细胞外超氧化物歧化酶的新用途及其制备方法

摘要

本发明涉及用于预防或者治疗血管发生介导的疾病或者变应性疾病的组合物，所述组合物含有作为活性成分的EC－SOD蛋白或者具有编码所述EC－SOD蛋白的多核苷酸的载体。所述EC－SOD蛋白或者所述具有编码所述EC－SOD蛋白的多核苷酸的载体具有通过抑制诱导血管发生的VEGF和MMP－9的表达从而抑制血管发生的效果。因此，所述EC－SOD蛋白或者所述载体可用于预防或者治疗血管发生介导的疾病。同时，所述EC－SOD蛋白或者所述具有编码所述EC－SOD蛋白的多核苷酸的载体还具有以下作用：抑制引起变应性疾病的Th2细胞的过分化，抑制转录因子(NF－κB)并减少人肥大细胞的脱颗粒化。因此，所述EC－SOD蛋白或所述载体可用于预防或者治疗变应性疾病。另外，本发明的制备EC－SOD蛋白的方法可用于大规模制备具有所述活性的EC－SOD蛋白。因此，本发明的方法可在工业上得到利用。

说明书

技术领域

本发明涉及细胞外超氧化物歧化酶(EC-SOD，extracellular superoxide dismutase)的新用途及其制备方法。更具体而言，本发明涉及 用于预防或治疗血管发生(angiogenesis)介导的疾病或变应性疾病的组 合物，所述组合物含有作为活性成分的EC-SOD蛋白或具有编码所述 EC-SOD蛋白的多核苷酸的载体。

背景技术

超氧化物歧化酶(SOD)通过清除活性氧簇和激活其他抗氧化酶来起 起到保护细胞的作用，目前为止已知的SOD包括含铜原子和锌原子的 Cu/Zn SOD(SOD 1)、含锰原子的Mn SOD(SOD 2)及存在于细胞表面或细 胞外液的EC-SOD。

尤其，EC-SOD和Cu/Zn SOD一样具有铜原子和锌原子，但以C- 端具有肝素结合域为特征。由于EC-SOD具有肝素结合域，因此预测它 可能通过与细胞膜结合对细胞膜起保护作用。根据文献报道，EC-SOD在 血浆及细胞外基质等担当机体防御作用(Marklund et al，Biochem.J.266， 213-219，1990；Su et al.，Am J Respir Cell Mol Biol.，Feb 16(2)，162-70， 1997；Luoma et al.，Thromb.Vasc. Bio.18，157-167，1998)。此外，有报道 称EC-SOD的肝素结合域起核定位信号作用，因为它位于胸腺和睾丸细 胞的细胞核中，从而使基因组DNA免受氧化应激并调节对氧化还原反应 敏感的DNA转录作用(Ookawara T et al.，BBRC，296，54-61，2002)。本发 明的发明人通过韩国专利第10-0676502号公开过EC-SOD通过清除皮肤 细胞内的活性氧簇和抑制表皮细胞的过度增殖，从而对银屑病等皮肤病的 治疗具有一定效果。

同时，血管发生是指从已有的血管产生新的毛细血管的过程。通常血 管发生只在包括胚胎发育期、伤口愈合期和女性生殖周期在内的一些特定 情形下才出现，而在正常情形下几乎不会出现。但是血管发生不能正确调 节时，可引发诸如癌症等疾病。

上述血管发生过程由以下几个步骤组成：肿瘤细胞因子、血管内皮生 长因子(VEGF)及碱性成纤维生长因子(bFGF)刺激内皮细胞生长；通过基 质金属蛋白酶(MMP)降解细胞外基质蛋白质；内皮细胞迁移，所述迁移 由细胞膜黏附分子介导；内皮细胞分化及管形成(Bussolino，F.et al.， Trends Biochem.Sci.22：251-256，1997；Kuwano，M.et al.，Intern.Med. 40：565-572，2001；Risau，W.Angiogenesis and endothelial cell function. Arzneimittelforschung 44：416-417，1994)。因此，已经提出将对上述这些 过程的抑制作为治疗血管发生介导疾病(包括癌症及其他人类疾病)的新 的治疗战略。为此，已开发出多种多样的血管发生抑制剂。上述抑制剂为 天然或合成的物质，包括蛋白酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂，趋化因子、 白细胞介素及基质蛋白质的蛋白分解片段(Abedi，H.et.al.，J.Biol.Chem. 272：15442-15451，1997；Cao，Y.，Int.J.Biochem.Cell Biol.33：357-369， 2001；Fong，T.A et al.，Cancer Res.59：99-106，1999；Kwon，H.J.et al.， Acalycigorgia inermis.J.Microbiol.Biotechnol.11：656-662，2001.)。上述 抗血管发生分子影响到多个过程，包括抑制内皮细胞的增殖、迁移、蛋白 酶活性及管形成，以及对细胞凋亡的诱导(Folkman，J.et.al.，Semin. Cancer Biol.3：89-96，1992；Kishi，K.et al.，Nippon Rinsho 58：1747-1762， 2000；Marme，D.，Onkologie 1：1-5，2001)。上述许多分子的抗血管发生功 能在体内外都有较好的研究，并且有几种抗血管生成药物目前正在临床试 验中测试(Deplanque，G.et.al.，Eur.J.Cancer 36：1713-1724，2000； Liekens，et.al.，Biochem.Pharmacol.61：253-270，2001；Mross，K.，Drug Resist.Updat.3：223-235，2000)。

虽然活性氧簇被报道对血管发生起主要调节作用(Jolanta Grzenkowicz-Wydra，et.al.，Mol Cell Biochem.，264(1-2)：169-81，2004)，但 是关于清除活性氧簇的SOD和血管发生之间的关系并未得到充分研究。 最近有报道指出，具有SOD以及铜原子和锌原子的Cu/Zn SOD(SOD 1) 的过表达会刺激血管发生，因此抑制SOD1则可抑制血管发生(Jolanta Grzenkowicz-Wydra，et.al.，Mol Cell Biochem.，264(1-2)：169-81，2004)。此 外，还有报道指出，SOD1的抑制剂ATN-224抑制血管发生，因此可作 为抗癌剂使用，并且目前正在进行2期临床试验(Juarez et al.Clin Cancer Res.，12：4974-4982，2006)。但是对于EC-SOD和血管发生之间的关系并 未见报道。

同时，随着工业的发展，环境污染、新合成物质的增加以及居住环境 的变化所引起的致变应性因素随之增加，因此受到哮喘、过敏等疾病困扰 的人数逐渐增加。机体对于侵入机体的异物产生特异的抵抗的功能称为免 疫。变应反应是一种超敏免疫反应，典型的变应性疾病包括特应性皮炎、 支气管哮喘及花粉症。变应反应引起的临床症状大致分为初期的特异性免 疫反应和后期的炎症反应。上述免疫反应主要由肥大细胞介导，已知肥大 细胞广泛分布于身体的各器官，包括皮肤、呼吸器官、胃肠粘膜、脑、淋 巴管周围和血管周围，并且已知会引起变应反应。以活化肥大细胞著称的 介体(mediator)包括与位于细胞膜中的高亲和力免疫球蛋白E(IgE) 受体(FcεRI)结合的IgE抗体、化合物48/80等。IgE抗体引起的肥大 细胞的活化机制如下。

结合于IgE受体的IgE抗体与抗原形成桥联时，通过磷脂酶C、蛋 白磷酸酶C和钙离子的作用，储藏在肥大细胞颗粒的物质如组胺、硫酸 软骨素、肝素及蛋白酶等得以释放，由此介导上述初期反应。在引起出现 在变应反应初期的临床症状的化学物质(包括组胺)中，组胺的影响最大。 即，在变应反应初期，主要表达组胺，其所引起的临床症状为血管舒张、 浮肿等。

目前，多使用抗组胺药物或类固醇类药物来治疗变应性疾病。但是这 些药物的效果只是一时的，而且副作用严重的情况也颇为多见。因此，迫 切地需要开发出一种新的物质，该物质既对激增的变应性疾病具有预防及 治疗作用，且副作用又小且效果持久。但EC-SOD是否对变应性疾病具 有治疗效果还不为人知。

同时，即使EC-SOD具有多样的活性，如果开发不出大量生产 ES-SOD的方法，其也不能在工业中得到有效利用。但是，到目前为止已 开发的蛋白质的大量生产方法包括用表达载体转化宿主细胞例如大肠杆 菌细胞，并诱导蛋白在转化的细胞中表达，蛋白质的大量生产往往导致包 含体的形成，因而存在蛋白质原来的活性消失或者减少的问题。

本发明的发明人已对EC-SOD蛋白进行了研究，结果发现EC-SOD 表现出抑制血管生成所致疾病或者变应性疾病的活性。基于这一发现，本 发明人开发出一种制备具有上述活性的EC-SOD蛋白的方法，从而完成 了本发明。

发明内容

技术问题

因此，为了实现这一目的，本发明提供了一种用于预防或者治疗血管 发生介导的疾病的组合物，所述组合物含有作为活性成分的EC-SOD蛋 白。

另一方面，本发明还提供了一种用于预防或者治疗血管发生介导的疾 病的组合物，所述组合物含有作为活性成分的具有编码EC-SOD蛋白的 多核苷酸的载体。

又一方面，本发明提供了一种用于预防或者治疗变应性疾病的组合 物，所述组合物含有作为活性成分的EC-SOD蛋白。

又一方面，本发明提供了一种用于预防或者治疗变应性疾病的组合 物，所述组合物含有作为活性成分的具有编码EC-SOD蛋白的多核苷酸 的载体。

又另一方面，本发明提供了一种制备EC-SOD蛋白的方法。

技术方案

为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种用于预防或者治疗血 管发生介导的疾病的组合物，所述组合物含有作为活性成分的EC-SOD 蛋白。

另一方面，本发明提供了一种用于预防或者治疗血管发生介导的疾病 的组合物，所述组合物含有作为活性成分的具有编码EC-SOD蛋白的多 核苷酸的载体。

又一方面，本发明提供了一种用于预防或者治疗变应性疾病的组合 物，所述组合物含有作为活性成分的EC-SOD蛋白。

又一方面，本发明提供了一种用于预防或者治疗变应性疾病的组合 物，所述组合物含有作为活性成分的具有编码所述EC-SOD蛋白的多核 苷酸的载体。

又另一方面，本发明提供了一种制备EC-SOD蛋白的方法，所述方 法包括以下步骤：(a)将编码所述EC-SOD蛋白的多核苷酸克隆到表达 载体中；(b)将上述表达载体导入到宿主细胞中以转化所述宿主细胞；(c) 培养转化得到的宿主细胞以在所述细胞中表达EC-SOD蛋白；(d)收集 表达的EC-SOD的包含体；并(e)溶解所述包含体并诱导所述包含体重 新折叠(refold)。

具体实施方式

下面详细说明本发明。

本发明中所使用术语“表达载体”描述的是能够在适当的宿主细胞中 表达目标蛋白质或目标RNA的载体，并指含有与基因插入物有效连接的 必需调节元件的遗传构建体。

本发明所用术语“有效连接”是指核苷酸表达调控序列和编码目标蛋 白的核苷酸序列实现总体功能方式的功能性连接。例如，启动子和编码蛋 白或RNA的核苷酸序列连接在一起，从而使其能影响所述编码的核苷酸 序列的表达。与重组载体的有效连接可利用本领域熟知的基因重组技术制 备，并且位点特异性DNA剪切及连接可利用广为本技术领域熟知的酶进 行。

本发明提供了一种用于预防或者治疗血管生成疾病的组合物，所述组 合物含有作为活性成分的EC-SOD蛋白。

上述EC-SOD蛋白优选为天然或重组EC-SOD蛋白，但并不限于此。 上述天然EC-SOD蛋白优选来源于小鼠或人，更优选来源于人，但并不 限于此。上述天然EC-SOD蛋白优选具有选自SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5的氨基酸序列，最优选具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列，但并不 限于此。同时，对上述重组EC-SOD蛋白没有特别限制，只要它是由上 述天然EC-SOD制备从而维持了其活性即可。优选地，所述重组EC-SOD 蛋白具有氨基酸序列。

另一方面，本发明提供了一种用于预防或者治疗血管发生介导的疾病 的组合物，所述组合物含有作为活性成分的具有编码上述EC-SOD蛋白 的多核苷酸的载体。

编码上述EC-SOD蛋白的多核苷酸是指能够编码上述天然EC-SOD 蛋白或重组EC-SOD蛋白的多核苷酸，优选具有选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：6的碱基序列，但是并不限于此。

在本发明的一个实施例中，通过公知方法来制备过表达小鼠EC-SOD 的小鼠(参见测试实施例1)，并将该小鼠用UVB照射，然后将其与野生 型小鼠进行组织形态变化的比较。结果观察到，野生型小鼠由于UVB照 射诱导了血管发生，但是EC-SOD过表达小鼠中由于UVB照射引起的血 管发生明显受到抑制(参见实施例2-1)。

在本发明的另一实施例中，上述EC-SOD过表达小鼠中由于UV光 照射引起的血管内皮生长因子(VEGF)及MMP-9的表达水平通过蛋白质 印迹(实施例2-2)、免疫组织化学法(实施例2-3)及酶谱法(zymography) (实施例2-4)来检测。结果观察到，由于紫外线照射野生型小鼠中VEGF 及MMP-9的表达增加，但是在EC-SOD过表达小鼠中VEGF及 MMP-9的表达受到显著地抑制。从上述实验结果可知，EC-SOD能够抑 制诱导血管发生的VEGF的表达，且抑制调节血管发生的MMP-9的表 达，从而抑制血管发生。

在本发明的其他实施例中，将去除肝素结合域的重组EC-SOD在大 肠杆菌中表达，然后将其从此大肠杆菌株中分离出来，从而生产出经过重 新折叠和纯化的EC-SOD蛋白(参照实施例1)，并检测所得蛋白质是否 会抑制血管发生(参照实施例3)。结果发现，UV光照射诱发VEGF表 达，但是用上述重组EC-SOD蛋白处理导致VEGF的表达受到抑制。因 此上述EC-SOD蛋白或其中插入有编码该EC-SOD蛋白的多核苷酸的载 体可有效用于预防或者治疗血管发生介导的疾病。上述血管发生介导的疾 病包括所有由VEGF(血管内皮生长因子)表达及MMP-9(基质金属蛋 白酶9)表达诱发的疾病，其优选实例包括例如癌症、糖尿病、类风湿性 关节炎、动脉硬化、血管瘤、血管纤维瘤、糖尿病性视网膜病、早熟儿视 网膜病、新生血管性青光眼、血管生成引起的角膜疾病、退化斑 (degenerative spot)、黄斑变性(macular degenerative)、翼状胬肉、视 网膜变性、晶状体后纤维增生症(retrolental fioplasia)、颗粒性结膜炎、 毛细血管扩张、化脓性肉芽肿及痤疮等，但不限于此(Ophthalmol 102， 1261-1262，1995；J Am Acad Derm 34(3)：486-497，1996；Circultion 93(4)：632-682，1996；Cell 86：353-364，1996)。

另一方面，本发明提供了一种用于预防或者治疗变应性疾病的组合 物，所述组合物含有作为活性成分的EC-SOD蛋白。

如上所述，EC-SOD蛋白是指天然或重组EC-SOD蛋白，但并不限 于此。上述天然EC-SOD蛋白优选来源于小鼠或人，更优选来源于人， 但并不限于此。上述天然EC-SOD蛋白优选选自具有SEQ ID NO：3及 SEQ ID NO：5的氨基酸序列，最优选具有SEQ ID NO：3氨基酸序列， 但并不限于此。同时，对上述重组EC-SOD蛋白没有特别限制，只要它 是由上述天然EC-SOD蛋白经重组技术制备从而维持了其活性即可。优 选地，所述重组EC-SOD蛋白具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

另一方面，本发明提供了一种用于预防或者治疗变应性疾病的组合 物，所述组合物含有作为活性成分的其中插入有编码所述EC-SOD蛋白 的多核苷酸的载体。

如上所述，编码上述EC-SOD蛋白的多核苷酸是指编码上述天然 EC-SOD蛋白或重组EC-SOD蛋白的多核苷酸，优选具有选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：6的碱基序列，但并不限于此。

在本发明的一个实施例中，分析了重组EC-SOD蛋白对T细胞的增 殖及分化的影响。结果发现，上述重组EC-SOD诱导了T细胞中Th1细 胞因子IFN-γ的形成，并抑制了Th2细胞因子IL-4的形成。这表明重组 EC-SOD蛋白对T细胞的分化具有影响，并表明它可阻断诱发变应性疾 病的Th2细胞的过分化并诱导Th2细胞分化为Th1细胞，因而可有利地 用于变应性疾病的治疗或预防(参照实施例4)。

在本发明的另一个实施例中，检测了人天然蛋白EC-SOD对T细胞 分化的影响。结果发现，上述EC-SOD蛋白也能够阻断诱发变应性疾病 的Th2细胞的过分化并诱导分化为Th1细胞(参照实施例5)。

在本发明另一实施例中，检测了重组EC-SOD蛋白是否具有抑制转 录因子活性的效果。结果发现，重组EC-SOD蛋白能够抑制NF-κB的异 常活性(参照实施例6)，并具有减少人肥大细胞的脱颗粒的效果。因此， 考虑到以下事实，本发明重组EC-SOD蛋白可有利地用于变应性疾病的 预防或治疗(参照实施例7)：储藏在肥大细胞内的介体如组胺，因肥大 细胞的脱颗粒而得以释放，从而引起炎症反应如变应。

因此，上述EC-SOD蛋白或其中插入有编码所述蛋白的多核苷酸的 载体可用于变应性疾病的预防或者治疗用组合物中。上述变应性疾病选自 变应性哮喘、变应性鼻炎、变应性中耳炎、变应性休克、变应性皮肤病、 特应性皮炎、银屑病、接触性变应性皮肤炎及荨麻疹。

所述本发明组合物中所包含的EC-SOD蛋白还包括与之具有同等生 理活性的蛋白质。所述具有等同生理活性的蛋白质包括EC-SOD蛋白的 功能等同物及功能衍生物。

本发明的术语“功能等同物”是指与SEQ ID NO：3的EC-SOD具有等 同生理活性的多肽。

术语“等同生理活性”是指抑制血管发生或变应的活性。上述功能等同 物可以为与氨基酸序列SEQ ID NO：3具有至少70％、优选至少80％、 更优选至少90％的氨基酸序列同源性的多肽。术语功能等同物是指这样 的肽，即所述肽与通过对SEQ ID NO：3的添加、置换或缺失处理所得的 肽具有至少70％、优选具有至少80％，更优选具有90％例如70％、71％、 72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、 83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％的氨基酸序列同源性(即 同一性)，且展现出与多肽SEQ ID NO：3基本上相同的生理活性。本说 明书中序列同源性及同一性被定义为：在比对候选序列和氨基酸序列 SEQ ID NO：3并引入空位后，所述候选序列中与氨基酸序列SEQ ID NO： 3相同的氨基酸残基百分比。必要时，为了获得最大百分比的序列同一性， 不考虑将任何保守置换作为序列同一性的一部分。氨基酸序列SEQ ID NO：3的N-端、C-端或内部的延伸、缺失或插入，由于影响序列的同一 性或同源性，因而没有哪一个应被构建。因而，序列同一性可通过通常用 于比较两个多肽的氨基酸位置的相似度的标准标准来确定。使用诸如 BLAST或FASTA的计算机软件，可比对两个多肽从而将其各自的氨基 酸进行最佳匹配(沿着一个或两个序列的全长或沿着一个或两个序列的预 定部分)。上述程序提供了默认开放罚分(default opening penalty)和默认 空位罚分(default gap penalty)，以及得分矩阵如PAM 250(标准得分矩阵； Dayhoff et al.，in Atlas of Protein Sequence and Structure，vol 5，supp.3， 1978)。例如，同一性百分比可计算为：相同匹配物的总数乘以100，再 除以匹配范围内较长序列的长度与为比对这两段序列而引入较长序列中 的空位数目之和。本发明功能等同物的范围包括通过以下方式所获得的多 肽衍生物：对所述多肽的一部分化学结构进行修饰并维持该多肽的基本构 架及生理活性。例如，这包括为改变本发明的多肽的稳定性、储藏性、挥 发性或溶解度的结构修饰。

另外，本发明组合物的多核苷酸序列包括DNA、cDNA及RNA序列。 优选地，上述多核苷酸可包括选自SEQ ID NO：2、4及6的序列。本发 明组合物可含有作为活性成分的其中具有所述多核苷酸序列的质粒或者 表达载体例如病毒载体。本发明表达载体可含有表达调控序列，藉此所述 EC-SOD的EC-SOD蛋白和cDNA可被表达。上述多核苷酸可分离自自 然界或者根据本领域公知的方法制备。

上述表达调控序列(expression control sequence)是指某些宿主细胞 中与编码序列有效连接的该编码序列的表达必需的DNA序列。上述的表 达调控序列包括为实施转录的启动子、为调控上述转录的某些操纵子序 列、编码相关mRNA核糖体结合位点的序列及终止转录和翻译的序列。 例如，适合原核生物的调控序列可包括启动子、操纵子及核糖体结合位点。 调控序列可包括启动子、多腺苷化信号序列及增强子。

插入上述表达载体之后，通过感染、转染或转导等本领域公知的方法， 可将其以表型形式引入靶细胞。

利用质粒表达载体的基因引入方法是直接将质粒DNA引入哺乳动物 细胞的方法，该方法是受FDA认可的可用于人类的方法(Nabel，E.G.，et al.，Science，249：1285-1288，1990)。与病毒载体不同，质粒DNA具有均质 纯化(even purification)方面的优点。本发明中能够使用的表达质粒包 括本领域所使用的哺乳动物表达质粒。例如，pRK5(欧洲专利第307,247 号)、pSV16B(国际专利公开号第WO 91/08291号)及 pVL1392(PharMingen)，但并不限于此。通过以下方法(但不限于此)， 包含上述核酸的质粒表达载体能够被引入靶细胞中：例如瞬时转染、显微 注射、转导、细胞融合、磷酸钙沉淀、脂质体介导的转染、DEAE-葡聚 糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、基因枪及其他本领域熟知的 方法(Wu et al.，J.Bio.Chem.，267：963-967，1992；Wu and Wu，J.Bio. Chem.，263：14621-14624，1988)。

另外，包含上述多核苷酸的病毒载体可包括逆转录病毒、腺病毒、疱 疹病毒、禽痘病毒及慢病毒等，但并不限于此。上述逆转录病毒载体的所 有病毒基因均被去除或修饰，因而所述载体的非病毒蛋白可由被感染细胞 产生。用于基因疗法的逆转录病毒载体的主要优点是将大量基因转移到克 隆细胞内、专门整合转移到细胞DNA的基因以及预防基因转化后的额外 感染(Miller，A.D.，Nature，357：455-460，1992)。通过FDA认证的逆转录病 毒载体利用PA317兼嗜性逆转录病毒包装细胞制备得到(Miller，A.D.and Buttimore，C.，Molec.Cell Biol.，6：2895-2902，1986)。非逆转录病毒载体有 如上所述的腺病毒(Rosenfeld et al.，Cell，68：143-155，1992；Jaffe et al.， Nature Genetics，1：372-378，1992；Lemarchand et al.，Proc.Natl.Acad. Sci.USA，89：6482-6486，1992)。腺病毒的主要优点是可搬运大分子DNA 片段(36kb)，并可以非常高的滴度转染非克隆细胞。此外，疱疹病毒也 可用于人类基因疗法(Wolfe，J.H.，et al.，Nature Genetics，1：379-384， 1992)。慢病毒为逆转录病毒的一种，它是从二十世纪后期通过对HIV骨 架进行修饰开发得到的。与已有的逆转录病毒载体不同，慢病毒不仅在分 裂细胞中更为有效，在非分裂细胞中也更为有效，这是由于其活性不受细 胞周期的影响。另外，即便是在分裂缓慢的细胞例如造血干细胞中，慢病 毒也比其他病毒载体更为有效，因而在基因治疗领域，人们正在利用造血 肝细胞和角化细胞进行着将慢病毒作为基因转移载体的研究。此外，本领 域公知的相关病毒载体也可用于本发明。

本文所用术语“可药用”是指生理学上所允许，并在给予人体时通常不 会引起胃肠障碍和眩晕或其相似反应。

可包含可药用载体例如胃肠外或口服制剂用载体。胃肠外制剂用载体 可包括乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸。此外，胃肠外制 剂用载体可包括水、油、盐水、水性葡萄糖和乙二醇，以及稳定剂及防腐 剂。稳定剂的实例有亚硫酸氢钠、亚硫酸钠和抗坏血酸等抗氧化剂。防腐 剂的实例有苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯及氯丁醇。 可药用载体的列表公开于Remington′s Pharmaceutical Sciences，19th ed.， Mack Publishing Company，Easton，PA，1995。

本发明的蛋白或其中插入有编码所述蛋白的多核苷酸的载体可通过 任何本领域公知的方法与所述可药用载体混合，制成各口服或胃肠外制 剂。同时，本发明的肽可通过任何本领域公知的方法通过各种途径给药。 即，它可通过口服或者胃肠外途径给药。等张溶液或悬液等注射制剂及软 膏剂是理想的胃肠外制剂。注射制剂可使用相关的分散剂、湿润剂或助悬 剂通过任何本领域公知的方法来制备。例如，可通过将组合物的各组分溶 解于盐水或缓冲液中，从而将其制为注射制剂。此外，对于口服给药，可 将本发明的组合物制成粉剂、颗粒剂、片剂、丸剂及胶囊剂等形式，但并 不限于此，除了活性成分之外，这些制剂还可以含有稀释剂(例如乳糖、 葡萄糖、蔗糖、甘露醇、纤维素及/或甘氨酸)、润滑剂(例如二氧化硅、 滑石、硬脂酸及其镁盐或者钙盐及/或乙二醇)。在各种制剂中，片剂还可 以包含诸如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤 维素钠及/或聚乙烯吡咯烷酮等结合剂，根据情况还可包含如淀粉、琼脂 或海藻酸或其钠盐等崩解剂、非均匀混合物及/或吸收剂、着色剂、香味 剂及甜味剂等。上述组合物可通过混合、颗粒化或包衣等方法制备。

本发明的药物组合物可通过各种途径，根据任何生物技术、任何本领 域公知的方法给药，但不限于此。也就是说，它可通过口服、静脉内、肌 内、动脉内、骨髓内、硬膜内、心内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、胃肠 道、胃肠外、舌下或直肠给药。

优选地，可通过皮下、静脉内、肌内、关节内、滑囊内、胸骨内、硬 膜下、病灶内及头盖骨内注射或输注胃肠外给药。例如，注射制剂形式的 本发明组合物可通过用4-6mm注射器注入到皮肤下层或用30号注射针 轻微穿刺该皮肤即中胚层疗法(Messo therapy)给药，从而给予一定量 的制剂。另外，软膏剂形式的本发明药物组合物可通过直接涂在皮肤上的 方法来给药。上述“经皮给药”是指将组合物在局部皮肤给药，使组合物中 含有的活性成分转移到皮肤内。尤其，优选地，以本发明的EC-SOD蛋 白为活性成分的组合物应直接给予皮肤。此外，本发明还可以通过与蛋白 质转移有关的生物技术的方法给药。

上述本发明的组合物可以有效预防疾病的量给予患者。通常一天的有 效量可以为约0.0001至100mg/kg体重。优选为0.01至1mg/kg体重。本 发明的组合物的给药量可根据各种因素作出合适的决定，例如除了给药时 间和给药途径外，还有有待治疗受试者的年龄、体重、健康状况、性别、 疾病严重程度、饮食和排泄情况。

此外，本发明还提供用于制备EC-SOD蛋白的方法，所述方法包括 以下步骤：

(a)将编码EC-SOD蛋白的多核苷酸克隆到表达载体；

(b)将上述表达载体导入到宿主细胞中，从而转化宿主细胞；

(c)培养上述转化的宿主细胞从而表达EC-SOD蛋白；

(d)收集表达的EC-SOD蛋白的包含体；及

(e)溶解上述包含体，并诱导所述EC-SOD蛋白重新折叠。

将编码EC-SOD蛋白的多核苷酸克隆到表达载体的步骤(a)可通过 利用本领域公知的常规重组DNA技术来实现。上述编码EC-SOD的多核 苷酸是指能够编码天然EC-SOD蛋白或重组EC-SOD蛋白的多核苷酸， 优选为具有选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：6的碱基 序列，但并不限于此。上述多核苷酸可使用适当的启动子通过PCR扩增 来制备。或者，也可通过本领域公知的标准方法，例如使用自动DNA合 成仪(Biosearch或Applied Biosystems所销售的)来合成DNA序列。 表达载体可使用本领域中通常使用的表达载体，并可根据宿主细胞来作出 适当的选择。例如宿主细胞为大肠杆菌细胞时，可使用pET28a载体 (Novagene，美国)。本发明的制备方法旨在大量表达和生产EC-SOD，因 此可对任何表达载体进行适当选择和使用，只要它可以实现这一目的。

本发明的载体包括质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体及病毒载体等， 但并不限于此。

适当的表达载体除包含启动子、操纵子、起始密码子、终止密码子、 多腺苷化信号及增强子(刺激基因)等表达调控序列之外，还包含膜打靶 序列、分泌信号序列、前导序列，并可根据目的制备。本发明的启动子可 以是组成型(constitutive)或诱导型(inducible)。另外，表达载体还包含 筛选含有载体的宿主细胞的筛选标记，并且表达载体可复制时可包含复制 起点。

将表达载体导入到宿主细胞中从而转化宿主细胞的步骤(b)包括将 核酸导入到宿主细胞中的任何方法，可通过本领域技术人员公知的转化技 术来实现。优选地，所述技术包括微弹轰击(microprojectile bombardment)、电穿孔、磷酸钙沉淀、氯化钙沉淀、PEG介导的融合、 显微注射法及脂质体介导法等，但并不限于此。

此时，宿主细胞可为原核或真核细胞。但是，优选地，所述宿主细胞 可包括如大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、链霉 菌(Streptomyces)、假单胞菌(Pseudomonas)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)或葡萄球菌(Staphylococcus)等原核宿主细胞，真菌(例如曲霉菌 (Aspergillus)、酵母(例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、粗糙链孢菌 (Neurospora crassa))等低等真核细胞，来源于昆虫细胞、植物细胞、哺 乳动物细胞等高等真核细胞，但并不限于此。更优选地，本发明可使用大 肠杆菌作为宿主细胞。

培养所述转化的宿主细胞从而表达EC-SOD蛋白的步骤(c)包括在 转化的宿主细胞中表达EC-SOD蛋白所需的适合的培养基中和条件下培 养所述细胞。培养上述转化的细胞从而在该细胞中表达蛋白的方法是本领 域公知的，例如，可通过下述方法诱导蛋白表达：将转化细胞接种到适合 细胞生长的培养基，预培养所述细胞，将此预培养细胞接种到培养基中， 然后在适当条件下培养所述细胞。

上述(d)步骤中的收集包含体可使用分离和收集不溶性包含体的公知 的方法进行，例如，通过离心从细胞沉淀物中收集包含体。

上述(e)步骤中的溶解包含体并诱导该包含体重新折叠可通过本领域 公知的任何常规方法进行。例如，可通过下述方法来进行：将该包含体溶 解于含有蛋白变性剂的缓冲溶液中，将该溶液吸附于金属亲和树脂柱，并 在降低变性剂的浓度下诱导所述包含体重新折叠。

例如，溶解上述包含体并诱导所述包含体重新折叠可通过如下方法进 行：将所述包含体溶解于含作为变性剂的8M脲(urea)的Tris缓冲溶液(8M 脲，50mM Tris-Cl，100mM NaCl)，将所述溶液吸附到填充金属亲和性树 脂的柱，并用含1M脲的Tris缓冲溶液给予柱以浓度梯度，逐渐去除脲， 从而诱导所述包含体重新折叠。然后，可通过如下方法获得纯的重新折叠 的蛋白：将与上述柱吸附性强的洗脱缓冲溶液或PH值低(一般为4以下) 的洗脱缓冲溶液从上至下流过该柱，从而从柱的下部流出。例如，纯的重 新折叠的蛋白可通过如下方法获得：将含有咪唑(一般为1M)的与金属 亲和性层析柱的吸附性强的洗脱缓冲溶液从上至下流过上述柱，从而从柱 的下部流出。为了提高蛋白产量，优选以这样一种方式来将洗脱缓冲溶液 投入到柱内，即其浓度随着流过时间逐渐增加，即所述溶液具有一个浓度 梯度。

本发明的EC-SOD蛋白的制备方法还可以包括步骤(f)：利用凝胶过 滤柱分离、纯化。之后可根据指定用途进行各种分离和纯化方法，包括另 外的纯化、浓缩和溶剂交换。例如，可对所得到的EC-SOD蛋白单独或 者联合进行诸如盐析(硫酸铵沉淀及磷酸钠沉淀)、溶剂沉淀(使用丙酮、 乙醇等的蛋白级分沉淀法)、透析、凝胶过滤、离子交换、离子交换层析、 反相柱层析及亲和层析等技术的处理。

步骤(f)：利用凝胶过滤分离和纯化EC-SOD

本发明使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域公知的，记载 在下述文献(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory： Cold Spring Harbor，NY(1989)；by Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.and Enquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1984)；and by Ausubel，F.M.et al.， Current Protocols inMolecular Biology，published by Greene Publishing Assoc.and Wiley-lnterscience(1987))。

如上所述，其中插入有编码所述EC-SOD蛋白的多核苷酸的载体以 有效的量给予有需要的个体，从而预防或者治疗血管发生引起的疾病或变 应性疾病。此外，所述载体也可用于制备针对血管发生介导的疾病或变应 性疾病的治疗剂。

发明效果

如上所述，EC-SOD蛋白或具有编码所述EC-SOD蛋白的多核苷酸 的载体可有效抑制诱导血管发生的VEGF及MMP-9的表达从而抑制血 管发生。因此，所述EC-SOD蛋白或所述载体可用于预防或者治疗血管 发生介导的疾病。同时所述EC-SOD蛋白或所述具有编码所述EC-SOD 蛋白的多核苷酸的载体还可有效抑制诱发变应性疾病的Th2细胞的过分 化、抑制转录因子(NF-κB)并减少人肥大细胞的脱颗粒化。因而，所述 EC-SOD蛋白或所述载体可用于变应性疾病的预防或者治疗。且本发明的 EC-SOD蛋白制备方法可用于大规模制备具有上述活性的EC-SOD蛋白。 因此，本发明的方法可在工业上得到利用。

附图说明

图1是表示对本发明的重组EC-SOD蛋白进行快速蛋白纯化液相色 谱的结果的谱图((A：线性平衡区间，B：上样区间，C：柱洗涤区间，D：重新折 叠区间，E：重新折叠平衡区间，F：洗脱区间，G：柱洗涤区间，X轴：时间及 体积(小时：分钟：秒，mL)，Y轴：UV密度(单位))。

图2是考马斯蓝蛋白染色的照片，示出本发明重新折叠及纯化的重组 EC-SOD蛋白的SDS-PAGE结果((M：分子量大小标记物，A：用8M脲缓 冲溶液洗脱的包含体(重新折叠纯化之前)，B：没有吸附到柱而被洗脱的 包含体杂质，C：重新折叠纯化后的洗脱的EC-SOD，D：脱盐纯化后超滤浓 缩的EC-SOD)。

图3是利用抗-EC-SOD蛋白抗体将重组EC-SOD蛋白进行蛋白印迹 的结果(SM：大小标记物，1：对照组(HaCaT人类EC-SOD)，2：本发明 的重组EC-SOD蛋白)。

图4是纯化步骤过程中EC-SOD活性的图(209FT：纯化过程中被洗 脱而没有被吸附的样本，209E1：通过金属亲和层析重新折叠的初次纯化 的重组蛋白EC-SOD蛋白，209E2：凝胶-过滤柱分离、纯化的重组 EC-SOD蛋白)。

图5是示出HaCaT细胞中的重组EC-SOD蛋白的活性被 UVB诱发的ROS抑制的照片(UVB：仅UVB照射，EC-SOD+UVB： UVB照射和EC-SOD处理)。

图6是示出紫外线照射致使小鼠皮肤发生形态变化的照片(A：野生 型小鼠，B：EC-SOD过表达小鼠，C：UVB照射的野生型小鼠，D：UV照射 的EC-SOD过表达小鼠)。

图7是UV照射小鼠组织中的VEGF表达的蛋白印迹结果。肌动蛋 白作为内参(WT：野生型小鼠，TG：EC-SOD过表达小鼠)。

图8是示出通过使用免疫组织化学法分析UV照射的小鼠的 VEGF表达情况的照片(A：野生型小鼠，B：EC-SOD过表达小鼠，C：UV 照射的野生型小鼠，D：UV照射的EC-SOD过表达小鼠)。

图9是UV照射的小鼠的MMP-9的表达情况的酶谱图(泳道1：野生 型小鼠，泳道2：EC-SOD过表达小鼠，泳道3：UV照射的野生型小鼠， 泳道4：UV照射的EC-SOD过表达小鼠)。

图10是UV照射的角质形成细胞经本发明重组EC-SOD处理后，通 过免疫组织化学法所示其VEGF表达情况的照片(A：对照组，B：UVB照 射，C：重组EC-SOD处理+UVB照射，D：重组EC-SOD处理)。

图11是确定经过重组EC-SOD蛋白处理是否对T细胞的增殖有影响 的结果(Neg：阴性对照)。

图12是通过鉴定IL-4的分泌水平来确定经过重组EC-SOD蛋白处理 是否对T细胞的分化有影响的结果(neg.：阴性对照，-：只用抗原(Ova肽) 处理，p：同时用抗原(Ova肽)和含有EC-SOD的PBS处理，NB：同时用 抗原(Ova 肽)和含有EC-SOD的硼酸钠处理)。

图13是通过鉴定IL-4和IFN-γ的分泌水平来确定经重组EC-SOD 蛋白处理是否对T细胞的分化有影响的结果(neg.：阴性对照，-：只用抗原 (Ova肽)处理)。

图14是将Ova蛋白和免疫辅助剂CFA(完全弗氏佐剂)给予过表达人 类EC-SOD蛋白的小鼠时，EC-SOD对细胞增殖及细胞因子的生成的影 响的结果。

图15是将Ova蛋白和免疫辅助剂Alum(氢氧化铝)给予过表达人类 EC-SOD蛋白的小鼠时，EC-SOD对细胞增殖及细胞因子的生成的影响的 结果。

图16是重组EC-SOD蛋白对NF-κB抑制的影响结果(对照：EC-SOD 转化但未经UV照射的HaCaT细胞，UVB：UVB照射(100J/m²)的 HaCaT细胞，EC-SOD/UVB：经EC-SOD蛋白和UVB照射(100J/m²) 处理的HaCaT细胞)。

图17是示出重组EC-SOD蛋白对肥大细胞脱颗粒的抑制效果图(A) 及其显微照片(B)(对照：未经处理的人类肥大细胞组，EC-SOD：EC-SOD 处理的组，A+P：细胞内钙浓度高的组，A+P+EC-SOD：事先用EC-SOD 处理且细胞内钙浓度高的组)。

具体实施方式

以下，根据实施例详细说明本发明。然而，应理解，提供这些实施例仅 为说明，并且不能将其理解为是对本发明范围的限制。

试验例1：制备过表达EC-SOD的小鼠

首先，按照如下方法制备过表达小鼠EC-SOD的小鼠。同时，上述小 鼠EC-SOD的碱基序列和氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO：5以及 SEQ ID NO：6。

使用8-10周龄的BDF1小鼠(韩国中央实验动物)作为野生型BDF1 小鼠。EC-SOD过表达小鼠是使用8-10周龄的BDF1小鼠按照公知的方 法而制备(H.Y.Ha.et.al.，Biochem Biophys Res Commun，348：450-458， 2006)。在本实验中，动物的使用得到了韩国加图立大学加图立学院(the Catholic Institute，The Catholic University of Korea)的批准。

具体而言，从韩国生命科学和生物技术学院购入杂交小鼠(C57BL/6 X CBAF1)。为诱发超数排卵，间隔48小时将各5IU的孕马血清促性腺 激素(PMSG，pregnant mare′s serum gonadotropin)和人类绒毛膜促性 腺激素(hCG，human chrionic gonadotropin)腹膜内注射给雌性小鼠， 之后与同一品系的雄性小鼠以1∶1合笼。第二天早晨观察是否有阴栓， 随后将有阴栓的个体处死，切取输卵管，从输卵管膨大部获取受精卵。培 养基使用含有0.4％牛血清白蛋白(BSA)的M16培养基。

为了获得已经在皮肤组织中诱导EC-SOD过表达的小鼠，将包含小 鼠EC-SOD的cDNA(SEQ ID NO：6)的pCRII TOPO载体(由翰林大 学医学院的SuhJun-Gyo教授提供)用限制性内切酶消化，并将小鼠 EC-SOD的cDNA部分插入到包含人类角蛋白K14启动子的pBS KS载 体。同时，在此载体中插入鸡卵清蛋白(ovalbumin)多聚腺苷(A)，帮助 在体外表达。为了在受精卵里注入DNA，将表达载体用限制性内切酶 Hind和XhoI剪切。用限制性内切酶剪切的DNA在1％琼脂糖凝胶上 电泳，通过透析回收，然后用苯酚氯仿纯化。并将其在10mM Tris(pH 7.4/ 0.2mM EDTA)中透析使最终浓度为4ng/l。将包含外源基因的DNA溶液 注入单细胞期胚胎的原核。将注入有外源基因的胚胎培养到二细胞期后， 从所培养的胚胎中筛选健康的胚胎。将发情的雌性ICR小鼠与雄性小鼠 合笼，第二天确认是否存在阴栓，并将具有阴栓的小鼠用作代孕母亲。收 集很好地发育到二细胞期的大约15-20个胚胎，并将其移植到假孕受者的 输卵管膨大部，随后将肌肉层和表皮层各自缝合。将移植后产下的动物养 到3周左右。接下来，将它们的尾巴切下1cm左右，并用裂解缓冲液在 55℃下处理，将苯酚加入其中来萃取基因组DNA。将上述基因组DNA 利用下述的PCR引物对进行PCR扩增，从而确定其是否已被转化。进 行PCR扩增的条件是：在94℃下事先变性，然后进行如下30个循环： 94℃下30秒、51℃下30秒和72.5℃下45秒，最后在72.5℃下进行最后 一次为期5分钟的延伸。

正义引物(SEQ ID NO：7)

5′-TTG TCT CTA ATA GAG GGT C-3′

反义引物(SEQ ID NO：8)

5′-TCA AGC CTG TCT ATC TTC T-3′

同时，过表达人类EC-SOD的小鼠是从美国科罗拉多 Jewish国立医疗研究中心(National Jewish Medical&Research Center) (Oury et al.JBC 268(21)：15394，1993)。

实施例1具有生物学活性的重组EC-SOD蛋白质的制备

<1-1>克隆融合的EC-SOD基因用于表达重组EC-SOD蛋白

为了制备具有生物学活性的重组EC-SOD蛋白，通过以下方式克隆 重组EC-SOD，其由209个氨基酸组成，包括N端缺失信号肽的人类 EC-SOD，并且C端缺失13个氨基酸。上述重组EC-SOD的碱基序列和 氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：1，上述人类 EC-SOD的碱基序列和氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：3。

将包含人类EC-SOD cDNA(SEQ ID NO：4)的pUC 18-hEC-SOD(瑞 典临床化学中心的Marklund教授提供)的载体作为模板，利用下述引物 进行PCR扩增，由此制备人类EC-SOD的cDNA。

正义引物(SEQ ID NO：9)

5′-tagattctggacgggcgagga-3′

反义引物(SEQ ID NO：10)

5′-tactcgagtcactctgagtgct-3′

使用pfuI聚合酶进行PCR扩增的条件是：在95℃下事先变性5分 钟，然后进行以下30个循环：95℃下30秒、55℃下30秒和72℃下1 分钟，最后在72℃下进行最后一次为期5分钟的延伸。扩增的基因产物 以限制性内切酶EcoRI和XhoI消化，然后使用T4连接酶在4℃连接12 小时，从而将其连接到由相同限制性内切酶酶消化的pET28a载体 (NovaGene，美国)中。

将上述载体转染于大肠杆菌DH5a，然后将上述转化体在含有 25mg/mL卡那霉素的LB固体培养基中培养，并对培养得到的转化体进 行筛选。通过实施基因序列分析来确认筛选出的转化体中是否正确地插入 有EC-SOD基因。从被确认其中插入有重组EC-SOD基因的转化体中分 离载体。将该载体插入到过表达用宿主细胞大肠杆菌BL21(NovaGene，美 国)中，并在含25mg/mL卡那霉素的LB固体培养基中进行培养，同时筛 选过表达EC-SOD蛋白的菌株。

<1-2>重组EC-SOD蛋白质的表达

将在上述实施例1-1中筛选的菌株在37℃下于含有25mg/mL卡那霉 素的LB液体培养基中培养。在该细胞的OD(光密度)在600nm下达到 0.6时，向其中添加IPTG(1mM)，从而诱导EC-SOD蛋白质的表达，并 在37℃下中将该细胞培养6个小时，从而在该细胞中表达重组EC-SOD 蛋白质。

<1-3>重组EC-SOD蛋白的重新折叠的诱导及纯化

表达结束后，通过离心从培养基中收集细胞，并将收集到的细胞悬浮 于含100mM氯化钙的50mM Tris缓冲液(pH 7.5)，之后用超声粉碎机 破坏细胞。将细胞悬液离心，分离沉淀层后用含100mM氯化钙的50mM Tris缓冲液洗涤3次。被洗涤的细胞沉淀物里含有不溶性蛋白质包含体。 10mg被洗涤的包含体(融合蛋白质含量50％)放入Tris缓冲液(50mM Tris-Cl，100mM NaCl，pH 7.5)后添加8M脲进行溶解。在使包含体在常 温完全混悬2个小时后，使其通过离心进行相分离，因上层的水溶液层含 有被溶解的重组EC-SOD蛋白质包含体，因此收集此溶液(包含体溶液)。

利用快速蛋白纯化液相色谱(FPLC，Fast Protein Purification Liquid Chromatography)，按照以下方式进行重组EC-SOD蛋白的重新折叠和纯 化。将缓冲溶液(8M脲、50mM Tris-Cl、100mM NaCl，pH 7.5)以1ml/min 的流速引入到填充有金属亲和树脂的色谱柱(His Trap FF crude 5mL，GE Healthcare，美国)中，以平衡该柱，然后将上面获得的包含体溶液5ml 以1ml/min的流速自上而下注入填充有金属亲和树脂的色谱柱(3ml)中， 从而使得折叠的蛋白被吸附到柱子中的固体基质上。

注射结束之后，将上述缓冲溶液50ml以1ml/min的流速自上而下 注入到柱子中，从而除去未被吸附的固体。如上述方法将柱内细胞残渣完 全去除后，将Tris缓冲液(50mM Tris缓冲溶液、1M脲、100mM NaCl、 100mM ZnCl₂、50mM CuSO₄，pH 7.5)以0.5ml/min的流速自上而下 注入到柱子中，所述Tris缓冲液含有影响EC-SOD活性的1M脲并包含 Zn和Cu，同时给予线性浓度梯度，由此逐渐减少柱内的变性剂浓度。因 此，金属离子(Zn和Cu)被全部替换为具有天然三维结构的目标蛋白， 因而被吸附到该固体基质上的折叠蛋白被重新折叠，从而具有活性。

之后将含2M咪唑和1M脲的具有浓度梯度的TRIS缓冲液自上而 下上柱。在将咪唑浓度为0.5M的洗脱缓冲液提供给柱子时，就会洗脱掉 重新折叠的融合蛋白(参照图1)。

<1-4>重组EC-SOD蛋白质的分离和纯化

为从上述实施例1-3中所获得的洗脱蛋白质中除去大量的咪唑，使 所述蛋白彻底折叠并按照大小分离所述蛋白，利用了快速蛋白纯化 液相色谱(FPLC)和凝胶过滤色谱柱(Sepharose 12柱)。在此方法中，将 Tris缓冲溶液(50mM Tris-Cl、100mM NaCl，pH 7.5)或磷酸盐缓冲盐 水(pH 7.5)以0.5mL/min的流速自上而下注入该柱子中，从而 分离及纯化。分离的目标蛋白质以超滤法浓缩。

结果，获得了本发明的重组EC-SOD蛋白质。同时每个纯化步骤中 的样本均用SDS-PAGE分析，结果如图2所示，重组EC-SOD蛋白被很 好地分离出来。

<1-5>通过蛋白印迹鉴定重组EC-SOD蛋白质

为了检测实施例1-4中分离和纯化的重组EC-SOD蛋白是否大体为 EC-SOD，实施了蛋白印迹。使用由人角质形成细胞(keratinocyte)HaCaT 细胞(由德国癌症研究所(Cancer Resaerch)的N.Fusenig教授提供)表 达的人类EC-SOD作为EC-SOD的标准蛋白质。将由HaCaT表达的人 类EC-SOD和实施例1-4中分离和纯化的EC-SOD蛋白质用10％的聚丙 烯酰胺凝胶电泳分离，然后将其转移到偏氟乙烯膜(Gelman Laboratory， MI，美国)。然后，将偏氟乙烯膜以5％的脱脂奶粉封闭，并与抗-EC-SOD 多克隆抗体(1∶500，圣克鲁兹，美国)一起孵育。将膜用水洗涤，并与 缀合有过氧化物酶的二抗IgG(圣克鲁兹，美国)一起孵育，再次水洗后， 利用ECL试剂盒(GE Healthcare，美国)按照制造商的说明书来显色。

结果如图3所示，人EC-SOD(泳道1)表现出阳性应答，分离和纯 化的重组EC-SOD蛋白(泳道2)中也检测出阳性应答。这表明，纯化的 蛋白为人类EC-SOD。

<1-6>重组EC-SOD蛋白的活性检测

为了检验上述分离和纯化的重组EC-SOD蛋白是否具有SOD的生 物学活性，利用SOD Assay Kit-WST(Dojindo Molecular Technology，美 国)按照制造商的说明书对重组EC-SOD蛋白的活性进行了测试。

结果如图4所示，纯化过程中被洗脱但未被吸附的样本(209FT)不显 示活性，通过金属亲和色谱柱重新折叠的初次纯化的重组EC-SOD蛋白 (209E1)所表现出的活性为250单位/mg蛋白质，通过凝胶过滤柱分离和 纯化的重组EC-SOD蛋白(209E2)所表现出的活性为360单位/mg蛋白 质。

<1-7>分离和纯化的重组EC-SOD蛋白的ROS去除效果的检验

为了检测重组EC-SOD蛋白在HaCaT细胞中的ROS(活性氧簇)去除 效果，将实施例1-4中分离纯化的重组EC-SOD蛋白按如下方式进行处 理。

将皮肤角质形成细胞HaCaT细胞以1X10⁴个细胞/盖玻片的浓度接 种于18mm盖玻片上，然后在含有10％胎牛血清(FBS，GIBCO)及100 单位青霉素和100g链霉素/mL的培养基各1％的IMDM(Isocove′s modified Dulbecco′s medium，GIBCO)培养基中于5％CO₂、37℃下培养。 粘附的细胞汇合达到约30-40％时，去除胎牛血清，然后培养该细胞。当 细胞汇合达到50-60％时，将该细胞用10μgEC-SOD蛋白预处理。在将 细胞用剂量为100J/m²的UVB照射3小时后，使该细胞与10mM DCFH-DA在37℃下反应30分钟，并用荧光显微镜观察。荧光显微照片 用Zeiss数码相机拍摄。

其结果如图5中所示，在细胞仅由UVB照射的UBV组，ROS未能 被去除，但在细胞由UVB照射并由本发明的EC-SOD蛋白处理的 EC-SOD+UVB组，ROS被有效地去除。

实施例2天然EC-SOD蛋白质对血管发生的抑制效果

<2-1>EC-SOD表达小鼠和野生型小鼠的形态学比较

将试验例1中制备的EC-SOD过表达小鼠和野生型BDF1小鼠每一 只的背部皮肤用剂量为2kJ/m²UVB照射四次，每次间隔24小时。具体 而言，在进行UVB照射前的两天，将每只小鼠的背部皮肤进行剃毛作业， 并使用六盏UVB灯(FS24T12/UVB/HO，290-320nm，Voltare公司 Fairfei1d，CT，美国)对8周龄的24只小鼠进行剂量为200mJ/cm²的UVB 照射，这六盏灯的波长范围介于280nm-340nm之间，并在305nm处具 有最高能量。UVB照射期间，控制灯的高度，从而以0.3mW/cm²的剂量 照射每只被麻醉的小鼠的背部皮肤表面。各组(每组6只小鼠)小鼠每隔 24小时用UVB照射四次，并在第四次UVB照射后1小时，将小鼠处死 进行实验。切开每只被处死小鼠的背部皮肤并进行肉眼观察，并将观察结 果记录在图6。

如图6所示，与没有用UVB照射的小鼠的情况(图6A)相比，在 用UVB照射的野生型小鼠的情况(图6C)下，血管发生——一种皮肤 炎症反应和红斑被显著诱导。但是在EC-SOD过表达小鼠中，在UVB 照射前(图6B)和UVB照射后(图6D)没有统计学上有意义的差异。 即，能够观察到，在野生型小鼠中由UV光(UVB)照射诱导的血管发生， 在EC-SOD过表达小鼠(图6D)中被显著地抑制。这些结果表明， EC-SOD蛋白起到抑制血管发生的作用。

<2-2>蛋白印迹

利用蛋白印迹分析了试验例1中所制备的EC-SOD过表达小鼠中， 诱导血管发生的血管内细胞生长因子(VEGF)的表达水平。

将实施例<2-1>中处死的EC-SOD过表达小鼠和野生小鼠每一只的背 部皮肤组织或细胞用萃取溶液(50mM的Tris HCl pH 8.0，5mM的 EDTA，150mM的NaCl，0.5％的脱氧胆酸钠，1％的Nonidet P-40， 0.1％的SDS，1mM的PMSF，1mM的NaF，1mM的NaVO4和蛋白酶 抑制剂混合物(德国罗氏)匀浆并萃 取。为了确定蛋白质浓度，采用Bio-Rad蛋白质试剂(Bio-Rad，CA， USA)，并将牛血清白蛋白(BSA)作为标准物质。将上述蛋白质萃取物 在10％的聚丙烯酰胺凝胶上分离，然后将其转移到聚偏二氟乙烯膜(Gel man Laboratory，MI， 美国)。然后，以5％的脱脂奶粉封闭上述聚偏二氟乙烯膜，然后与抗-V EGF多克隆抗体(1∶500，圣克鲁兹， 美国)和抗β-肌动蛋白抗体中的每一种一起孵育。将膜用水洗涤，并与缀 合有过氧化物酶的二抗IgG(圣克鲁兹，美国)一起孵育，再次水洗后， 利用ECL检测试剂显色。

结果如图7所示，由于UVB照射，野生型小鼠中的VEGF的表达水 平增加，而在UVB照射的EC-SOD过表达小鼠中的VEGF的表达明显 减少。这些结果再次确定，EC-SOD具有抑制血管发生的效果。

<2-3>免疫组织化学检验

通过免疫组织化学方法再次检测了EC-SOD是否抑制VEGF的表达。

将<实施例2-1>中处死的EC-SOD过表达小鼠和野生型小鼠每一只 的背部皮肤组织用0.5M的磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)制成的4％的多聚甲醛 固定。然后以自来水冲洗固定组织，用乙醇脱水、用石蜡包埋，以5mm 厚度切片，并贴到载玻片上。将上述切片用二甲苯溶液脱蜡，用乙醇水化， 然后用苏木精和伊红染色。对脱蜡的组织切片用3％的过氧化氢溶液进行 处理从而进行封闭。为了减少非特异性结合和背景染色，以10％的山羊 血清处理上述切片。对各组织切片以抗-VEGF多克隆抗体(1∶500，圣 克鲁兹，美国)处理后，利用链亲和素-生物素试剂盒(LSAB，Dako，CA， 美国)，通过卵白素-生物素-免疫过氧化物酶复合物方法进行可视化。将染 色的组织用水洗涤，然后以3，3-二氨基联苯胺(DAB)显色试剂显色，而后 以0.2％的迈尔苏木精(sigma，MO，美国)进行衬染。染色结果示于图8。

如图8所示，野生型小鼠经UVB照射后高度表达VEGF，而EC-SOD 过表达小鼠与野生型小鼠相比，VEGF的表达被显著抑制。这些结果与实 施例1-2的结果一致。这些结果表明，天然EC-SOD具有在体内抑制诱 导血管发生的VEGF表达从而抑制血管发生的效果。

<2-4>EC-SOD过表达小鼠中的MMP-9的表达水平的检测

降解细胞外基质蛋白质的MMP蛋白质与VEGF同样是血管发生的 重要调节因子。特别是MMP9作为通过VEGF-VEGFR系统调节肿瘤血 管发生过程的因子已是公知的(Bergers et al.，Nat.Cell Biol.，2：737-744， 2000)。

因此，发明人检测了UVB照射的EC-SOD过表达小鼠中的MMP-9 的表达水平。

将实施例2-1中处死的EC-SOD过表达小鼠和野生型小鼠的背部 皮肤组织与1mg/ml明胶(100mg/ml)混合，并进行SDS-PAGE。然后 将凝胶用2.5％曲拉通X-100(TRITON X-100)处理20分钟，并用水洗 涤。将凝胶用酶谱反应溶液(1M Tris(pH7.5)，1M CaCl2，5M NaCl，0.2 mMZnCl₂，25％TX-100，0.2％ NaN₃)在37℃下孵育16个小时，染色1小时，脱色1小时，然后在烤 箱中干燥1小时。分析干燥的凝胶，其分析结果如图9所示。

如上述图9所示，紫外线照射前的野生型小鼠和EC-SOD过表达小 鼠的MMP-9表达水平并无显著差别。但是，由于UVB照射，野生型小 鼠的MMP-9的表达增加，但EC-SOD过表达小鼠相比野生型小鼠，其 MMP-9的表达被显著地抑制。

从上述结果得知，天然EC-SOD蛋白在体内抑制VEGF的表达，而 且还抑制MMP-9——其通过VEGF-VEGFR系统参与血管发生相关信号 传递——的表达，从而有效地抑制血管发生。

实施例3重组EC-SOD蛋白质对血管发生的抑制效应

检测了实施例1中分离和纯化的重组EC-SOD蛋白质是否有抑制血 管发生的效果。将角质形成细胞HaCaT细胞以1X10⁴个细胞/盖玻片的浓 度接种于18mm盖玻片。然后在含有10％胎牛血清口BS，GIBCO)以及 100单位青霉素和100g链霉素/mL的培养基各1％的DME(Dulbecco’s minimum essential medium，GIBCO)培养基中于5％CO₂、37℃下培养。 粘附细胞的汇合达到30-40％时，去除胎牛血清，然后将该细胞培养24 小时。细胞汇合(confluent)达到50-60％时，用10μgEC-SOD预处理该细 胞。在将细胞用纯化的重组EC-SOD蛋白处理30分钟后，用剂量为100J 的UV光处理该细胞，并在24小时后，用多聚甲醛固定该皮肤角质形成 细胞，并且实施免疫染色。将固定的细胞利用10％正常山羊血清封闭， 并用磷酸缓冲盐水(PBS  )洗3次。 为了对VEGF(血管内皮生长因子)进行免疫染色，将细胞用兔抗 -VEGF  抗体(圣克鲁兹，美国)处理，然后在4℃孵育至少 16个小时。然后，将细胞用FITC缀合的抗-小鼠-IgG二抗(zymed， 美国)进行荧光染色，随后用荧光显微镜(Carl Zeiss，德国)观察。

结果如图10所示，与没有照射UVB的对照组相比，在细胞 照射UVB的UVB组中，细胞中VEGF的表达显著增加。而且，在细胞 进行UVB照射的EC-SOD/UVB组中，VEGF的表达被显著抑制，这表 明血管发生被重组EC-SOD蛋白质抑制。

实施例4：重组EC-SOD蛋白对T细胞的增殖及分化的影响

<4-1>重组EC-SOD对T细胞的增殖的影响的检测

EC-SOD是否对免疫T细胞产生影响，使用特异性抗原(卵清蛋白) 反应性TCR(T细胞受体)转染的小鼠(DO.11.10，浦航工业大学 Young-Chul Sung教授捐赠)，按照如下方式进行如下实验。

为了检测EC-SOD是否对T细胞的增殖产生影响，将从上述转染的 小鼠脾脏分离的细胞同抗原OVA肽一起孵育72小时，然后与³H孵育 16小时。随后测量被培养细胞的照射剂量从而检测增殖情况。

结果如图11所示，在没有用EC-SOD处理的组和分别用1μg/ml和 10μg/ml EC-SOD处理的组之间，照射剂量仅有一点或者没有差别，这表 明EC-SOD对T细胞的增殖仅有一点或者没有影响。

<4-2>重组EC-SOD对T细胞的分化的影响的检测

即使重组EC-SOD对T细胞的增殖不产生影响，它也会对其分化有 影响。因此测定T细胞的细胞因子以检测T细胞的分化情况。

脾细胞与抗原OVA肽一起培养48小时后，测量培养基内生成的 IL-4(白细胞介素-4)。测定利用ELISA试剂盒(Becton，Dickinson and Company，美国)，按照生产商的说明书进行。

其结果如图12所示，EC-SOD减少IL-4的形成。从这一结果可知 EC-SOD对T细胞的分化有影响。在图12中，neg.表示没有用抗原处理 的试验组，-表示只用抗原(Ova肽)处理的试验组，p表示同时用溶于PBS 中的抗原(Ova肽)和EC-SOD处理的试验组，NB：同时用溶于硼酸钠中 的抗原(Ova肽)和EC-SOD处理的试验组。所有的试验组均在培养基中 处理了48小时。

同时，为了专门检测本发明的重组EC-SOD对T细胞分化的影响， 将上述重组EC-SOD蛋白给予到小鼠的T细胞中，并比较IL-4及IFN-γ 等细胞因子的产量。

具体地，使用MACS(Miltenyi Biotech)，从DO 11.10小鼠(由浦 航工业大学Young-Chul Sung教授提供)的脾脏分离CD4T细胞，该小 鼠过表达识别特异性抗原Ova肽的TCR(T细胞受体)基因。将作为抗 原呈递细胞的正常Balb/c小鼠的脾细胞进行γ-射线照射后，与Ova肽(1 μg/ml，Ova323-339，peptron公司)和使用MACS分离的CD4T细胞一起 在添加有10％FBS的RPMI1640培养基中培养。在培养期间，将在实施 例1中分离和纯化的重组EC-SOD蛋白添加到上述培养基中。72小时后， 收集培养基，并通过ELISA(抗体：Becton Dickinson)测量培养基中的IL-4 和IFN-γ的量。

其结果如图13所示，实施例1中分离和纯化的重组EC-SOD在T细 胞中诱导Th1细胞因子IFN-γ的形成，并抑制Th2细胞因子IL-4的形成。 这表明重组EC-SOD蛋白对免疫细胞产生影响，尤其对T细胞的分化产 生影响。

由此可知，本发明的重组EC-SOD蛋白阻断诱发变应性疾病的Th2 细胞的过分化，诱导向Th1细胞的分化，因而可有利地用于变应性疾病 的治疗或预防。

实施例5：天然EC-SOD蛋白对T细胞的分化的影响

将Ova蛋白和诱导Th1免疫性的免疫佐剂CFA(完全弗氏佐剂， Sigma公司)与诱导Th2免疫性的Alum(氢氧化铝，Pierce公司)混合，并 将25μg此混合物免疫接种到试验例1中制备的人EC-SOD过表达小鼠 的足底和尾部。11日后，从产生炎症的淋巴细胞中分离细胞，并观察 EC-SOD是否对细胞增殖和细胞因子的生成产生影响。

在对细胞增殖的观察中，在96孔板中培养5×10⁵个淋巴细胞，培养 3天后，将同位素³H放入到培养基中。16小时后，利用β-计数器测定细 胞中的同位素含量来观察细胞增殖。且，为了检测所述反应是否为抗原特 异性反应，使用不同量的Ova蛋白观察细胞增殖。为了观察细胞因子的 表达，在46孔板中培养5×10⁶个淋巴细胞，72小时后，收集培养基，通 过ELISA测量培养基中的IL-4和IFN-γ的量。测量结果记载在图14和 图15。

如图14和图15所示，观察到：在将诱导Th1分化的CFA作为免疫 佐剂时，淋巴细胞增殖比正常小鼠中的淋巴细胞的增殖稍微增加，IFN-γ 的表达也增加。还观察到，在将诱导Th2分化的Alum作为免疫佐剂时， 淋巴细胞增殖相对正常小鼠的淋巴细胞的增殖减少，IL-4的表达也减少。 从这些结果可知，EC-SOD对T细胞的分化产生影响，即它刺激分化为 Th1，抑制分化为Th2。

由此可知，天然EC-SOD阻断诱发变应性疾病的Th2细胞的过分化， 诱导向Th1细胞分化，因而可有利地用于变应性疾病的治疗或预防。

实施例6：重组EC-SOD蛋白对转录因子活性的抑制的效果的检测

为了检测EC-SOD对UV光引起的NF-κB的活性的效果，将HaCaT 细胞接种到14mm培养玻片中，然后在包含10％胎牛血清的 DMEM(Dulbecco′s modified Eagle′s medium)培养基中培养24小时。培 养24小时后，在含有1％胎牛血清的DMEM培养基中饥饿培养24小时。 饥饿处理后，将该细胞用10μg的EC-SOD预处理30分钟，然后，利用 磷酸缓冲盐水(PBS)将细胞洗涤3次。为了诱导NF-κB的活化，将该细胞 用剂量为100J/m²的UV光照射。UV光照射后，将该细胞立即用磷酸缓 冲盐水再次洗涤，用10μgEC-SOD处理，然后再在含1％胎牛血清的 DMEM中培养4小时。之后，细胞用甲醇固定并进行免疫染色。将固定 的细胞用10％的正常山羊血清封闭，并用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤3次。 为了对EC-SOD和NF-κB进行免疫染色，将这些细胞用小鼠抗-EC-SOD 抗体(Labfrontier，韩国)和兔抗-NF-κB抗体(santacuz，美国)于4℃处理至 少16小时。然后将该细胞用TRITC(四甲基罗丹明异硫氰酸酯)缀合的抗 -兔-IgG二抗(serotec，英国)和FITC融合的抗-小鼠-IgG二抗(zymed，美 国)进行荧光染色，然后用Hoechst(Sigma，美国)进行衬染。

结果如图16(放大倍数200×)所示，可以观察到，在由EC-SOD 转染的HaCaT细胞且没有用UV光照射的对照组，在细胞质和细胞核中 没有被免疫染色的NF-κB，这表明NF-κB未被活化(图16A、D、G和J)。 还观察到，在UVB组(其中HaCaT细胞被剂量为100J/m²的UVB照射) 中，在细胞核部位及核周部位，NF-κB被快速活化(图16B、E、H和K)。 与之相比，还观察到，在EC-SOD/UVB组(其中HaCaT细胞由本发明的 重组EC-SOD蛋白处理并由100J/m²的UVB照射)中，细胞核部位的 NF-κB活化与UVB组相比受到显著抑制(图16C、F、I和L)。从上述结 果可知，本发明的重组EC-SOD蛋白可抑制转录因子NF-κB的活化。

由此可知，本发明的重组EC-SOD蛋白可抑制NF-κB的异常活性， 因而可有利地用于自身免疫疾病例如变应性疾病的预防及治疗。

实施例7：EC-SOD蛋白对减少人肥大细胞脱颗粒的效果的检测

为了检测EC-SOD对人肥大细胞的脱颗粒是否产生影响，将肥大细 胞用甲苯胺蓝染色，然后对100个被染色细胞中脱颗粒细胞的数目。

将人肥大细胞(由韩国庆熙大学Kim Hyeong-min教授提供的半粘附 人肥大细胞-1(HMC-1))以1X10⁴个细胞/盖玻片的浓度接种于18X18mm 的盖玻片。在添加10％胎牛血清(FBS，GIBCO)及100单位青霉素和100g 链霉素/ml的培养基各1％的IMDM(Isocove′s modified Dulbecco′s medium，GIBCO)中于5％CO²、37℃培养该细胞。由于这种细胞为半粘 附细胞，因此粘附细胞和非粘附细胞的比例为大约4∶6。粘附的细胞汇 合30-40％左右时，将该细胞用5μgEC-SOD预处理1小时，然后用1μM 的钙通道A23187和50nM的豆蔻酰佛波醇乙酯 (Phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)来提高细胞内的钙浓度。

12小时后，人肥大细胞用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤，然后用多聚 甲醛固定10分钟。在细胞用磷酸缓冲盐水洗涤后，将其用溶解于1％酸 性盐水(PH 2.3)中的0.1％甲苯胺蓝染色2-3分钟。将该细胞再次用水 洗涤，然后用95％和100％乙醇脱水，用二甲苯固定，并计算100个被染 色细胞中的脱颗粒细胞的数目。

结果如图17所示，未经任何处理的人肥大细胞组(对照组)中的脱 颗粒细胞的数目为10，EC-SOD处理的组(EC-SOD)中的脱颗粒细胞的数 目为16。与此相比，为了诱导肥大细胞的活化和脱颗粒而提高细胞内钙 浓度的组(A+P)中，脱颗粒细胞的数目增加五倍达55个，但在用EC-SOD 预处理并被处理来提高细胞内钙浓度的组(A+P+EC-SOD)中，脱颗粒细胞 的数目又减少到25个。这表明由于EC-SOD的作用抑制了活性氧簇减少 了肥大细胞脱颗粒的发生。有关肥大细胞脱颗粒的显微照片如图17B所 示。

因此，考虑到储藏在肥大细胞中的介体如组胺，由于肥大细胞的脱颗 粒而得以释放，从而引起炎症反应如变应反应，可想到本发明的重组 EC-SOD蛋白可有利地用于预防或治疗变应性疾病。

工业上的利用

EC-SOD蛋白或具有编码所述EC-SOD蛋白的多核苷酸的载体可通 过抑制诱导血管发生的VEGF及MMP-9的表达从而抑制血管发生的效 果。因此，所述EC-SOD蛋白或所述载体可用于预防或者治疗血管发生 介导的疾病。同时，所述EC-SOD蛋白或所述具有编码所述EC-SOD蛋 白的多核苷酸的载体还具有以下作用：抑制引起变应性疾病的Th2细胞 的过分化，抑制转录因子(NF-κB)活性并减少人肥大细胞的脱颗粒化。因 此，所述EC-SOD蛋白或所述载体可有利地用于变应性疾病的预防或者 治疗。且本发明的EC-SOD蛋白制备方法可用于大规模制备具有上述活 性的EC-SOD蛋白。因此，本发明的方法可在工业上得到利用。

序列表

<110>韩国加图立大学产学合作基金会

<120>细胞外超氧化物歧化酶的新用途及其制备方法

<130>OP08-0009

<150>KR-10-2007-0028327

<151>2007-03-22

<150>KR-10-2007-0056973

<151>2007-06-11

<160>10

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>209

<212>PRT

<213>重组EC-SOD

<400>1

Trp Thr Gly Glu Asp Ser Ala Glu Pro Asn Ser Asp Ser Ala Glu Trp

  1               5                  10                  15

Ile Arg Asp Met Tyr Ala Lys Val Thr Glu Ile Trp Gln Glu Val Met

             20                  25                  30

Gln Arg Arg Asp Asp Asp Gly Thr Leu His Ala Ala Cys Gln Val Gln

         35                  40                  45

Pro Ser Ala Thr Leu Asp Ala Ala Gln Pro Arg Val Thr Gly Val Val

    50                  55                  60

Leu Phe Arg Gln Leu Ala Pro Arg Ala Lys Leu Asp Ala Phe Phe Ala

 65                  70                  75                  80

Leu Glu Gly Phe Pro Thr Glu Pro Asn Ser Ser Ser Arg Ala Ile His

                 85                  90                  95

Val His Gln Phe Gly Asp Leu Ser Gln Gly Cys Glu Ser Thr Gly Pro

            100                 105                 110

His Tyr Asn Pro Leu Ala Val Pro His Pro Gln His Pro Gly Asp Phe

        115                 120                 125

Gly Asn Phe Ala Val Arg Asp Gly Ser Leu Trp Arg Tyr Arg Ala Gly

    130                 135                 140

Leu Ala Ala Ser Leu Ala Gly Pro His Ser Ile Val Gly Arg Ala Val

145                 150                 155                 160

Val Val His Ala Gly Glu Asp Asp Leu Gly Arg Gly Gly Asn Gln Ala

                165                 170                 175

Ser Val Glu Asn Gly Asn Ala Gly Arg Arg Leu Ala Cys Cys Val Val

            180                 185                 190

Gly Val Cys Gly Pro Gly Leu Trp Glu Arg Gln Ala Arg Glu His Ser

        195                 200                 205

Glu

<210>2

<211>627

<212>DNA

<213>重组EC-SOD

<400>2

tggacgggcg aggactcggc ggagcccaac tctgactcgg cggagtggat ccgagacatg     60

tacgccaagg tcacggagat ctggcaggag gtcatgcagc ggcgggacga cgacggcacg    120

ctccacgccg cctgccaggt gcagccgtcg gccacgctgg acgccgcgca gccccgggtg    180

accggcgtcg tcctcttccg gcagcttgcg ccccgcgcca agctcgacgc cttcttcgcc    240

ctggagggct tcccgaccga gccgaacagc tccagccgcg ccatccacgt gcaccagttc    300

ggggacctga gccagggctg cgagtccacc gggccccact acaacccgct ggccgtgccg    360

cacccgcagc acccgggcga cttcggcaac ttcgcggtcc gcgacggcag cctctggagg    420

taccgcgccg gcctggccgc ctcgctcgcg ggcccgcact ccatcgtggg ccgggccgtg    480

gtcgtccacg ctggcgagga cgacctgggc cgcggcggca accaggccag cgtggagaac    540

gggaacgcgg gccggcggct ggcctgctgc gtggtgggcg tgtgcgggcc cgggctctgg    600

gagcgccagg cgcgggagca ctcagag                                        627

<210>3

<211>240

<212>PRT

<213>人EC-SOD

<400>3

Met Leu Ala Leu Leu Cys Ser Cys Leu Leu Leu Ala Ala Gly Ala Ser

  1               5                  10                  15

Asp Ala Trp Thr Gly Glu Asp Ser Ala Glu Pro Asn Ser Asp Ser Ala

             20                  25                  30

Glu Trp Ile Arg Asp Met Tyr Ala Lys Val Thr Glu Ile Trp Gln Glu

         35                  40                  45

Val Met Gln Arg Arg Asp Asp Asp Gly Thr Leu His Ala Ala Cys Gln

     50                  55                  60

Val Gln Pro Ser Ala Thr Leu Asp Ala Ala Gln Pro Arg Val Thr Gly

 65                  70                  75                  80

Val Val Leu Phe Arg Gln Leu Ala Pro Arg Ala Lys Leu Asp Ala Phe

                 85                  90                  95

Phe Ala Leu Glu Gly Phe Pro Thr Glu Pro Asn Ser Ser Ser Arg Ala

            100                 105                 110

Ile His Val His Gln Phe Gly Asp Leu Ser Gln Gly Cys Glu Ser Thr

        115                 120                 125

Gly Pro His Tyr Asn Pro Leu Ala Val Pro His Pro Gln His Pro Gly

    130                 135                 140

Asp Phe Gly Asn Phe Ala Val Arg Asp Gly Ser Leu Trp Arg Tyr Arg

145                 150                 155                 160

Ala Gly Leu Ala Ala Ser Leu Ala Gly Pro His Ser Ile Val Gly Arg

                165                 170                 175

Ala Val Val Val His Ala Gly Glu Asp Asp Leu Gly Arg Gly Gly Asn

            180                 185                 190

Gln Ala Ser Val Glu Asn Gly Asn Ala Gly Arg Arg Leu Ala Cys Cys

        195                 200                 205

Val Val Gly Val Cys Gly Pro Gly Leu Trp Glu Arg Gln Ala Arg Glu

    210                 215                 220

His Ser Glu Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Glu Cys Lys Ala Ala

225                 230                 235                 240

<210>4

<211>720

<212>DNA

<213>人EC-SOD

<400>4

atgctggcgc tactgtgttc ctgcctgctc ctggcagccg gtgcctcgga cgcctggacg     60

ggcgaggact cggcggagcc caactctgac tcggcggagt ggatccgaga catgtacgcc    120

aaggtcacgg agatctggca ggaggtcatg cagcggcggg acgacgacgg cacgctccac    180

gccgcctgcc aggtgcagcc gtcggccacg ctggacgccg cgcagccccg ggtgaccggc    240

gtcgtcctct tccggcagct tgcgccccgc gccaagctcg acgccttctt cgccctggag    300

ggcttcccga ccgagccgaa cagctccagc cgcgccatcc acgtgcacca gttcggggac    360

ctgagccagg gctgcgagtc caccgggccc cactacaacc cgctggccgt gccgcacccg    420

cagcacccgg gcgacttcgg caacttcgcg gtccgcgacg gcagcctctg gaggtaccgc    480

gccggcctgg ccgcctcgct cgcgggcccg cactccatcg tgggccgggc cgtggtcgtc    540

cacgctggcg aggacgacct gggccgcggc ggcaaccagg ccagcgtgga gaacgggaac    600

gcgggccggc ggctggcctg ctgcgtggtg ggcgtgtgcg ggcccgggct ctgggagcgc    660

caggcgcggg agcactcaga gcgcaagaag cggcggcgcg agagcgagtg caaggccgcc    720

                                                                     720

<210>5

<211>251

<212>PRT

<213>小鼠EC-SOD

<400>5

Met Leu Ala Phe Leu Phe Tyr Gly Leu Leu Leu Ala Ala Cys Gly Ser

155             159                 164                 169

Val Thr Met Ser Asn Pro Gly Glu Ser Ser Phe Asp Leu Ala Asp Arg

            174                 179                 184

Leu Asp Pro Val Glu Lys Ile Asp Arg Leu Asp Leu Val Glu LysIle

        189                 194                 199

Gly Asp Thr His Ala Lys Val Leu Glu Ile Trp Met Glu Leu Gly Arg

    204                 209                 214

Arg Arg Glu Val Asp Ala Ala Glu Met His Ala Ile Cys Arg Val Gln

219                 224                 229                 234

Pro Ser Ala Thr Leu Pro Pro Asp Gln Pro Gln Ile Thr Gly Leu Val

                239                 244                 249

Leu Phe Arg Gln Leu Gly Pro Gly Ser Arg Leu Glu Ala Tyr Phe Ser

            254                 259                 264

Leu Glu Gly Phe Pro Ala Glu Gln Asn Ala Ser Asn Arg Ala Ile His

        269                 274                 279

Val His Glu Phe Gly Asp Leu Ser Gln Gly Cys Asp Ser Thr Gly Pro

    284                 289                 294

His Tyr Asn Pro Met Glu Val Pro His Pro Gln His Pro Gly Asp Phe

299                 304                 309                 314

Gly Asn Phe Val Val Arg Asn Gly Gln Leu Trp Arg His Arg Val Gly

                319                 324                 329

Leu Thr Ala Ser Leu Ala Gly Pro His Ala Ile Leu Gly Arg Ser Val

            334                 339                 344

Val Val His Ala Gly Glu Asp Asp Leu Gly Lys Gly Gly Asn Gln Ala

        349                 354                 359

Ser Leu Gln Asn Gly Asn Ala Gly Arg Arg Leu Ala Cys Cys Val Val

    364                 369                 374

Gly Thr Ser Ser Ser Ala Ala Trp Glu Ser Gln Thr Lys Glu Arg Lys

379                 384                 389                 394

Lys Arg Arg Arg Glu Ser Glu Cys Lys Thr Thr

                399                 404

<210>6

<211>756

<212>DNA

<213>小鼠EC-SOD    

<400>6

atgttggcct tcttgttcta cggcttgcta ctggcggcct gtggctctgt caccatgtca     60

gatccagggg agtccagctt cgacctagca gacaggcttg acccggttga gaagatagac    120

aggcttgacc tggttgagaa gataggcgac acgcatgcca aagtgctgga gatctggatg    180

gagctaggac gacgaaggga ggtggatgct gccgagatgc atgcaatctg cagggtacaa    240

ccatcagcca cgctgccacc ggatcagccg cagatcaccg gcttggttct cttccggcag    300

ctggggccgg gctccaggct tgaggcctat ttcagtctgg agggcttccc agctgagcag    360

aacgcctcca accgtgccat ccacgtgcat gagttcgggg acctgagcca gggctgcgat    420

tccaccggcc cgcactacaa cccgatggag gtgccgcacc ctcagcaccc gggcgacttt    480

ggcaacttcg tggtgcgcaa tggccagctc tggaggcatc gcgtcggcct gaccgcgtcg    540

ctggccggac cgcactccat cttgggccgc tctgtggtgg tccacgccgg cgaggacgac    600

ctgggtaaag gtggcaacca ggccagcctg cagaacggca atgcaggtcg ccggctcgcc    660

tgctgcgtgg taggcaccag cagctccgcc gcctgggaga gtcagacaaa ggagcgcaag    720

aagcggcggc gggagagcga gtgcaagacc acttaa                              756

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正义引物

<400>7

ttgtctctaa tagagggtc                                                  19

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反义引物

<400>8

tcaagcctgt ctatcttct       19

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正义引物

<400>9

tagattctgg acgggcgagg a    21

<210>10

<211>22

<212>DNA    

<213>人工序列

<220>

<223>反义引物

<400>10

tactcgagtc actctgagtg ct   22