肾缺血再灌注损伤心内氧化应激水平及细胞外超氧化物歧化酶的表达变化

摘要

肾缺血再灌注损伤（Renal ischemia reperfusion injury, RIRI)是临床上肾脏手术治疗时的一种病理现象。RIRI的发生可延迟术后患者肾脏功能的恢复，严重的可导致手术失败以及肾功能衰竭。已有实验研究证实：肾脏在血流被阻断时会诱发不同部位的组织细胞损伤，当血液灌注恢复时会有大量活性氧族（reactive oxygen species：ROS)形成并从肾组织细胞释放出来，进一步加重已有的细胞损伤，从而引发肾缺血再灌注损伤的发生。因此，氧化应激被认为可能是导致RIRI发生的主要机制之一。
　　超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutases，SOD）有三种亚型，锰-超氧化物歧化酶（Mn-SOD）、铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、细胞外超氧化物歧化酶（extracellular SOD, EC-SOD)。 EC-SOD是清除细胞外ROS的SOD亚型。以往对于Cu/Zn-SOD和Mn-SOD的抗氧化功能研究较多。但最近研究发现：与Cu/Zn-SOD和Mn-SOD相比， EC-SOD可能在抗氧化应激和抗炎等方面发挥了更加重要的作用。研究发现：心肌组织内EC-SOD表达量的降低，可明显增加患者高血压和缺血性心肌疾病的发病率。EC-SOD与胞外基质结合力下降，心血管和缺血性心脏疾病的发生风险也会明显增加。此外，EC-SOD在心脏衰竭患者的表达水平也是明显降低的。以上这些研究表明：EC-SOD在维持心肌正常功能中可能具有重要作用。
　　心脏是血液循环的动力器官，为维持其正常功能需消耗大量的氧气与营养物质。因此，心脏对缺血缺氧反应十分敏感。当肾组织发生缺血再灌注损伤并处于氧化应激状态时，心肌组织是否也会因氧化应激反应而诱发过氧化损伤？心肌EC-SOD的表达是否改变。
　　目的：探求RIRI后心肌组织EC-SOD基因和蛋白表达水平是否发生改变，这种改变与H2O2含量、MDA含量是否具有相关性。
　　方法：
　　1 RIRI动物模型的建立及检测标本的处理
　　购于河北医科大学实验动物中心的雄性Wister大鼠（体重200±10 g）12只，随机分为对照组（Control组）和肾脏缺血再灌注损伤模型组(RIRI组)。按照余晓东等人的模型制备方法建立RIRI实验动物模型：腹腔注射6％水合氯醛（5ml/kg）麻醉大鼠。将RIRI组大鼠固定于手术台上，酒精消毒后开腹充分暴露双侧肾脏，先将大鼠的右侧肾脏切除后,再钝性地分离其左侧肾动脉,并采用无创动脉夹于肾门内侧约0.5cm处夹闭左肾动脉，夹闭后肾脏颜色由鲜红变为浅红，表明肾脏血液供应被阻断成功。血液供应阻断45分钟后，松开动脉夹，可观察到左侧肾动脉迅速充盈,肾脏颜色也随即由浅红色转变为鲜红色,提示左侧肾脏的血液重新灌注成功。Control组大鼠的消毒开腹过程与RIRI模型组一致，但该组大鼠双侧肾脏暴露后只切除其右侧肾脏,钝性地分离左侧肾动脉,但并不夹闭阻断血液灌注。恢复大鼠肾脏血流灌注24小时后重新麻醉大鼠，收集右颈总动脉血液，离心后吸取上层血清，冻存后用于检测肌酐（Serum Creatinine，SCr）、尿素氮（Blood Urea Nitrogen，BUN）含量；先摘取大鼠肾脏，生理盐水清洗后，固定于4%多聚甲醛溶液中，采用HE染色法观察大鼠肾组织形态结构的变化。后摘取心脏，将切取的心脏迅速置于液氮中，待冷冻后转移至-80℃冰箱保存备用，用于检测大鼠心肌组织EC-SOD基因和蛋白表达水平，以及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）含量检测。
　　2测定指标及检测方法
　　2.1大鼠血清中SCr和BUN含量检测
　　大鼠血清中SCr和BUN含量分别采用苦味酸和酶偶联速率法测定。SCr和BUN含量的测定过程严格按照试剂盒操作说明进行。
　　2.2大鼠肾脏组织形态结构改变的观察
　　采用HE染色法观察肾脏组织形态结构的改变。将4%多聚甲醛固定的肾脏标本用梯度（50℅→100℅）乙醇进行脱水、两道二甲苯进行透明，最后用熔化的石蜡进行浸蜡和包埋处理。将包埋后的肾脏标本块，修块后切片，厚度约5μm，将切片捞于载玻片上，梯度（100℅→50℅）乙醇至水，然后进行苏木精伊红染色，染色、分色后梯度（50℅→100℅）乙醇进行脱水，二甲苯透明树胶封片。Olympus光学显微镜观察肾组织形态学改变并拍照。
　　2.3大鼠心肌组织中MDA含量检测
　　按照10mg/100μl的比例向冰冻的心肌组织内加入预冷的匀浆缓冲液。匀浆缓冲液构成：磷酸钾50mmol/L，苯甲基磺酰氟1mmol/L，苯甲脒1mmol/L，吐温-200.1%，氯化钠0.5mol/L，乙二胺三乙酸三钠1mmol/L，β-巯基乙醇5mmol/L，PH7.4。冰水混合物容器内匀浆，然后将匀浆液4℃、4000转/分，离心20分钟，收集上清液即为10％大鼠心肌组织匀浆，其MDA含量采用巴比妥酸比色法检测，整个检测过程按照南京建成MDA测定试剂盒的操作指南进行。
　　2.4大鼠心肌中H2O2含量检测
　　匀浆缓冲液构成：磷酸钾50mmol/L，苯甲基磺酰氟1mmol/L，苯甲脒1mmol/L，吐温-200.1%，氯化钠0.5mol/L,乙二胺三乙酸三钠1mmol/L，β-巯基乙醇5mmol/L，PH7.4。向预冷的匀浆缓冲液中加入冰冻的心肌组织，使其浓度为10mg/100μl，冰水混合物容器内匀浆，然后将匀浆液4℃、4000转/分离心20分钟，收集上清液，此时制成含大鼠心肌组织10％的匀浆液。心肌匀浆液内H2O2含量采用钼酸比色法测定，以每克心肌蛋白所含H2O2的量表示心肌组织中H2O2的含量（mmol/g pro）。
　　2.5大鼠心肌组织EC-SOD基因水平表达检测
　　采用TRIzol试剂裂解大鼠心肌组织提取其中的总RNA。RNA定量后，采用3μg RNA反转录成模板cDNA。选取磷酸甘油醛脱氢酶(reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作为内参照，进行PCR扩增。扩增产物跑琼脂糖凝胶电泳，拍照测量扩增产物条带灰度值，采用EC-SOD扩增产物与内参照 GAPDH扩增产物的灰度值比，来表示EC-SOD基因的相对表达量。
　　2.6大鼠心肌组织EC-SOD蛋白水平表达检测
　　采用Western blotting（免疫印迹法）测定大鼠心肌组织EC-SOD蛋白水平的相对表达量。冰水混合物容器内将大鼠心肌组织匀浆,匀浆液离心（3000rpm），取上清、煮沸，使其蛋白变性，采用改良Lowry法进行蛋白定量。聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白上样量为65 ug，转膜后5％脱脂奶粉封闭处理,将5％脱脂奶粉稀释的兔抗EC-SOD抗体（一抗）滴加到PVDF膜上，将其置于摇床4℃震荡过夜。经Tween-TBS漂洗液洗膜两次后，滴加荧光标记的二抗（抗兔IgG）。条带选用双色红外线成像系统扫描并对其灰度值进行分析。
　　2.7大鼠心肌EC-SOD mRNA、蛋白表达水平与MDA含量、H2O2含量相关性分析
　　采用Pearson相关性统计法分析大鼠心肌EC-SOD mRNA、蛋白表达水平与MDA含量、H2O2含量的相关性
　　结果：
　　1大鼠肾组织的HE观察结果
　　HE法观察大鼠肾组织形态结构改变。对照组大鼠肾组织光镜下可见：肾小球、肾小囊形态正常未见血管球萎缩囊腔扩张，近、远曲小管以及集合管的形态结构未见异常，肾间质结构规整无异常。而RIRI组大鼠肾组织光镜下可见：肾小体、肾小管之间的间隙扩大；肾血管球萎缩、体积缩小；肾小囊的囊腔增宽变大；近、远曲小管以及集合管的管壁细胞萎缩体积变小，管腔明显扩张。心肌组织在光学显微镜下两组间未见明显形态结构变化。
　　2大鼠血清SCr含量
　　肾缺血再灌注损伤组大鼠血清SCr含量为131.153±17.814μmol/L，正常对照组大鼠血清SCr含量为103.444±8.465μmol/L，两组相比肾缺血再灌注损伤组大鼠血清SCr含量升高（P<0.05）。
　　3大鼠血清BUN含量
　　肾缺血再灌注损伤组大鼠血清BUN含量为13.685±4.397 mmol/L，正常对照组大鼠血清BUN含量为4.462±0.541 mmol/L，两组相比，肾缺血再灌注损伤组大鼠血清BUN含量升高明显（P<0.05）。
　　4大鼠心肌组织中MDA含量
　　肾缺血再灌注损伤组大鼠心肌组织MDA含量为14.01±2.29 mmol/g，正常对照组大鼠心肌组织MDA含量为10.18±1.77mmol/g，两组相比，肾缺血再灌注损伤组大鼠心肌组织MDA含量升高（P<0.01）。
　　5大鼠心肌组织中H2O2含量
　　肾缺血再灌注损伤组大鼠心肌组织H2O2含量为18.56±2.56 mmol/g，正常对照组大鼠心肌组织H2O2含量为13.93±1.88 mmol/g，两组相比，肾缺血再灌注损伤组大鼠心肌组织H2O2含量升高（P<0.01）。
　　6心肌组织EC-SOD基因的表达改变
　　RT-PCR法测定大鼠心肌组织EC-SOD的mRNA相对表达水平， GAPDH作为扩增内对照。与对照组大鼠心肌组织EC-SOD mRNA表达量（0.73±0.11）相比，肾缺血再灌注损伤组大鼠心肌组织EC-SOD mRNA表达水平（1.15±0.17）明显升高，（P<0.01）。此结果表明：肾缺血再灌注损伤发生后，RIRI组大鼠心肌组织EC-SOD基因表达水平明显增强。
　　7心肌组织EC-SOD的蛋白表达改变
　　免疫印迹法检测蛋白水平EC-SOD相对表达量，肾缺血再灌注损伤组大鼠心肌组织EC-SOD蛋白相对表达量为1.07±0.12，正常对照组大鼠心肌组织EC-SOD蛋白相对表达量为0.65±0.1，两组相比，肾缺血再灌注损伤组大鼠心肌组织EC-SOD蛋白相对表达量增强（P<0.01）。此结果表明：肾缺血再灌注损伤发生后，RIRI组大鼠心肌组织EC-SOD的蛋白表达水平也是增强的。
　　8心肌EC-SOD mRNA、蛋白表达水平与MDA、H2O2含量的相关性
　　Pearson统计法分析大鼠心肌EC-SOD mRNA、蛋白表达水平与MDA含量、H2O2含量的相关性。心肌EC-SOD mRNA表达水平与MDA（r=0.70, P<0.05）、H2O2含量（r=0.632, P<0.05）呈正相关；EC-SOD蛋白表达水平与MDA（r=0.616, P<0.05）、H2O2含量（r=0.641, P<0.05）也呈正相关。
　　结论：RIRI大鼠心肌组织EC-SOD基因和蛋白表达水平均增加，并且与心肌MDA、H2O2含量呈正相关，提示EC-SOD可能在RIRI过程中发挥了抗氧化作用，保护心肌组织减轻过氧化损伤。

目录

声明

英文缩写

前言

材料与方法

1 材料

2 测定方法

3 统计处理

结果

1 大鼠肾组织的HE观察结果

2 大鼠血清SCr含量

3 大鼠血清BUN含量

4 大鼠心肌组织中MDA含量

5 大鼠心肌组织中H2O2含量

6 大鼠心肌组织EC-SOD 基因水平表达

7 心肌组织EC-SOD的蛋白表达改变

8 心肌EC-SOD mRNA、蛋白表达水平与MDA、H2O2含量的相关性

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述:肾缺血再灌注损伤与腺苷受体

致谢

个人简历