植物乳杆菌用于增加细菌多样性的用途

摘要

在此披露了将植物乳杆菌的一种菌株用于制造增加胃肠道多样性的一种组合物的用途，这是通过将所述菌株给予一位个体，其目的是产生与安慰剂相比的一个增加的多样性指数，连同将植物乳杆菌的一种菌株用于制造一种组合物的用途，该组合物用于健康个体防止其发展成低细菌多样性(LBD)的预防性治疗；用于一个患有LBD的个体的预防性治疗以防止其发展成一种或多种生理性扰乱的状况、大肠细菌的过度生长(LIBO)、或小肠细菌的过度生长(SIBO)；以及用于一个患有LIBO或SIBO的个体的预防性治疗以防止其发展成一种或多种生理性扰乱的状况；以及用于增加所述多样性的一种方法。

说明书

发明的技术领域

本发明涉及植物乳杆菌的一种菌株用于制造增加胃肠道多样性的 一种组合物的用途，并涉及植物乳杆菌的一种菌株用于制造预防性治疗 的一种组合物的用途。

背景技术

生物学中的一种共识是高度多样性(不同类型的生物的变异)对总 的生态系统是有益的、同样对于局部更有限的生态系统以及还对人类的 个体是有益的。高度的多样性表明生态系统是处于健康的平衡之中。相 比之下，一个失衡的或紊乱的、或患病的生态系统对于少数的生物的“过 度生长”开放门户，使这些生物控制了该系统并引起进一步的紊乱以及 新的患病情况。这也适用于人类肠道的生态系统。

人类胃肠(GI)道的细菌菌群是一个复杂的生态系统。由于细菌菌 群对营养、免疫系统的发育和不断的调谐、以及对集群现象的抵抗力的 贡献，其组成与活性在人类健康中发挥了重要作用。胃肠道可以被认为 是一个从口腔延伸至肛门的一个专门化的管道。它被分成几个明确定义 的解剖学区域，包括口腔、食道、胃、小肠(十二指肠、空肠、以及回 肠)、以及大肠(盲肠、结肠、以及直肠)。由于胃内的酸度、内容物短 的通过时间、胆汁和胰液的分泌，在胃以及上面的三分之二的小肠(十 二指肠以及空肠)内的细菌浓度是相对较低的。每毫升的胃或肠的内容 物的细菌的浓度正常是在10²至10⁴菌落形成单位(cfu)的范围内，在 这些区域中的典型常驻细菌的实例是链球菌属以及乳杆菌属。小肠(回 肠)的远端部分正常具有每毫升10⁷至10⁸cfu的浓度，并且通常是由在 结肠内发现的相同类型的细菌占据优势，即不同类别的厚壁菌门 (Firmicutes)、拟杆纲门(Bacteriodetes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、 疣微菌门(Verrucomicrobia)、变形细菌门(Proteobacteria)、以及双 岐杆菌属(WANG，M.，S.，JEPPSSON，B.&MOLIN，G. (2005)。Comparison of bacterial diversity along the human intestinal tract by direct cloning and sequencing of 16S rRNA genes.FEMS Microbial Ecology 54：219-231)。由于更长通过时间(高达60h)，在大 肠内发现的细菌浓度最高。已经估计细菌的生物质构成了粪便固体物的 40％至55％，并且活细菌的浓度正常是每克肠的内容物10¹⁰至10¹¹cfu 左右。在一个未扰乱的、平衡的、以及健康的结肠内细菌多样性也是处 在它的峰值。然而，由于极高的细菌浓度，结肠也是胃肠(GI)道最容 易受到易位损害的部分，这里活的细菌或细菌的毒性部分穿过粘膜屏障 并且进入肠系膜淋巴结以及其他肠外的部位，诸如脾、肝、肾、腹膜腔、 以及血流。低细菌多样性(LBD)增加了大肠细菌过度生长(LIBO) 以及小肠细菌过度生长(SIBO)的风险，它可以导致易位。

在本技术领域中已经证明在克罗恩病患者胃肠道内的多样性很低， [Manichanh C.，Rigottier-Gois L.，Bonnaud E.，Gloux K.，Pelletier E.， Frangeul L.，Nalin R.，Jarrin C.，Chardon P.，Marteau P.，Roca J.，and DoréJ.(2006)Reduced diversity of faecal microbiota in Crohn′s disease revealed by a metagenomic approach.Gut 55：205-211][Ott S.J. Musfeldt M.，Wenderoth D.F.，Hampe J.，Brant O.，U.R.，Timmis K.N.，and Schreiber S.(2004)Reduction in diversity of the colonic mucosa associated bacterial  microflora in patients with active inflammatory disease.Gut 53：685-693]。

已经进一步证明具有胃肠道内低多样性的新生儿具有变成过敏性 的风险更高，[Wang，M.，Karlsson，C.，Olsson，C.，Adlerberth，I.，Wold， A.，Strachan，D.P.，Martricardi，P.M.，N.，Perkin，M.R.，Tripodi， S.，Hesselmar，B.，Saalman，R.，Molin，G.& Ahrné，S.(2008).Reduced diversity in the early fecal microbiota of infants developing atopic eczema：Low diversity in early microbiota of infants developing atopy. Journal of Allergy and Clinical Immunology 121：129-134]。

已经进一步证明遭受在胃肠道内“过度生长”(低多样性)的雌性 大鼠所产的幼鼠具有增高的结合珠蛋白水平以及不成熟的肠，[F.， Ahrné，S.，Molin，G.，Jeppsson，B.&B(2008).Microbial manipulation of the rat dam changes bacterial colonization and alters properties of the gut in her offspring.American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology 294：148-154]。

因此，在人类及其他哺乳动物体内胃肠道内的低多样性与若干生理 性扰乱的状况之间似乎存在一种联系。

已知使用抗生素降低了胃肠道内的细菌多样性。由于抗生素的使用 在世界范围是巨大的，在技术领域内确实存在一种需要来提供新颖的方 法以便克服在胃肠道内的低多样性的这个问题，所述低多样性影响人类 的总体健康。

另外普遍已知在发达国家中人类的生活方式引起许多不健康的障 碍以及状况，诸如由于例如压力与超重而引起的心血管疾病。已知患有 这些障碍以及状况的人通常在胃肠道内具有低细菌多样性。

因此，在本技术领域内存在一种需求来克服生理性扰乱的状况的问 题，这些状况关系到个体的胃肠道内的低多样性或由其引起。

WO 01/11077A2披露了诊断或治疗过敏性肠综合征以及其他由小 肠细菌过度生长(SIBO)所引起的失调的方法，它们是通过给予抗微 生物的药剂或益生菌药剂，例如双岐杆菌属、或乳杆菌属的一个种，或 通过采用促运动的药剂使肠的运动正常化。

发明概述

以上提及的问题是通过本发明得以解决的。

在一方面中，本发明涉及植物乳杆菌的一种菌株用于制造增加胃肠 道菌群多样性的一种组合物的用途，这是通过将所述菌株给予一位个 体，其目的在于产生一个与安慰剂相比的增加的多样性指数差异。

在另一个方面中，本发明涉及植物乳杆菌的一种菌株用于制造一种 组合物的用途，该组合物用于健康个体的预防性治疗以防止其发展成低 细菌多样性(LBD)；用于一个患有LBD的个体的预防性治疗以防止其 发展成生理性扰乱的状况、大肠细菌的过度生长(LIBO)、或小肠细菌 的过度生长(SIBO)；以及用于一个患有LIBO或SIBO的个体的预防 性治疗以防止其发展成一种或多种生理性扰乱的状况。

本发明进一步涉及一种用于增加胃肠道菌群多样性的方法，这是通 过将植物乳杆菌的一种菌株给予一位个体来产生与安慰剂相比的一个 增加的多样性指数差异。

本发明还涉及通过改善和/或增加细菌多样性并在肠道内根除小肠 细菌过度生长(SIBO)和/或大肠细菌过度生长(LIBO)而对一种或一 组生理性扰乱的状况进行的治疗，该生理性扰乱的状况是基于一位个体 的胃肠(GI)道内的低细菌多样性(LBD)，可任选地是通过小肠细菌 过度生长(SIBO)和/或大肠细菌过度生长(LIBO)所引发。

此外，本发明还涉及一种植物乳杆菌菌株，该菌株在产生如权利要 求1至13中的任何一项所限定的增加的多样性指数差异中使用和/或在 如权利要求14至25中的任何一项所限定的预防性治疗中使用。

附图简要说明

图1描绘了从人类粘膜扩增的HaeIII消化的16S rRNA基因的 T-RFLP特征。

发明详细说明

完全出人意外的是根据本发明给予植物乳杆菌的单一菌株增加了 胃肠道的多样性，即通过仅给予一种单一的菌株就增加了胃肠道内的不 同类型的细菌的总数目。这样不只是增加了观查到的所给予的菌株的 量，而且还增加了其他的细菌类型。此外，所述单一的植物乳杆菌菌株 的给予和集群现象为新的细菌群的生长打开通道，这些新的细菌群以前 未能在该个体的胃肠道中生长。这与本领域内已经提出的理论形成对 照，在本领域内已经提出只有不同菌株的一个混合物能够在胃肠道内提 供多种菌株的一种混合，即增加的多样性。这样，鉴于这种生物多样性 被由此降低的假定，在本技术领域中经常反对仅给予一种单一的菌株。 换句话说，给予不同类型细菌的混合物的主要的理由在于这些混合物满 足了多样性的要求。

因此，完全出乎意外的是根据本发明仅给予植物乳杆菌的一种单一 的菌株就提供了增加的多样性。

如上所述，患有如以下限定的一种或多种不同的生理性扰乱的状况 的个体经常同时显示LBD(低细菌多样性)，这或者是在该扰乱的状况 背后的一个原因或者是由这些扰乱的状况所引起。这样的LDB不应当 被认为是一种普通的疾病情况，但是随着时间可能导致生理性扰乱的状 况，包括不同的疾病或LIBO(大肠细菌过度生长)或SIBO(小肠细 菌过度生长)。虽然LIBO和SIBO并非一定是LBD的结果，但通常是 这种情况。一个患有LIBO或SIBO的个体也自动地患有在胃肠道内的 LBD。LIBO与SIBO是本身也不被认为是普通的疾病情况，但是各自 涉及了发展成若干生理性扰乱的状况的一种相当大的风险，这些状况包 括如以下限定的不同的疾病，例如易位。LIBO和SIBO也许可替代地 是不同的生理性扰乱的状况的一种后果。可以将根据本发明的组合物给 予一个健康的个体，用于防止其发展成LBD的预防性治疗。此外，也 可以将所述组合物给予一个患有LBD(不管LBD的起因如何)的个体， 用于防止发展成一种或多种生理性扰乱的状况(SIBO或LIBO)的预 防性治疗。另外，所述组合物可还可以被给予一个患有LIBO或SIBO (不管其起因如何)的个体，用于防止发展成一种或多种生理性扰乱的 状况(例如易位)的预防性治疗。在另一个实施方案中，患有LDB和/ 或SIBO和/或LIBO并且同时还遭受一种或多种以上提及的生理性扰乱 的状况的个体可以经历用所述组合物给药，目的在于增加在胃肠道内的 细菌多样性并且由此改善该个体的整体健康状况，可任选地还减轻所述 一种或多种生理性扰乱的状况的作用。

所观查到的与本发明相关的增加的多样性可以用一种多样性指数 的形式来衡量，该多样性指数是通过众所周知的T-RFLP方法使用 HaeIII酶来剪切并且计算以下所说明的Shannon-Weaner以及Simpson 指数进行测量。当使用Shannon-Weaner指数时，所述增加的多样性指 数差异至少是0.15，优选是0.30，更优选是0.45，并且甚至更优选是 0.60。

当使用Simpson多样性指数时，所述增加的多样性指数差异至少是 0.02，优选是0.04，更优选是0.06，并且甚至更优选是0.08。

多样性指数差异(Didiff_total)的计算是通过以下步骤完成：在第 一步中，计算服用包含植物乳杆菌的一种菌株的产品的个体的多样性差 异(Didiff)，即摄取菌株之后的多样性指数的值(Diafter_product)减 去摄取菌株之前的多样性指数的值(Dibefore_product)，除以服用该产 品的个体的数目(nproduct)。此后，在上述第一步所获得的值减去安 慰剂所获得的多样性差异(Diplacebo_total＝Diafter_placebo- Dibefore_placebo)除以nplacebo，这是服用该安慰剂的个体的数目。 用于多样性指数差异的等式如下：

Didiff_total＝∑(Diafter_product-Dibefore_product)/(nproduct)- ∑(Diafter_placebo-Dibefore_placebo)/(nplacebo)

当然多样性指数可以通过其他巳知的方法来测量，并且本领域的技 术人员知道这些其他巳知的方法会是什么。此外，用来剪切的酶HaeIII 可以被任何其他的巳知的酶替代。

鉴于根据本发明在胃肠道内提供的增加的多样性指数，人类的总体 健康也许会变得更好。上述已经讨论到许多生理性障碍与低多样性指数 有关。通过能容易地服用以一种固体或液体配制品的形式(例如以下所 讨论的一种食物产品)的植物乳杆菌的一种菌株，有助于个体保持健康。

此外，在此所提供的增加的多样性指数抵消了现代社会以及福利国 家的负面效应。例如，如以上所讨论，世界范围服用巨大数量的抗生素 打破了胃肠(GI)道内的平衡。通过给予根据本发明的植物乳杆菌的一 种菌株，这一被打破的平衡也许会再次变得正常和健康。

此外，人们相信现代社会的许多生理性扰乱的状况可以通过持续摄 取根据本发明的植物乳杆菌的一种菌株而得以防止。

在本发明的一个实施方案中，所述组合物是一种液体配制品或一种 固体配制品，其中所述固体配制品是选自下组，其构成为：片剂、含片、 糖果、咀嚼片剂、口香糖、胶囊、小药囊、粉末、粒剂、包衣颗粒和包 衣片剂、肠溶的包衣片剂和胶囊、以及可溶性条(melting strip)以及 薄膜，并且所述液体配制品选自下组，其构成为：口服液、悬浮液、乳 剂、以及糖浆剂。本发明的组合物可以根据任何常规方法给予。然而， 本菌株优选是口服施用。

在本发明的一个实施方案中所述组合物包括一种运载物质，其中所 述运载物质是独立地选自下组，其构成为：燕麦片粥、乳酸发酵食品、 抗性淀粉、膳食纤维、碳水化合物、蛋白、以及糖基化蛋白。

在本发明的一个实施方案中，所述组合物是一种医药食品、一种功 能性食品、一种膳食增补剂、一种营养产品或一种食物制品。这样，该 植物乳杆菌菌株能以许多不同的形式被给予这些个体。所述食物制品可 选自下组，其构成为：饮料、酸奶、果汁(juices)、冰淇淋、面包、饼 干、谷类、健康食品棒(health bars)、以及涂抹酱(spreads)。这样， 在此认识到该组合物也许可以在日常的生活里以食物产品的形式容易 地服用。这样，通过使用根据本发明所述的组合物，人类的总体健康会 变得更好。

该植物乳杆菌的菌株是以下述量存在于该组合物中：大约1×10⁶至大约1×10¹⁴CFU(菌落形成单位)、优选是从大约1×10⁸至大约1× 10¹²、并且更优选是从大约1×10⁹至大约1×10¹¹。

本申请正文通篇所使用的表述“与安慰剂相比的增加的多样性差 异”是指被给予该植物乳杆菌菌株的个体的细菌多样性变化与其他的个 体进行比较(在本研究的期间给予一种类似的产品，但是没有该植物乳 杆菌菌株)。这些类型的研究是采用盲法，即在研究期间不论是志愿者 还是撑握本研究并分析结果的人员都不知道哪些个体得到安慰剂、以及 哪个得到治疗产品。这消除了许多误差来源以及错误的结果。

在本申请正文通篇所使用的表述“大肠细菌过度生长(LIBO)”是 指一种或一些细菌类型在大肠的细菌菌群里高度占据优势，即它们以比 大多数其他类型的细菌高很多的数目存在。

在本申请正文通篇所使用的表述“小肠细菌过度生长(SIBO)”是 指一种或一些细菌类型在小肠的细菌菌群里高度占据优势，即它们以比 大多数其他类型的细菌高很多的数目存在。

本申请通篇所使用的表述“低细菌多样性(LDB)”是指在一位个 体的胃肠道内一种失衡的细菌组合物，根据Shannon-Weaner多样性指 数它可能被定义为至少0.15的多样性指数差异或根据Simpson多样性 指数被定义为至少0.02的多样性指数差异。应当注意到有时在本申请 正文中所使用的术语“多样性”是旨在表示“细菌多样性”。

本申请正文通篇所使用的表述“生理性扰乱的状况”是指任何不希 望有的健康状况或由于LDB的存在和/或LIBO或SIBO的存在或与之 相关的状况，诸如胃肠机能紊乱，例如易位、克罗恩病、溃疡性结肠炎、 过敏性肠综合征、以及由于抗生素摄取的不希望的状况。此外，LDB、 SIBO、以及LIBO可以是形成冠状动脉失调、非酒精性脂肪肝、2型糖 尿病、过敏、异位性湿疹、以及自身免疫疾病的负面因素。

本申请正文通篇所使用的表述“增加胃肠道的多样性”是指在胃肠 道内微生物的增加的菌群是以存在不同类型细菌的形式来获得的。这意 味着减少了某些负面性的细菌的“过度生长”的风险，从而导致个体的 更好的总体健康。这样，根据本发明减少了在胃肠(GI)道内的某些细 菌的过度生长。由此提供了一种令人希望的平衡。

多样性指数是通过T-RFLP方法使用HaeIII酶切割并且计算 Shannon-Weaner多样性指数以及Simpson多样性指数而进行测量。

如上所述，本发明还涉及通过改善和/或增加细菌多样性以及在肠 道内根除小肠细菌过度生长(SIBO)和/或大肠细菌过度生长(LIBO) 而对一种或一组所述生理性扰乱的状况进行的治疗，这些生理性扰乱的 状况是基于一位个体的胃肠(GI)道内的低细菌多样性(LBD)，可任 选地是通过小肠细菌过度生长(SIBO)和/或大肠细菌过度生长(LIBO) 所引发。LBD是通过摄入选自下组的植物乳杆菌的一种菌株来治疗的， 该组的构成为：植物乳杆菌299，DSM 6595、植物乳杆菌299v，DSM 9843、植物乳杆菌HEAL-9，DSM 15312、植物乳杆菌HEAL-19，DSM 15313，以及植物乳杆菌HEAL-99，DSM 15316。

植物乳杆菌是在庞大的并且相对多样的乳杆菌属中的一个细菌的 种，该属包括大约90个有效命名的种或亚种。按照传统，乳杆菌 (Lactobacillus spp.)根据其发酵能力已被分成三个功能群：专性同型 发酵的(I群)、兼性异型发酵的(II群)、以及专性异型发酵的(III 群)。I群专门将己糖类发酵成乳酸，并且不能发酵葡萄糖酸盐或戊糖类； 而II群也使己糖发酵成乳酸但是另外能够发酵戊糖类和/或葡萄糖酸 盐。III群将己糖发酵成乳酸、乙酸、和/或乙醇、以及二氧化碳。植物 乳杆菌是兼性异型发酵的。植物乳杆菌的典型菌株是ATCC 14917。

植物乳杆菌在下面几点不同于许多其他的乳杆菌属：

1)植物乳杆菌具有一个相对大的基因组，这表明了适应于许多不 同情况的能力。

2)植物乳杆菌具有一种发酵许多不同的碳水化合物的惊人能力。

3)植物乳杆菌对于锰具有一种高生长需求，并且可以在细胞间积 聚高水平的锰。锰通过将氧基团还原为H₂O₂而为植物乳杆菌提供了一 种抗氧毒性的防护。所产生的H₂O₂于是能够通过锰辅助的假过氧化氢 酶(manganese cofactored pseudocatalase)被转变成O₂以及水。

4)植物乳杆菌具有一种对于低pH的高耐受性。植物乳杆菌经常 在自然产生的乳酸发酵食品(其中pH通常低于4.0)中占优势地位并 且还穿过人类胃的酸性条件而生存的事实表明它对于酸性条件的高抵 抗力。

5)植物乳杆菌可以具有鞣酸酶活性并且也能代谢酚酸类。

植物乳杆菌经常在大多数乳酸发酵的食品中以高数目自然地存在， 尤其当该食品是基于植物材料时，例如在腌制的橄榄、续随子(续随子 浆果)、德国泡菜、咸小黄瓜、酵母面团、尼日利亚ogi(由玉米或高粱 制成)、埃塞俄比亚的kocho(由来源于阿比尼西亚象腿蕉(ensete ventricosum)的淀粉制成)、由画眉草(Eragrostis tef)制成的埃塞俄 比亚的酵母面团、以及木薯中。这样，显而易见的是吃下植物来源的乳 酸发酵产品的个体也吃下了大量植物乳杆菌。此外，植物乳杆菌存在于 葡萄汁以及葡萄酒中。植物乳杆菌经常出现在从口腔到直肠的人类胃肠 粘膜上[Molin，G.，Jeppsson，B.，Ahrné，S.，Johansson，M.-L.，Nobaek，S.， M.，and Bengmark，S.(1993).Numerical taxonomy of Lactobacillus spp.associated with healthy and diseased mucosa of the human intestines，J.Appl.Bacteriol.74：314-323；Ahrné，S.，Nobaek，S.， Jeppsson，B.，Adlerberth，I.，Wold，A.，and Molin，G.(1998).The normal Lactobacillus flora of healthy human rectal and oral mucosa，J.Appl. Microbiol.85：88-94)]。所以，显而易见的是物种植物乳杆菌具有与人类 食物以及人类肠道方面有关的一种独特的地位，并且考虑到人类自起源 时就已经在吃乳酸发酵食品(因为如果植物材料被压入一个封闭的区 域，例如在土地中的一个坑中，这是一种自发过程)，可以理解的是在 这些环境中自然地占优势的一种生物也要在人类肠道内起一种关键性 的作用。

实例

多样性的测量

末端限制性片断长度多态性(T-RFLP)分析是基于荧光末端标记 的PCR产物的限制性内切核酸酶消化的一种群落指纹法，并且它揭示 已知和未知的细菌群两者的信息。T-RFLP模式是在一系列步骤中产生 的：简言之，直接从样品中提取出群落DNA。相关基因是使用引物(其 中之一是荧光标记的)经PCR扩增的。在纯化后，用一种限制性内切 核酸酶(通常是一种4-碱基切割酶)消化该PCR产物。将消化产物与 一种用荧光标记的DNA大小标准品相混合，然后通过电泳(使用凝胶 或者基于毛细管的系统(配备有一种激光探测器这样只有荧光标记的末 端片段是可见的))分离这些片段。来源于这种分析的结果处于两种形 式：1)将一个细菌菌群的特征显示为一系列具有不同高度的峰值的一 种电泳图谱，2)从一个自动化片段分析程序中产生的表格，该表格最 重要地包括每个峰值在碱基对中的大小以及高度(或面积)。在样品之 间的T-RFLP特征能够通过使用统计学的方法从数字上进行比较。一些 统计学的方法已经被用于比较微生物的群落。

近年来在生态学研究中微生物群落的T-RFLP分析已经变得使用 得越来越多。它是可重复的并且给出高分辨率。

结果

受试者以及样品采集

这些受试者全部是男性，除了患有一种已确定的控制良好的心血管 疾病之外身体状况良好。他们在食入试验溶液四周之前以及之后经受了 柔性乙状结肠镜检查。按照一种标准化方式从较低的乙状结肠的粘膜进 行活组织检查供进一步分析。

在多样性评估中包括16位志愿者，这些自愿者来源于一个随机化、 双盲、安慰剂对照的研究中所包括的受试者的一个更大的同龄组。九个 受试者每天消耗100ml治疗产品达四周，相当于每天摄取10¹¹菌落形 成单位的植物乳杆菌。七个受试者每天消耗100ml类似的产品(但不 含细菌)达四周。

DNA提取

将该粘膜的活组织在超声波浴中处理5分钟，然后涡旋2分钟。将 样品转入紫外线(UV)处理过的1.5ml管并且以9,000rpm离心7分 钟。将380μl缓冲液G2以及30μl的Proteinas K(Qiagen，Hilden， 德国)加至该沉淀部分。将该样品在56℃水浴中处理直到全部溶解。 在一个Eppendorf Mixer(型号5432，Eppendorf，Hamburg，德国) 中在4℃条件下通过将该悬浮液与12至15个玻璃珠(直径为2mm) 一起震动45分钟将其进一步分解。在以5,000rpm离心一分钟之后， 将上清液转入两个不同的2ml样品管(在每个管中200μl)。在具有EZ1 DNATissue Card以及EZ1 DNATissue Kit的EZ1(Qiagen， Hilden，德国)中根据制造商的说明书完成进一步的纯化。将DNA以 200μl洗脱。

PCR扩增、纯化、以及浓度的测量

将16S rRNA基因用在5′端以Cy5做荧光标记的通用的正向引物 Cy5-ENV1(5′-AGA GTT TGA TII TGG CTC AG-3′)，以及反向引物 ENV2(5′-CGG ITA CCT TGT TAC GAC TT-3′)进行扩增，这两种引 物分别以8至27bp和1511至1492bp退火。该PCR反应混合物在50 μl的最终体积中包含0.2μM的每种引物、0.2mM的每种脱氧核糖核苷 三磷酸(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)、5μl的10x PCR反应 缓冲液(100mM Tris-HCl，500mM KCl，pH 8.3)、2.5U/μl Taq聚合 酶(Roche Diagnostics，Mannheim，德国)以及0.2至10μl的模板。 用以下程序在一个Eppendorf Mastercycler  (Hamburg，德国)中完 成扩增：在94℃下3分钟，一个循环；随后在94℃下1分钟，32个 循环；50℃达45秒以及72℃达2分钟，另外在72℃延伸7分钟。

将PCR产物(5μl)用溴化乙锭染色后，在1x TBE缓冲液(89mM Tris，89mM硼酸，2.5mM EDTA)中的1.5％(w/v)的琼脂糖凝胶 上验证。

收集来自三个反应的PCR产物以降低PCR的偏倚并且获得足够的 DNA用于T-RFLP分析。通过MinElute PCR Purification Kit(Qiagen， Hilden，德国)根据制造商的说明书将这些扩增子纯化。用30μl的无 菌蒸馏水进行洗脱。

通过配有用于Windows^TM的DataMax的FlouroMax-2(ISA Jobin Yvon-Spex Instruments S.A.，Inc.，New Jersey)以荧光光谱法测量纯 化的DNA的浓度，使用嵌入有双股DNA的Quant-iT^TMPico(Invitrogen，Eugen，Oregon，美国)。根据制造商的说明书使用 Quant-iT^TMPico激发是在480nm完成的。

T-RFLP分析

在总体积10μl中将若干等份的200ng纯化的PCR产物分别用15 U的限制性内切核酸酶HaeIII(Sigma-Aldrich，St Louis，美国)在37℃ 消化16小时。在消化之后，通过在65℃加热15分钟将酶灭活。将消 化物与1μl的内部标准品以及装载染料的4μl甲酰胺(3.3μl去离子甲 酰胺，带有5％w/v葡聚糖蓝的0.7μl 25mM EDTA)混合，并且在94℃ 将该混合物变性3分钟，然后立即置于冰上，然后装载到聚丙烯酰胺凝 胶。

该内部大小标准品包含Cy5-ENV1引物(如以上所述20bp)以及 通过使用引物685r(5′-TCT ACG CAT TTC ACC GCT AC-3′；大肠杆 菌编号705-685)和Cy5-ENV1从大肠杆菌ATCC 11775扩增的697bp 的PCR产物。包括ALFexpress Sizer 50-500(GE Healthcare，Uppsala， 瑞典)以及Cy5标记的697bp PCR产物的外部大小标准品被装载在包 含样品的聚丙烯酰胺凝胶上以估计T-RF的长度。将该荧光标记的片段 分离并且用一个配有7％ReproGel Long Read凝胶(GE Healthcare， Uppsala，瑞典)的ALFexpress II DNA测序仪在下列情况进行检测达 700分钟：1500V、60mA、以及55℃。

统计分析

通过使用ALFwin^TMFragment Analyser 1.03程序(Amersham Biosciences，Uppsala，瑞典)估计荧光标记的T-RF的峰面积。在一个 给出的T-RFLP模式内计算了每个T-RF的相对丰度，是用对应的T-RF 的峰面积除以在一个片段长度(在20bp至697bp之间)内所检测的 所有T-RF的总的峰面积。使用以下等式计算Simpson(D)与 Shannon-Weaner(H′)指数：D＝∑pi2并且H′＝-∑ pi ln pi，其中pi 是在该群落中ith峰的相对丰度(Magurran A，1996，Ecological diversity and its measurement，Chapman and Hall，London.)。使用 Simpson的多样性指数(1-D)而不是Simpson指数的初始公式确保了 该指数的值随多样性的增加而增加。对于每一位个体，对处理之前以及 之后的样品计算指数。通过从处理之后的指数中减去处理之前的指数获 得了多样性的差异。使用Mann-Whitney Rank Sum Test(SigmaStat， Systat Software，Point Richmond，美国)检测了在益生素与安慰剂组 中的个体之间的细菌多样性的差异。p值＜0.05被认为有统计学显著性。

当分析来自T-RFLP特征的数据时，发现与接受安慰剂的个体相 比，用植物乳杆菌299v处理四星期的个体的肠内的小生物群的多样性 有统计上显著的差异。限制性内切核酸酶HaeIII被用作切割酶，并且 通过Shannon指数所测量的多样性的平均差异对于益生素组是 0.2305803，而对于安慰剂组是-0.3929243(p＝0.026)。

计算Simpson多样性指数证实了通过给予植物乳杆菌299v有更大 的多样性。HaeIII被用作切割酶，并且结果具有统计上显著的差异，通 过Simpson多样性指数得到的平均差异对于益生素组是0.0367907，而 对于安慰剂组是-0.04792(p＝0.026)。

多样性指数的平均差

  Shannon   Simpson′s   Di_before 299v-Di_after299v  0.2305803   0.0367907   Di_{before placebo}-Di_{after placebo}  -0.3929243   -0.04792   Di_total  0.6235046   0.0847107   Di_total的显著性   P＝0.026   P＝0.026

以上结果显示：在被给予该植物乳杆菌菌株的个体与被给予安慰剂 的个体之间，当给予植物乳杆菌的一种单一菌株时，人类胃肠道的细菌 多样性增加了。