斑点野生稻的PCR鉴定引物及鉴定方法

摘要

本发明提供了一种斑点野生稻PCR鉴定用引物及方法，所述引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1&2所示。本发明还进一步提供了斑点野生稻鉴定的PCR检测方法，该方法以样品总DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，反应结束后根据琼脂糖电泳判定结果。本发明引物特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度好，为斑点野生稻物种资源的鉴定提供了有效检测方法。

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术，具体地说涉及对斑点野生稻生物资源进行检测用引物及PCR检测方法。

背景技术

野生稻由于长期经受各种灾害和不良环境的自然选择，蕴含大量的有利基因如抗病、抗虫、抗逆及雄性不育等栽培稻不具有或已消失的特异基因，是水稻遗传改良的重要基因源。伴随近十几年来工业的发展，城市化建设的进程，以及环境污染、人口增长等人为因素对野生稻的生存带来了严重的危害，加上物种流失的加剧，主要的野生稻分布面积正在迅速减少，所以保护和鉴定野生稻显得尤为重要。虽然稻属多倍体起源和系统发育关系的基本框架已经形成，但是其物种的分类和鉴定仍非常困难，特别是把形态、地域分布或细胞型考虑在内时就更为严重，在非洲广泛分布的斑点野生稻O.punctata鉴定和利用面临的困难就是很典型的例子。

水稻的分类鉴定和种间亲缘关系的研究多集中于形态学和细胞遗传学的分析研究。近几年来借助于分子生物学手段，如AFLP、RFLP、SSR、RAPD、FISH、GISH等技术，对稻属基因组间的亲缘关系进行了较广泛的研究。但是在口岸物种资源的查验中，这些分子手段都面临着技术含量高、操作复杂、耗时、成本高、不能通用和难于标准化等问题，很难满足实际工作的需要。寻找合适的基因、DNA片段进行比较分析，利用分子标记简单、准确、快捷和不受植物生长周期限制等优势发展合适的分子鉴定体系是比较科学的策略。W.John Kress等认为色素体psbA-trnH基因能够很好的区分陆生植物，特别是开花植物。通过比较全部的烟草和龙葵属植物，以及七个近缘的植物属和从一个植物区系的五十个植物属中抽样的被子植物，提出该基因在区别鉴定植物物种上有巨大的潜力。

目前国内外对于O.punctata的识别仅限于形态上，未见分子检测方法的研究。

本发明应用PCR方法对斑点野生稻的分子检测方法进行研究，通过psbA-trnH序列设计特异引物，建立了对斑点野生稻稳定、高效的鉴定方法、成本低，可根据对扩增产物的普通琼脂糖电泳判定是否有斑点野生稻核酸存在。

发明内容

本发明目的在于提供用于斑点野生稻PCR检测的引物及方法。

本发明通过分析斑点野生稻O.punctata与稻属及其近缘种等禾本科植物叶绿体psbA-trnH基因序列的基础上，设计特异引物，能够快速、准确地对O.punctata进行定性检测。

本发明提供的检测引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和2所示。

以样品总DNA为模板，上述的引物进行PCR扩增，根据PCR扩增产物判定样品是否为斑点野生稻。即检测PCR产物中是否存在118bp的特异性扩增。具体地说，可以利用琼脂糖凝胶电泳进行检测，根据是否存在118bp的特异性条带，来判断样品是否为阳性。

PCR25μL反应体系：样品DNA 1μL(10-50ng)，10×PCR buffer(Mg²⁺free)2.5μL，25mM MgCL2 2μL，10mM dNTPs 2μL，10μMPrimers 1μL/1μL，5U/μL Taq DNA polymerase 0.1μL，ddH₂O 15.4μL。

反应条件：预变性94℃ 4min，再经94℃变性1min，62℃退火1min，72℃延伸1.5min，30循环，最后72℃延伸7min。

可以将本发明引物以及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。

本发明建立了适合口岸应用的简便的检测方法，即直接从进、出境的禾本科类材料上检测斑点野生稻，操作快捷、结果准确，避免了用传统的形态分类学和细胞学方法所产生的耗费时间和易疏漏的缺陷，顺应了当今口岸检测工作的特点。

附图说明

图1是PCR法对斑点野生稻特异性检测实验；

图中，M：DNAMarker DL2000；1，18：斑点野生稻06-120；2：东乡野生稻；3：桂林野生稻；4：江永野生稻；5：药用野生稻05-28；6：宽叶野生稻06-121；7：高杆野生稻05-61；8：乐东野生稻；9：普野广西4084；10：普野临高YD1-49；11：丝优63；12：湘矮早；13：普野07-24；14：粗山羊草Y2265；15：野生二粒小麦D510；16：日本晴；17：稗草；19：长花药野生稻05-51；20：普野琼海YD1-41；21：东方野生稻；22：紧穗野生稻；23：普野37；24：恢复系明恢63；25：新香优80；26：密阳46；27：金优207；28：桂99；29：玉米齐319；30：中国春；31：短柄草BD21；32：水对照。

具体实施方式

下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1引物的设计

根据斑点野生稻psbA-trnH序列，利用软件和Primer 3设计引物，经过多轮筛选，意外发现以下引物的特异性显著优于其它引物，该引物序列为：

正向：5’-CGGCATTTCACGAGTTATGA-3’

反向：5’-TTGCTTCAGCGAGATATTGG-3’。

实施例2总DNA的提取

(1)取0.2～0.3g植物组织，用硅胶保存，剪碎后置研钵中加液氮研成粉末状，移至已灭菌的1.5mL离心管，一般加到离心管的1/3体积。

(2)在离心管中加入已在65℃预热500μLCTAB提取液(20g/LCTAB，1.4M NaCl，0.1M Tris-HCl，20mM EDTA，pH 8.0)混匀，置于65℃水浴锅保温30分钟。

(3)将样品从水浴锅中取出，加入与提取液等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，上下颠倒离心管充分混匀，12000转/分钟离心15分钟。

(4)吸取上清液置于另一已灭菌的1.5mL离心管。

(5)再加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，重复步骤(3)，(4)。

(6)加入等体积或两倍体积的无水乙醇(已在-20℃预冷)，轻轻颠倒离心管混匀，置于-20℃冰箱，放置30分钟。

(7)10000转/分钟离心10分钟，倒去上清液，保留沉淀.此时的沉淀物主要为DNA。

(8)加入400μL70％乙醇，10000转/分钟离心5分钟，收集沉淀。置于37℃或50℃烘箱烘干。(9)加入100μL TE(或者灭菌水)溶解DNA，再加2μLRNA酶(10mg/ml)，37℃保温30分钟。

(10)1.0％琼脂糖电泳检测DNA浓度及质量。

实施例3PCR扩增方法的建立

1、PCR反应体系

以总DNA为模板，进行PCR反应，25μL反应体系中有样品：样品DNA 1μL(10-50ng)，10×PCR buffer(Mg²⁺free)2.5μL，25mMMgCL2 2μL，10mM dNTPs 2μL，10μM Primers 1μL/1μL，5U/μL TaqDNA polymerase 0.1μL，ddH₂O 15.4μL。

2、PCR反应条件

将样品管放入ABI 7900PCR仪后，设置如下条件进行反应：预变性94℃ 4min，再经94℃变性1min，62℃退火1min，72℃延伸1.5min，30循环，最后72℃延伸7min。反应结束后扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳判定结果。

实施例4斑点野生稻PCR方法的特异性确定

以斑点野生稻与稻属及其近缘种等22个禾本科植物总DNA为模板，以水为阴性对照，通过PCR反应结束后琼脂糖凝胶电泳118bp的特异性扩增条带判定阳性结果。

试验结果：

只有斑点野生稻的PCR扩增产物出现阳性扩增，而其它近缘和本科材料和阴性对照均没有扩增信号，结果见图1。

序列表

<110>中国检验检疫科学研究院

<120>斑点野生稻的PCR鉴定引物及鉴定方法

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

cggcatttca cgagttatga    20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ttgcttcagc gagatattgg    20