp Pro Leu Lys Tyr

            180                 185                 190

His Lys Met Lys Glu Arg Leu Val Gly Val Ser Glu Glu Thr Thr Thr

        195                 200                 205

Gly Val Lys Arg Leu Tyr Gln Met Gln Ala Asn Gly Thr Leu Leu Phe

    210                 215                 220

Pro Ala Ile Asn Val Asn Asp Ser Val Thr Lys Ser Lys Phe Asp Asn

225                 230                 235                 240

Leu Tyr Gly Cys Arg His Ser Leu Pro Asp Gly Leu Met Arg Ala Thr

                245                 250                 255

Asp Val Met Ile Ala Gly Lys Val Ala Val Val Cys Gly Tyr Gly Asp

            260                 265                 270

Val Gly Lys Gly Cys Ala Ser Ala Met Lys Gln Ala Gly Ala Arg Val

        275                 280                 285

Ile Val Thr Glu Ile Asp Pro Ile Cys Ala Leu Gln Ala Thr Met Glu

    290                 295                 300

Gly Leu Gln Val Leu Thr Leu Glu Asp Val Val Ser Glu Ala Asp Ile

305                 310                 315                 320

Phe Val Thr Thr Thr Gly Asn Lys Asp Ile Ile Met Val Asp Asp Met

                325                 330                 335

Arg Lys Met Lys Asn Asn Ala Ile Val Cys Asn Ile Gly His Phe Asp

            340                 345                 350

Asn Glu Ile Asp Met Leu Gly Leu Glu Thr Tyr Pro Gly Val Lys Arg

        355                 360                 365

Ile Thr Ile Lys Pro Gln Thr Asp Arg Trp Val Phe Pro Glu Thr Lys

    370                 375                 380

Ser Gly Val Ile Ile Leu Ala Glu Gly Arg Leu Met Asn Leu Gly Cys

385                 390                 395                 400

Ala Thr Gly His Pro Ser Phe Val Met Ser Cys Ser Phe Thr Asn Gln

                405                 410                 415

Val Ile Ala Gln Leu Glu Leu Trp Asn Glu Lys Gly Thr Gly Lys Tyr

            420                 425                 430

Lys Lys Glu Val Tyr Val Leu Pro Lys His Leu Asp Glu Lys Val Ala

        435                 440                 445

Ala Leu His Leu Gly Lys Leu Gly Ala Lys Leu Thr Lys Leu Thr Lys

    450                 455                 460

Asp Gln Ser Asp Tyr Leu Ser Ile Pro Ile Glu Gly Pro Tyr Lys Pro

465                 470                 475                 480

Ala Ala Tyr Arg Tyr

                485

<210>10

<211>1535

<212>DNA

<213>菊花同系物(核苷酸序列)

<400>10

gatcagatct caaaacccaa accttaaacc atgtctctta ctgtagagaa aaccacctct     60

ggccgtgaat acaaggtcaa ggacatgtcc ttggctgact tcggccgtct cgaactcgag    120

ttagccgagg tcgagatgcc cgggcttatg tcctgcagga ccgaattcgg cccttctcag    180

ccttttaagg gagccagaat cactggatcc cttcacatga ccatccagac cggtgttctt    240

attgaaactt tgactgcttt gggtgctgag gttagatggt gctcttgcaa catcttttcg    300

acccaagacc atgctgctgc agccattgct cgtgactctg ctgcggtttt cgcctggaag    360

ggggagactc ttcaggagta ctggtggtgt actgagcgag cacttgactg gggtccaggt    420

ggtggtcctg atttgattgt ggatgatggt ggtgatgcta cgcttttgat ccatgaggga    480

gtgaaggccg aggaggagtt cgccaagagc ggtaaattgc ctgaccccac ttccactgac    540

aatgctgagt tccagattgt gttgtcgatt attaaggaag gactttcgac cgacccattg     600

aagtaccaca agatgaagga aagactagtt ggtgtctctg aggaaaccac cactggtgtc     660

aagaggttgt accaaatgca agccaacggt actttgttgt tccctgccat caatgttaac     720

gattccgtca ccaagagcaa gtttgacaac ttgtatggat gccgtcactc actccctgat     780

ggtttgatga gagctactga tgtcatgatc gccggaaagg ttgcagtcgt ctgtggttac     840

ggagatgttg gaaagggttg tgcttcagcc atgaagcaag ctggtgctcg tgtcattgtg     900

acagaaattg atcccatctg tgctcttcag gctaccatgg aaggtctcca agtgctaact     960

ttggaagatg tcgtatccga agctgatatt tttgttacca ccaccggtaa caaggacatc    1020

atcatggttg atgacatgag gaagatgaag aacaatgcca tcgtctgcaa cattggtcac    1080

tttgacaatg aaatcgacat gcttggtctt gagacttacc ctggtgtcaa gagaatcacc    1140

atcaagcccc aaaccgacag gtgggtgttc cccgagacca agagtggcgt cattatcttg    1200

gctgagggta ggctcatgaa cttgggttgt gctactggtc accctagttt cgtgatgtct    1260

tgctctttca ctaaccaagt gattgctcaa cttgagttgt ggaatgagaa gggaaccggc    1320

aagtacaaga aggaggtgta tgtgttgccc aagcaccttg acgagaaggt ggctgcactt    1380

catcttggaa agcttggagc caagctcact aagctcacca aggaccagtc tgactacctc    1440

agcattccta ttgaaggtcc ttacaagcct gctgcctaca ggtactgatc aaagaggata    1500

tctgctgttc agcaagactt tgaagaacct atggg                               1535

<210>11

<211>466

<212>PRT

<213>芥蓝同系物(氨基酸序列)

<400>11

Met Ala Leu Ile Val Glu Lys Thr Ser Ser Gly Arg Glu Tyr Lys Val

1               5                   10                  15

Lys Asp Met Ser Gln Ala Asp Phe Gly Arg Leu Glu Leu Glu Leu Ala

            20                  25                  30

Glu Val Glu Met Pro Gly Leu Met Ala Cys Arg Thr Glu Phe Gly Pro

        35                  40                  45

Ala Gln Pro Phe Lys Gly Ala Arg Ile Thr Gly Ser Leu His Met Thr

    50                  55                  60

Ile Gln Thr Ala Val Leu Ile Glu Thr Leu Thr Ala Leu Gly Ala Glu

65                  70                  75                  80

Val Arg Trp Cys Ser Cys Asn Ile Phe Ser Thr Gln Asp His Ala Ala

                85                  90                  95

Ala Ala Ile Ala Arg Asp Ser Ala Ala Val Phe Ala Trp Lys Gly Glu

            100                 105                 110

Thr Leu Gln Glu Tyr Trp Trp Cys Thr Glu Arg Ala Leu Asp Trp Gly

        115                 120                 125

Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Ile Val Asp Asp Gly Gly Asp Ala Thr

    130                 135                 140

Leu Leu Ile His Glu Gly Val Lys Ala Glu Glu Ile Phe Glu Lys Thr

145                 150                 155                 160

Gly Gln Val Pro Asp Pro Thr Ser Thr Asp Asn Pro Glu Phe Gln Ile

                165                 170                 175

Val Leu Ser Ile Ile Lys Glu Gly Leu Gln Val Asp Pro Lys Lys Tyr

            180                 185                 190

His Lys Met Lys Glu Arg Leu Val Gly Val Ser Glu Glu Thr Thr Thr

        195                 200                 205

Gly Val Lys Arg Leu Tyr Gln Met Gln Glu Ser Gly Ala Leu Leu Phe

    210                 215                 220

Pro Ala Ile Asn Val Asn Asp Ser Val Thr Lys Ser Lys Phe Asp Asn

225                 230                 235                 240

Leu Tyr Gly Cys Arg His Ser Leu Pro Asp Gly Leu Met Arg Ala Thr

                245                 250                 255

Asp Val Met Ile Ala Gly Lys Val Ala Val Ile Cys Gly Tyr Gly Asp

            260                 265                 270

Val Gly Lys Gly Cys Ala Ala Ala Met Lys Thr Ala Gly Ala Arg Val

        275                 280                 285

Ile Val Thr Glu Ile Asp Pro Ile Cys Ala Leu Gln Ala Met Met Glu

    290                 295                 300

Gly Leu Gln Val Leu Thr Leu Glu Asp Val Val Ser Glu Ala Asp Ile

305                 310                 315                 320

Phe Val Thr Thr Thr Gly Asn Lys Asp Ile Ile Met Val Asp His Met

                325                 330                 335

Arg Lys Met Lys Asn Asn Ala Ile Val Cys Asn Ile Gly His Phe Asp

            340                 345                 350

Asn Glu Ile Asp Met Gln Gly Leu Glu Thr Phe Pro Gly Val Lys Arg

        355                 360                 365

Ile Thr Ile Lys Pro Gln Thr Asp Arg Trp Val Phe Pro Asp Thr Lys

    370                 375                 380

Ser Gly Ile Ile Val Leu Ala Glu Gly Arg Leu Met Asn Leu Gly Cys

385                 390                 395                 400

Ala Thr Gly His Pro Ser Phe Val Met Ser Tyr Pro Phe Thr Asn Gln

                405                 410                 415

Val Ile Ala Gln Leu Glu Leu Trp Asn Glu Lys Ser Ser Gly Lys Tyr

            420                 425                 430

Glu Lys Lys Val Tyr Val Leu Pro Lys His Leu Asp Glu Lys Val Ala

        435                 440                 445

Ala Leu His Leu Gly Lys Leu Gly Ala Lys Leu Thr Lys Leu Thr Lys

    450                 455                 460

Asp Ile

465

<210>12

<211>1752

<212>DNA

<213>芥蓝同系物(核苷酸序列)

<400>12

acggggacac acttctctct acccctctct ctgccccaat cttagatccg aaaaaatggc     60

gttgatcgtt gagaagacgt cgagtggccg tgagtacaag gtcaaggaca tgtctcaggc    120

cgacttcggt cgtctcgagc tcgagctcgc cgaagttgag atgccaggac tcatggcttg    180

ccgtaccgag ttcggcccag ctcagccctt caaaggcgct agaatcaccg gatctctcca    240

catgacgatc cagaccgccg tcctcatcga aaccctaacc gccctcggcg cggaagtcag    300

atggtgctcc tgcaacatct tctcaaccca agaccacgcc gccgccgcaa tcgcccgtga    360

ctccgccgcc gttttcgcct ggaaaggtga gacgcttcag gagtactggt ggtgcacgga    420

gcgtgctctc gactggggcc caggtggtgg tccagatctg atcgtcgatg acggtggcga    480

cgccacgctt ttgatccacg agggagtgaa ggccgaggag atctttgaga agacgggtca    540

ggttcctgat cccacttcca ctgacaaccc tgagttccag atcgtgcttt cgatcatcaa    600

ggaaggtctc caggttgatc ctaagaagta ccacaagatg aaggagagac tcgtcggtgt    660

ctctgaggag accaccaccg gtgtcaagag gctttaccag atgcaggaaa gtggagccct    720

tttgttccca gccattaacg tcaacgactc cgtcaccaag agcaagttcg acaacttgta    780

cggttgccgt cactctctac ctgatggtct catgagggcc actgatgtca tgatcgccgg    840

aaaggttgcg gttatctgtg gttatggtga tgtcggtaag ggttgtgccg ctgccatgaa    900

aaccgctggt gctagagtca ttgtgaccga gatcgacccc atctgtgccc tacaagctat    960

gatggaaggg cttcaagttc tgacccttga ggatgtcgtc tctgaagctg acatctttgt   1020

caccaccacc ggtaacaaag acatcatcat ggttgaccac atgaggaaga tgaagaacaa   1080

cgctatcgtc tgcaacattg gtcactttga caacgagatt gacatgcaag gacttgagac    1140

cttccctgga gtgaagcgta tcaccatcaa gccccagacc gacaggtggg tgttcccaga    1200

caccaagtcc ggaatcattg ttttggccga gggtcgtctc atgaacttgg gttgtgccac    1260

tggtcaccca agtttcgtga tgtcttaccc tttcaccaac caggtgattg cccagcttga    1320

gctttggaac gagaagtcga gcggtaagta cgagaagaag gtgtacgttc tacccaagca    1380

tttggatgag aaggttgcgg cacttcactt gggcaagctt ggagctaagc tcactaagct    1440

gacaaaggac atctgactag tcagcattcc cattgaagga ccatacaagc ctgctcacta    1500

caggtactga gagaagaatg gagagagcgg tttatttcta gtttggtctt ctgatgaagt    1560

tgaccgaata tccttctgaa taaggattct tgtcttttga ttgttgtgct tgttcttctt    1620

ttttctgaat ttatcttgaa acttaaatta gcctttggtt atttgatttt gtgttgtgtt    1680

cattgttcta ctctttaaaa aatagaaaca aaaaagttgg ataaaaaaaa aaaaaaaaaa    1740

aaaaaaaaaa aa                                                        1752

<210>13

<211>485

<212>PRT

<213>矮牵牛同系物(氨基酸序列)，PETCBP

<400>13

Met Ala Leu Leu Val Glu Lys Thr Thr Ser Gly Arg Glu Tyr Lys Val

1               5                   10                  15

Lys Asp Met Ser Gln Ala Asp Phe Gly Arg Leu Glu Ile Glu Leu Ala

            20                  25                  30

Glu Val Glu Met Pro Gly Leu Met Ala Cys Arg Thr Glu Phe Gly Pro

        35                  40                  45

Ser Gln Pro Phe Lys Gly Ala Lys Ile Thr Gly Ser Leu His Met Thr

    50                  55                  60

Ile Gln Thr Ala Val Leu Ile Glu Thr Leu Thr Ala Leu Gly Ala Glu

65                  70                  75                  80

Val Arg Trp Cys Ser Cys Asn Ile Phe Ser Thr Gln Asp His Ala Ala

                85                  90                  95

Ala Ala Ile Ala Arg Asp Ser Ala Ala Val Phe Ala Trp Lys Gly Glu

            100                 105                 110

Thr Leu Gln Glu Tyr Trp Trp Cys Thr Glu Arg Ala Leu Asp Trp Gly

        115                 120                 125

Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Ile Val Asp Asp Gly Gly Asp Ala Thr

    130                 135                 140

Leu Leu Ile His Glu Gly Val Lys Ala Glu Glu Glu Tyr Ala Lys Asp

145                 150                 155                 160

Gly Thr Val Pro Asp Pro Thr Ser Thr Asp Asn Val Glu Phe Gln Leu

                165                 170                 175

Val Leu Gly Ile Ile Lys Glu Ser Leu Lys Thr Asp Pro Thr Lys His

            180                 185                 190

Thr Lys Met Lys Glu Arg Leu Val Gly Val Ser Glu Glu Thr Thr Thr

        195                 200                 205

Gly Val Lys Arg Leu Thr Arg Cys Lys Leu Met Glu Leu Cys Phe Ser

    210                 215                 220

Gln Leu Pro Asn Val Asn Asp Ser Val Thr Lys Ser Lys Phe Asp Asn

225                 230                 235                 240

Leu Tyr Gly Cys Arg His Ser Leu Pro Asp Gly Leu Met Arg Ala Thr

                245                 250                 255

Asp Val Met Ile Ala Gly Lys Val Ala Val Val Ala Gly Tyr Gly Asp

            260                 265                 270

Val Gly Lys Gly Cys Ala Met Ser Leu Lys Gln Ala Gly Ala Arg Val

        275                 280                 285

Ile Val Thr Glu Ile Asp Pro Ile Cys Ala Leu Gln Ala Leu Met Glu

    290                 295                 300

Gly Leu Gln Val Leu Thr Leu Glu Asp Val Val Ala Asp Ala Asp Ile

305                 310                 315                 320

Phe Val Thr Thr Thr Gly Asn Lys Asp Ile Ile Met Val Asp His Met

                325                 330                 335

Arg Lys Met Lys Asn Asn Ala Ile Val Cys Asn Ile Gly His Phe Asp

            340                 345                 350

Asn Glu Ile Asp Met Leu Gly Leu Glu Thr Phe Pro Gly Val Lys Arg

        355                 360                 365

Ile Thr Ile Lys Pro Gln Thr Asp Arg Trp Val Phe Pro Asp Thr Asn

    370                 375                 380

Ser Gly Ile Ile Val Leu Ala Glu Gly Arg Leu Met Asn Leu Gly Cys

385                 390                 395                 400

Ala Thr Gly His Pro Ser Val Val Met Ser Cys Ser Phe Thr Asn Gln

                405                 410                 415

Val Ile Ala Gln Leu Glu Leu Trp Asn Glu Lys Ser Ser Gly Lys Tyr

            420                 425                 430

Glu Lys Lys Val Tyr Val Leu Pro Lys His Leu Asp Glu Lys Val Ala

        435                 440                 445

Ala Leu His Leu Gly Lys Leu Gly Ala Lys Leu Thr Lys Leu Ser Lys

    450                 455                 460

Asp Gln Ala Asp Tyr Ile Asn Val Pro Val Glu Gly Pro Tyr Lys Pro

465                 470                 475                 480

Val His Tyr Arg Tyr

                485

<210>14

<211>1855

<212>DNA

<213>矮牵牛同系物(核苷酸序列)，PETCBP

<400>14

gcgggggtct cactttcttc ttctctacaa aaaccccatc aagaagtaga gctaaaaaac      60

tccatttcaa taatggcttt acttgttgaa aaaacaacat caggccgtga gtacaaggtt     120

aaagacatgt ctcaggcaga cttcggccgg ctcgaaatcg agttggccga agttgaaatg     180

cctggactca tggcttgtcg tactgaattt ggaccttcac aaccttttaa aggtgccaag     240

attactggat ctttacatat gactattcaa actgctgtct tgattgagac tttgacagca     300

ttaggtgctg aagttagatg gtgttcttgt aatatctttt ctactcaaga tcatgctgct     360

gctgctatcg ctcgtgatag cgctgctgtc ttcgcctgga aaggcgagac cttgcaggag     420

tactggtggt gtaccgagag ggcactagat tggggtccag gtggaggacc tgatttgatt     480

gttgatgatg gaggtgacgc tacactcttg attcatgaag gagttaaagc tgaagaagag     540

tatgctaagg atgggacagt cccagatcct acctctaccg ataacgttga gtttcagctt     600

gtgctaggta ttattaagga aagtttaaag actgatccta caaagcatac taagatgaag     660

gaaaggcttg ttggtgtttc tgaggaaact accactggtg ttaagagact taccagatgc     720

aagctaatgg aactttgctt ttcccagcta cccaatgtta acgactctgt taccaagagc     780

aagtttgaca acttgtacgg atgccgccac tcactgcccg atggtctcat gagggctact     840

gatgttatga ttgccggaaa ggttgccgtt gttgccggtt acggagatgt tggcaaaggg     900

tgtgctatgt ccttgaagca agctggtgcc cgtgtgatcg tgactgagat tgacccaatc     960

tgtgctctcc aggctctcat ggaaggccta caagttctca ctcttgagga tgttgttgct    1020

gatgctgata tctttgtcac cacaaccggt aacaaggaca tcatcatggt tgaccacatg    1080

aggaagatga agaacaatgc cattgtctgc aacattggcc actttgacaa tgaaatcgac    1140

atgcttggtc ttgagacatt cccaggtgtg aagaggatca caatcaagcc tcaaactgac    1200

aggtgggtct tcccagacac caacagtggc atcattgtct tggccgaggg tcgtctcatg    1260

aacttgggat gtgccactgg acaccccagt gtcgtgatgt cctgttcttt cactaaccaa    1320

gtcattgccc aactcgagtt gtggaatgag aagagctctg gcaagtatga gaagaaggtg    1380

tacgtcttgc caaagcacct cgacgagaag gtcgctgccc ttcaccttgg aaagctcgga    1440

gccaagctta ccaagctctc caaggatcaa gctgactaca ttaacgtacc agttgagggt    1500

ccttacaagc cagttcacta caggtactaa gggaagacaa attgacagtg gagatacatt    1560

ctcgcggcat gattgttttg cttttaatac tttgattttg tttaggatac tagtgttttt    1620

attattgttg gggatatatt gaggggaagt tgggcatgtt ttgctggaaa gaaatggtct    1680

catttgaaag aaagacctaa atgtgttgaa taagatttga gttatggttg ggtggtgtgg    1740

tatgatattg tagtaagtta gatccttttg cgttttggtc tatgattttt gtttcaagaa    1800

atcagagcta cattttctct ttccaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa         1855

<210>15

<211>850

<212>DNA

<213>HOG1的850bp反义构建体

<400>15

gcgctagaat caccggatct ctccacatga cgatccagac cgccgtcctc atcgaaaccc     60

taaccgccct cggcgcggaa gtcagatggt gctcctgcaa catcttctca acccaagacc    120

acgccgccgc cgcaatcgcc cgtgactccg ccgccgtttt cgcctggaaa ggtgagacgc    180

ttcaggagta ctggtggtgc acggagcgtg ctctcgactg gggcccaggt ggtggtccag    240

atctgatcgt cgatgacggt ggcgacgcca cgcttttgat ccacgaggga gtgaaggccg    300

aggagatctt tgagaagacg ggtcaggttc ctgatcccac ttccactgac aaccctgagt    360

tccagatcgt gctttcgatc atcaaggaag gtctccaggt tgatcctaag aagtaccaca    420

agatgaaggg gagactcgtc ggtgtctctg aggagaccac caccggtgtc aagaggcttt    480

accagatgca ggaaagtgga gcccttttgt tcccagccat taacgtcaac gactccgtca    540

ccaagagcaa gttcgacaac ttgtacggtt gccgtcactc tctacctgat ggtctcatga    600

gggccactga tgtcatgatc gccggaaagg ttgcggttat ctgtggttat ggtgatgtcg    660

gtaagggttg tgccgctgcc atgaaaaccg ctggtgctag agtcattgtg accgagatcg    720

accccatctg tgccctacaa gctatgatgg aagggcttca agttctgacc cttgaggatg    780

tcgtctctga agctgacatc tttgtcacca ccaccggtaa caaagacatc atcatggttg    840

accacatgag                                                           850

<210>16

<211>15

<212>DNA

<213>反义片段1

<400>16

ctcggcgcgg aagtc                                       15

<210>17

<211>15

<212>DNA

<213>反义片段2

<400>17

tcggcgcgga agtca                                       15

<210>18

<211>15

<212>DNA

<213>反义片段3

<400>18

cggcgcggaa gtcag                                       15

<210>19

<211>15

<212>DNA

<213>反义片段4

<400>19

ggcgcggaag tcaga                                       15

<210>20

<211>9

<212>DNA

<213>siRNA片段1

<400>20

agatccgaa                                              9

<210>21

<211>9

<212>DNA

<213>siRNA片段2

<400>21

gatccgaaa                                              9

<210>22

<211>9

<212>DNA

<213>siRNA片段3

<400>22

atccgaaaa                                              9

<210>23

<211>9

<212>DNA

<213>siRNA片段4

<400>23

tccgaaaaa                                              9

<210>24

<211>30

<212>DNA

<213>引物PET1

<400>24

aagatgccct ggactctact atggtcactt                       30

<210>25

<211>24

<212>DNA

<213>引物PET2

<400>25

tcagaacttg ctcttggtag acag                             24

<210>26

<211>432

<212>PRT

<213>人类(氨基酸序列)，SAHH

<400>26

Met Ser Asp Lys Leu Pro Tyr Lys Val Ala Asp Ile Gly Leu Ala Ala

1               5                   10                  15

Trp Gly Arg Lys Ala Leu Asp Ile Ala Glu Asn Glu Met Pro Gly Leu

            20                  25                  30

Met Arg Met Arg Glu Arg Tyr Ser Ala Ser Lys Pro Leu Lys Gly Ala

        35                  40                  45

Arg Ile Ala Gly Cys Leu His Met Thr Val Glu Thr Ala Val Leu Ile

    50                  55                  60

Glu Thr Leu Val Thr Leu Gly Ala Glu Val Gln Trp Ser Ser Cys Asn

65                  70                  75                  80

Ile Phe Ser Thr Gln Asp His Ala Ala Ala Ala Ile Ala Lys Ala Gly

                85                  90                  95

Ile Pro Val Tyr Ala Trp Lys Gly Glu Thr Asp Glu Glu Tyr Leu Trp

            100                 105                 110

Cys Ile Glu Gln Thr Leu Tyr Phe Lys Asp Gly Pro Leu Asn Met Ile

        115                 120                 125

Leu Asp Asp Gly Gly Asp Leu Thr Asn Leu Ile His Thr Lys Tyr Pro

    130                 135                 140

Gln Leu Leu Pro Gly Ile Arg Gly Ile Ser Glu Glu Thr Thr Thr Gly

145                 150                 155                 160

Val His Asn Leu Tyr Lys Met Met Ala Asn Gly Ile Leu Lys Val Pro

                165                 170                 175

Ala Ile Asn Val Asn Asp Ser Val Thr Lys Ser Lys Phe Asp Asn Leu

            180                 185                 190

Tyr Gly Cys Arg Glu Ser Leu Ile Asp Gly Ile Lys Arg Ala Thr Asp

        195                 200                 205

Val Met Ile Ala Gly Lys Val Ala Val Val Ala Gly Tyr Gly Asp Val

    210                 215                 220

Gly Lys Gly Cys Ala Gln Ala Leu Arg Gly Phe Gly Ala Arg Val Ile

225                 230                 235                 240

Ile Thr Glu Ile Asp Pro Ile Asn Ala Leu Gln Ala Ala Met Glu Gly

                245                 250                 255

Tyr Glu Val Thr Thr Met Asp Glu Ala Cys Gln Glu Gly Asn Ile Phe

            260                 265                 270

Val Thr Thr Thr Gly Cys Ile Asp Ile Ile Leu Gly Arg His Phe Glu

        275                 280                 285

Gln Met Lys Asp Asp Ala Ile Val Cys Asn Ile Gly His Phe Asp Val

    290                 295                 300

Glu Ile Asp Val Lys Trp Leu Asn Glu Asn Ala Val Glu Lys Val Asn

305                 310                 315                 320

Ile Lys Pro Gln Val Asp Arg Tyr Arg Leu Lys Asn Gly Arg Arg Ile

                325                 330                 335

Ile Leu Leu Ala Glu Gly Arg Leu Val Asn Leu Gly Cys Ala Met Gly

            340                 345                 350

His Pro Ser Phe Val Met Ser Asn Ser Phe Thr Asn Gln Val Met Ala

        355                 360                 365

Gln Ile Glu Leu Trp Thr His Pro Asp Lys Tyr Pro Val Gly Val His

    370                 375                 380

Phe Leu Pro Lys Lys Leu Asp Glu Ala Val Ala Glu Ala His Leu Gly

385                 390                 395                 400

Lys Leu Asn Val Lys Leu Thr Lys Leu Thr Glu Lys Gln Ala Gln Tyr

                405                 410                 415

Leu Gly Met Ser Cys Asp Gly Pro Phe Lys Pro Asp His Tyr Arg Tyr

            420                 425                 430

<210>27

<211>485

<212>PRT

<213>番茄同系物(氨基酸序列)

<400>27

Met Ala Leu Leu Val Glu Lys Thr Thr Ser Gly Arg Glu Tyr Lys Val

1               5                   10                  15

Lys Asp Met Ser Gln Ala Asp Phe Gly Arg Leu Glu Ile Glu Leu Ala

            20                  25                  30

Glu Val Glu Met Pro Gly Leu Met Ala Ser Arg Ala Glu Phe Gly Pro

        35                  40                  45

Ser Gln Pro Val Lys Gly Ala Lys Ile Thr Cys Ser Leu His Met Thr

    50                  55                  60

Ile Gln Thr Ala Phe Leu Ile Glu Thr Leu Thr Ala Leu Gly Ala Glu

65                  70                  75                  80

Val Arg Trp Cys Ser Cys Asn Ile Phe Ser Thr Gln Asp His Ala Ala

                85                  90                  95

Ala Ala Ile Ala Arg Asp Ser Ala Ala Val Phe Ala Trp Lys Gly Glu

            100                 105                 110

Thr Leu Gln Glu Tyr Trp Trp Cys Thr Glu Arg Ala Leu Asp Trp Gly

        115                 120                 125

Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Ile Val Asp Asp Gly Gly Asp Ala Thr

    130                 135                 140

Leu Leu Ile His Glu Gly Val Lys Ala Glu Glu Glu Phe Ala Lys Asn

145                 150                 155                 160

Gly Thr Val Pro Asp Pro Thr Ser Thr Asp Asn Val Glu Phe Gln Leu

                165                 170                 175

Val Leu Thr Ile Ile Lys Glu Ser Leu Lys Thr Asp Pro Leu Arg Tyr

            180                 185                 190

Thr Lys Met Lys Glu Arg Leu Val Gly Val Ser Glu Glu Thr Thr Thr

        195                 200                 205

Gly Val Lys Lys Leu Tyr Gln Met Pro Ala Asn Gly Ser Leu Leu Phe

    210                 215                 220

Leu Pro Ile Asn Val Asn Asp Ser Val Thr Lys Ser Lys Phe Asp Asn

225                 230                 235                 240

Leu Tyr Gly Cys Arg His Ser Leu Pro Asp Gly Leu Met Arg Ala Thr

                245                 250                 255

Asp Val Met Ile Ala Gly Lys Val Ala Leu Val Ala Gly Tyr Gly Asp

            260                 265                 270

Val Gly Lys Gly Cys Ala Ala Ala Met Lys Gln Ala Gly Ala Arg Val

        275                 280                 285

Ile Val Thr Glu Ile Asp Pro Ile Cys Ala Leu Gln Ala Thr Met Glu

    290                 295                 300

Gly Leu Gln Val Leu Phe Leu Glu Asp Val Val Ser Glu Val Asp Ile

305                 310                 315                 320

Phe Val Thr Thr Thr Gly Asn Lys Asp Ile Ile Met Val Asp His Met

                325                 330                 335

Arg Lys Met Lys Asn Asn Ala Ile Val Cys Asn Ile Gly His Phe Asp

            340                 345                 350

Asn Glu Ile Asp Met His Gly Leu Glu Thr Phe Pro Gly Val Lys Arg

        355                 360                 365

Ile Thr Ile Lys Pro Gln Thr Asp Arg Trp Val Phe Pro Asp Thr Asn

    370                 375                 380

Ser Gly Ile Ile Val Leu Ala Glu Gly Arg Leu Met Asn Leu Gly Cys

385                 390                 395                 400

Ala Thr Gly His Pro Ser Phe Val Met Ser Cys Ser Phe Thr Asn Gln

                405                 410                 415

Val Ile Ala Gln Leu Glu Leu Trp Asn Glu Arg Ser Ser Gly Lys Tyr

            420                 425                 430

Glu Lys Lys Val Tyr Val Leu Pro Lys His Leu Asp Glu Lys Val Ala

        435                 440                 445

Ala Leu His Leu Gly Lys Phe Gly Ala Lys Leu Thr Lys Leu Thr Lys

    450                 455                 460

Asp Gln Ala Asp Tyr Ile Tyr Val Pro Val Glu Gly Pro Tyr Lys Pro

465                 470                 475                 480

Ala His Tyr Arg Tyr

                485

<210>28

<211>1754

<212>DNA

<213>番茄同系物(核苷酸序列)

<400>28

tctcagatct catcttaaac cctttttttt ctcttatact cgccttaccc atggctctac     60

tcgttgagaa gaccacctct ggccgcgagt acaaggtgaa ggacatgtct caggctgact    120

tcggcaggct cgaaatcgag cttgctgaag ttgaaatgcc tggtctcatg gcttcacggg    180

ctgaatttgg gccttcacag cccgttaaag gtgcaaagat cacttgttct ttgcatatga    240

ctatccaaac tgctttcctg attgaaaccc taactgcttt gggtgctgaa gttagatggt     300

gttcttgcaa catcttctca actcaggacc atgctgcagc agccattgca cgtgacagtg     360

ctgctgtctt tgcctggaaa ggtgagactt tgcaggagta ctggtggtgt actgagaggg     420

cacttgactg gggtccaggt ggtggtcctg atctgattgt tgatgatgga ggtgatgcta     480

ctctgttgat tcatgaggga gttaaggctg aagaggagtt tgctaagaat ggaacagtcc     540

cagatcccac ttctactgac aatgttgagt ttcaacttgt gcttactatt attaaggaga     600

gcttaaagac tgatccatta aggtacacta agatgaagga gagacttgtt ggtgtttctg     660

aggaaactac cactggtgtt aagaagcttt accaaatgcc agctaatgga tctttgcttt     720

tcctgcctat caatgttaat gactctgtta ccaagagcaa gtttgacaac ttgtatggat     780

gccgccactc acttcccgat ggtctcatga gggctactga tgttatgatt gctggaaagg     840

ttgctcttgt tgctggttat ggagatgtcg gcaagggatg tgctgctgcc atgaaacaag     900

ctggtgcccg tgtgattgtg actgagattg acccaatctg tgctctccag gctaccatgg     960

aaggccttca ggttttgttc ttggaggatg ttgtttctga ggttgatatc tttgtgacca    1020

ccaccggtaa caaggacatc atcatggttg accacatgag gaagatgaag aacaatgcca    1080

ttgtctgcaa cattggtcac tttgacaacg aaatcgacat gcatggtctt gaaaccttcc    1140

ctggtgtgaa gaggatcaca atcaagccac aaaccgacag atgggtcttt cccgacacca    1200

acagtggcat cattgtgttg gccgagggtc gtctcatgaa cttgggatgt gccactggac    1260

accccagttt tgtgatgtct tgctctttca ctaaccaagt cattgcccaa ctcgagttgt    1320

ggaatgagag gagcagtggc aaatacgaga agaaggtgta cgtcttgcca aagcaccttg    1380

acgagaaggt tgctgccctt catcttggaa agttcggagc caagcttacc aaactcacca    1440

aggatcaagc tgactacatt tacgtacctg ttgagggtcc ttacaagcct gctcactaca    1500

ggtactgagg aagagacgct cacagtggaa caacgatacg gcggcatgat tgttttgttt    1560

taaactttta ttttgtttag gtagtgtgtt tttattttgt tgggggatat tttgctggaa    1620

agttgaccta aatgtgtttg aataatattt gaattatggt tggggtggtg tcatatgata    1680

ttgtaccaag ttagattcat ttgctttctt gtttctataa aatttgcttc aaggaaacaa    1740

agcatcatgt tttt                                                      1754

<210>29

<211>484

<212>PRT

<213>马铃薯同系物(氨基酸序列)

<400>29

Met Ala Leu Leu Val Glu Lys Thr Thr Ser Gly Arg Glu Tyr Lys Val

1               5                   10                  15

Lys Asp Met Ser Gln Ala Asp Phe Gly Arg Leu Glu Ile Glu Leu Ala

            20                  25                  30

Glu Val Glu Met Pro Gly Leu Met Ala Ser Arg Thr Glu Phe Gly Pro

        35                  40                  45

Ser Gln Pro Phe Lys Gly Ala Lys Ile Thr Gly Ser Leu His Met Thr

    50                  55                  60

Ile Gln Thr Ala Val Leu Ile Glu Thr Leu Thr Ala Leu Gly Ala Glu

65                  70                  75                  80

Val Arg Trp Cys Ser Cys Asn Ile Phe Ser Thr Gln Asp His Ala Ala

                85                  90                  95

Ala Ala Ile Ala Arg Asp Ser Ala Ala Val Phe Ala Trp Lys Gly Glu

            100                 105                 110

Thr Leu Gln Glu Tyr Trp Trp Cys Thr Glu Arg Ala Leu Asp Trp Gly

        115                 120                 125

Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Ile Val Asp Asp Gly Gly Asp Ala Thr

    130                 135                 140

Leu Leu Ile His Glu Gly Val Lys Ala Glu Glu Glu Phe Ala Lys Asn

145                 150                 155                 160

Gly Thr Ile Pro Asp Pro Thr Ser Thr Asp Asn Val Glu Phe Gln Leu

                165                 170                 175

Val Leu Thr Ile Ile Lys Glu Ser Leu Lys Thr Asp Pro Leu Arg Tyr

            180                 185                 190

Thr Lys Met Lys Glu Arg Leu Val Gly Val Ser Glu Glu Thr Thr Thr

        195                 200                 205

Gly Val Lys Arg Leu Tyr Gln Met Gln Ala Asn Gly Thr Leu Leu Phe

    210                 215                 220

Pro Ala Ile Asn Val Asn Asp Ser Val Thr Lys Ser Lys Phe Asp Asn

225                 230                 235                 240

Leu Tyr Gly Cys Arg His Ser Leu Pro Asp Gly Leu Met Arg Ala Thr

                245                 250                 255

Asp Val Met Ile Ala Gly Lys Val Ala Leu Val Ala Gly Tyr Gly Asp

            260                 265                 270

Val Gly Lys Gly Cys Ala Ala Ala Met Lys Gln Ala Gly Ala Arg Val

        275                 280                 285

Ile Val Thr Glu Ile Asp Pro Ile Cys Ala Leu Gln Ala Thr Met Glu

    290                 295                 300

Gly Leu Gln Val Leu Pro Leu Glu Asp Val Val Ser Glu Val Asp Ile

305                 310                 315                 320

Phe Val Thr Thr Thr Gly Asn Lys Asp Ile Ile Met Val Asp His Met

                325                 330                 335

Arg Lys Met Lys Asn Asn Ala Ile Val Cys Asn Ile Gly His Phe Asp

            340                 345                 350

Asn Glu Ile Asp Met His Gly Leu Glu Thr Phe Pro Gly Val Lys Arg

        355                 360                 365

Ile Thr Ile Ser Ser Asn Asp Arg Trp Val Phe Pro Asp Thr Asn Ser

    370                 375                 380

Gly Ile Ile Val Leu Ala Glu Gly Arg Leu Met Asn Leu Gly Cys Ala

385                 390                 395                 400

Thr Gly His Pro Ser Phe Val Met Ser Cys Ser Phe Thr Asn Gln Val

                405                 410                 415

Ile Ala Gln Leu Glu Leu Trp Asn Glu Arg Ser Ser Gly Lys Tyr Glu

            420                 425                 430

Lys Lys Val Tyr Val Leu Pro Lys His Leu Asp Glu Lys Val Ala Ala

        435                 440                 445

Leu His Leu Gly Lys Leu Gly Ala Lys Leu Thr Lys Leu Thr Lys Asp

    450                 455                 460

Gln Ala Asp Tyr Ile Ser Val Pro Val Glu Gly Pro Tyr Lys Pro Ala

465                 470                 475                 480

His Tyr Arg Tyr

<210>30

<211>1738__

<212>DNA

<213>马铃薯同系物(核苷酸序列)

<400>30

aaggaagaag agaaaagctc tcagatctca tctcaaaccc tttcatttct cttatactcg     60

ccttacccat ggctctactc gttgagaaga ccacctctgg ccgcgagtac aaggtgaagg    120

acatgtccca ggcagacttc ggcaggctcg aaatcgagct tgccgaggtt gaaatgcctg    180

gtctcatggc ttcccgtact gaattcggcc cttcacagcc ctttaaaggt gcaaagatca    240

ctggatctct gcatatgact atccaaactg ctgtccttat tgaaacccta actgctttgg    300

gtgctgaagt tagatggtgt tcttgcaaca tcttctcaac tcaggaccat gctgcagcag    360

ccattgcacg tgatagtgct gctgtttttg cctggaaagg tgagactttg caggagtact    420

ggtggtgtac tgagagggca cttgattggg gtccaggtgg tggtcctgat ctgattgttg     480

atgatggagg tgatgctact ctcttgattc atgagggagt taaggcagag gaagagtttg     540

ctaagaatgg gacaatccca gatcctactt ctactgacaa tgttgagttt caacttgtgc     600

ttactattat taaggagagc ttaaagactg atcctttaag gtacactaag atgaaggaga     660

gacttgttgg tgtttctgag gaaactacca ctggtgttaa gaggctttac caaatgcagg     720

ctaatggaac tttgctattc cctgctatca atgttaatga ctctgttacc aagagcaagt     780

ttgacaactt gtatggatgc cgccactcac tgcctgatgg tctcatgagg gctactgatg     840

ttatgattgc cgggaaggtt gctcttgttg ctggttatgg agatgtcggc aagggatgtg     900

ctgctgccat gaaacaagct ggtgcccgtg tgattgtgac tgagattgat ccaatctgtg     960

ctcttcaggc aaccatggaa ggactccagg ttcttcctct tgaggatgtt gtttctgagg    1020

ttgatatctt tgtgaccacc actggtaaca aggacatcat catggttgac cacatgagga    1080

agatgaagaa caatgccatt gtctgcaaca ttggtcactt tgacaatgaa atcgacatgc    1140

atggtcttga gaccttccct ggtgtgaaga ggatcacaat cagctcaaac gacagatggg    1200

tcttcccaga caccaacagt ggcatcattg tcttggccga gggtcgtctc atgaacttgg    1260

gatgtgccac tggacacccc agttttgtga tgtcttgctc tttcactaac caagtcattg    1320

cgcaactcga gttgtggaat gagaggagca gtggcaaata cgagaagaag gtgtacgtct    1380

tgccaaaaca cctcgatgag aaggttgctg cccttcatct tggaaagctc ggagccaagc    1440

tcaccaaact taccaaggat caagctgact acatcagcgt accagttgag ggtccttaca    1500

agcctgctca ctacaggtac tgagggaaga gacactcatg gtggaacaac gatatcacgg    1560

cacgattgtt ttgtttttaa tactttgatt ttgtttaggt agtgtgtttt tattattgtt    1620

gggggcaagt tggcatgttt tgctggcacg ttgcacctaa atgtgtttgc aatcatcatt    1680

cgaattcatg gtgttggggt tgtgtcatct gcatattgta ctcaagcatt catttgca      1738