具有共价结合的抗菌剂的聚合物

摘要

一种抗微生物组合物，所述抗微生物组合物包含：共价结合有抗生素的多糖的复合物。一种具有抗微生物组合物的医疗器械，所述抗微生物组合物包含：共价结合有庆大霉素的氧化再生纤维素的复合物。

说明书

技术领域

本发明整体涉及包含共价结合有抗菌剂的聚合物的抗微生物组合物，以及它们用于制备医疗器械的用途。更具体地讲，本发明涉及包含共价结合有抗菌剂的多糖的抗微生物组合物。更进一步来讲，本发明涉及包含共价结合有庆大霉素的氧化再生纤维素(ORC)的抗微生物组合物，其可单独使用或者与医疗器械结合使用。本发明还涉及利用这种具有共价结合的抗菌剂的聚合物的医疗器械。

背景技术

在手术环境中只要使用医疗器械，就会有被感染的风险。对于侵入式或植入式医疗器械，例如静脉内导管、动脉移植物、鞘内分流器或脑内分流器以及假体装置，它们在与身体组织和体液紧密接触的同时形成了病原体进入入口，被感染的风险显著增加。手术部位感染的发生通常与定殖在医疗器械上的细菌有关。例如，在外科手术操作期间，来自周围大气环境的细菌可能会进入手术部位和附着在医疗器械上。细菌可以利用植入的医疗器械作为到达周围组织的途径。这种细菌在医疗器械上的定殖可导致患者感染和发病以及死亡。

已开发了多种用于降低与侵入式或植入式医疗器械相关的感染风险的方法，这些方法是将抗微生物剂整合进医疗器械中。这类医疗器械在使用时有利地提供了有效水平的抗微生物剂。例如，医疗器械可含有诸如β-内酰胺类抗生素、多肽抗生素和喹诺酮类抗生素之类的抗生素。然而，含有抗生素的医疗器械可能会遭受由于抗生素的逐渐释放并随后产生亚致死浓度的这种抗生素而导致的效力丧失。这种亚致死浓度的抗生素将选择抗生素耐药性细菌。例如，尽管β-内酰胺类抗生素已知可有效对抗金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，该菌据信为引起外科感染的最常见细菌物种，但这些抗生素不能有效对抗抗生素耐药性细菌，例如MRSA(甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌)和MRSE(甲氧西林耐药性表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis))。

一种解决该问题的可能方法是利用抗生素和聚合物基底的结合以固定抗生素。具体来讲，如果聚合物基底与抗菌剂共价结合则是有利的。

US20050192547A1公开了一种用于制备含有抗感染聚合物的医疗器械的方法，这通过用抗生素与防腐剂的混合溶液处理医疗制品来实现。抗微生物活性可通过抑菌圈(ZOI)试验来证实。通过组合多种抗生素和防腐剂，可实现对一定范围的细菌的抑制。然而，所公开的方法仅仅是基于制剂在医疗制品上的物理吸收或沉积。显而易见的是，由于器械和抗生素之间不存在共价结合，所提供的活性是短期的。另外，这种方法可能会导致选择抗生素耐药性细菌的潜在风险。

WO2005016972 A1描述了包含通过羧基连接至带正电荷部分的聚合物的抗微生物聚合物材料，以及用于产生这种抗微生物化合物的方法及其用途。同样，由于缺少共价键合，抗生素的释放没有被固定。

对利用共价结合有抗菌剂的多糖的结合体迄今为止还没有报道。因此，需要显示具有持续且长期的抗微生物效力的共价结合有抗菌剂的多糖。

发明内容

本发明涉及抗微生物组合物，该抗微生物组合物包含共价结合有至少一种抗菌剂的多糖复合物。

更具体地讲，本文描述的是包含共价结合有至少一种抗菌剂的多糖复合物的抗微生物组合物，其中多糖为氧化再生纤维素；并且其中抗菌剂为庆大霉素。

附图说明

图1.庆大霉素的结构

图2.庆大霉素与ORC的共价连接

图3.未用庆大霉素处理过的ORC与庆大霉素处理过的ORC的FT-IR比较

图4.M与ORC的共价连接

图5.未用M处理过的ORC与用M处理过的ORC的FT-IR比较

具体实施方式

本发明提供包含共价结合有至少一种抗菌剂的多糖复合物的抗微生物组合物。在一个实施例中，抗微生物组合物包含共价结合有至少一种抗菌剂的多糖复合物，其中该多糖为氧化再生纤维素(ORC)。该复合物通常包含约0.1重量％至约20重量％的抗菌剂。

本发明提供了一种固定抗生素以防止微生物定殖于医疗器械上的有效方法。如果ORC具有共价固定的庆大霉素，则可以制备高杀菌性材料。

如本文所用，术语“复合物”指分子尺度上的紧密混合物，优选在抗菌剂与多糖之间具有离子键合或共价键合。多糖优选包含含羧基的多糖。优选的多糖选自含羧基的纤维素、改性淀粉、氧化再生纤维素、壳聚糖、瓜尔胶、聚糖、半乳聚糖、葡聚糖、黄原胶、褐藻酸、聚甘露糖醛酸、透明质酸、聚葡糖醛酸和聚古洛糖醛酸、甘露聚糖、糊精、环糊精和它们的混合物，以及其他合成的羧化多糖或天然存在的羧化多糖，其可以为直链或支链的。多糖可以是与蛋白质、脂质或其他分子相关联的呋喃糖或吡喃糖，并且可包括藻多糖、植物多糖、细菌多糖以及粘多糖、肝糖、果胶、糖蛋白和糖脂质。透明质酸、胶凝糖、黄原胶、琥珀酰聚糖、果胶、氧化再生纤维素、硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素、皮肤素是优选的羧化多糖实例。氧化再生纤维素是最优选的。

氧化纤维素可通过(例如)用四氧化二氮使纤维素氧化而产生。该过程使糖残基上的伯醇基团转化成羧酸基团，在纤维素链内形成糖醛酸残基。优选的氧化纤维素氧化再生纤维素(ORC)可通过氧化诸如人造纤维之类的再生纤维素而制备。ORC具有止血性质为人所知已有一段时间了。自1950年以来，ORC就已作为称作“SURGICEL”的止血产品(Johnson& Johnson Medical，Inc.的注册商标)获得，该产品通过氧化针织人造纤维材料产生。

根据本发明，通过共价化学键合使抗生素固定至器械上以便以很确定的方式实现抗微生物活性，如图2中所示。

抗生素的共价连接是以这样的方式进行：尽管进行了化学键合，但这些试剂的抗微生物活性仍然保持有效。通过将庆大霉素共价连接至氧化再生纤维素(ORC)对该方法的有效性进行了论证。证实了这种修饰的ORC的抗微生物活性。与抗生素的游离形式相比，抗生素的共价固定提供了使细菌对该试剂的耐药性程度最小并使活性持续时间更长的途经。

具有共价连接的抗生素(例如庆大霉素)的ORC显示出显著增强的对抗广泛类型的细菌的抗微生物活性。庆大霉素通过碳二亚胺偶联反应共价连接至ORC的羧酸。据观察，与单独用庆大霉素溶液处理而未进行化学反应的ORC相比，这样处理过的ORC的抗微生物活性更大并且是长效的。

将庆大霉素通过碳二亚胺偶联反应共价连接至ORC。将产物在接受抗微生物活性测试之前进行充分洗涤。估算出ORC上的庆大霉素载荷为约12％。如通过FT-IR分析所证实的，处理过的ORC显示出羧酸官能团丧失和新形成的酰胺官能团。

新形成的固定的共价结合的ORC-庆大霉素(ORC-GM-CVB)表现出显著的体外抗微生物效力。如下面实例中所述，对数减少测定法显示细菌计数有2至5个数量级的减少。在相同条件下，未处理过的ORC显示细菌计数没有减少。

在另一方面，本发明包括制造的制品，该制品是包含本文所述抗微生物组合物的医疗器械。在一个实施例中，抗微生物组合物可用于(例如)通过纺丝、模铸、造模或挤出来形成制品或制品的部分。

抗微生物组合物可用于制造医疗器械，包括但不限于纤维、网片、粉末、微球、薄片、海绵体、泡沫材料、织物、无纺物、织造垫、膜、缝合锚钉器械、缝线、U形钉、手术用平头钉(surgical tack)、夹片、板与螺丝钉、药物递送装置、防粘隔板(adhesion prevention barrier)和组织粘合剂。

医疗器械可单独由一种或多种本发明抗微生物组合物构成，或者由一种或多种本发明抗微生物组合物与其他聚合物组分的组合构成。

虽然下面的实例说明了本发明的某些实施例，但它们不应该理解为限制本发明的范围，而应该理解为有助于完善对本发明的描述。

实例1(创新性)ORC-庆大霉素(ORC-GM-CVB)化合物的制备

材料

所有材料均购自Sigma-Aldrich并且可以直接使用，氧化再生纤维素(ORC)织物除外，其可以商品名得自Ethicon，Inc.。庆大霉素以硫酸盐形式从Sigma-Aldrich作为类似物的混合物获得，如图1所示。

步骤

合成在图2中示出。

将ORC织物切成重0.25g的1″的条带。将切好的ORC带在室温下于真空中干燥过夜。将干燥过的ORC带置于20ml小瓶中的庆大霉素溶液(5ml)中。加入0.080克1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺(EDC)并在N₂气氛下密封该反应瓶。在室温下，将反应瓶保留在摇动器上过夜。

将ORC织物从反应混合物中取出，用大量流动的去离子(DI)水冲洗，在摇动器上浸没在50ml DI水中30分钟以及浸没在50ml甲醇中30分钟。将处理过的ORC织物在真空中干燥2小时。获得0.28克浅黄色的处理过的ORC织物。利用FT-IR比较处理过的ORC样品和未处理过的ORC样品。

在图3中，未处理过的ORC在3383cm^-1(羧酸质子)和1728cm^-1(羧酸羰基)处的FT-IR信号表明存在游离羧酸官能团。在ORC与庆大霉素发生化学反应后，在3383cm^-1和1728cm^-1处的信号消失，而在1595cm^-1处出现新的信号，其指示在ORC羧酸官能团和庆大霉素的胺官能团之间形成了新的酰胺键。

上述观察证实庆大霉素成功地与ORC共价连接。

实例2(有创新性)

进行下列研究来证明共价结合的庆大霉素保持了抗菌效力(表1)。

将如下两份样品用于该研究：

1.未处理过的ORC织物

2.ORC-GM-CVB：根据实例1制备的共价结合有庆大霉素的ORC织物

为了获得表1中的结果，通过对数减少测定法测试试验制品的体外效力。为了证明共价结合的GM的效力，在盐水中提取试验制品以在使用前除去庆大霉素。试验制品为每片约4.0mg的正方体，将试验制品在37℃下在每片试验制品40ml的无菌盐水提取1小时，同时摇动(100rpm)，连续进行两次。提取后，通过对数减少测定法评估试验制品的效力。

在对数减少测定法中，用试验制品表面上约1-2×10e4CFU的细菌测试试验该制品1小时。为方便测试共价结合有庆大霉素的试验制品的表面的效力，给每片试验制品提供10ul的种菌，该体积相对于试验制品来说较小使得种菌能被试验制品完全吸收，这样种菌处于试验制品表面上。种菌在20x磷酸钾缓冲液中制备，该缓冲液使试验制品的pH保持接近中性。在中性pH下ORC的抗微生物效力将会变得最小，从而对数减少将指示庆大霉素的抗菌效力而非ORC的抗菌效力。测试后，将试验制品浸入盐水中，摇动以移出存活的细菌，并通过平板计数测量存活的细菌。平板计数在胰蛋白胨大豆琼脂中以及在37℃下孵育24小时进行。

表1中的数据显示，在两次连续提取后共价结合有庆大霉素的ORC(ORC-GM-CVB)表现出良好的体外效力，对数减少为2.8，而在相同测试条件下未处理过的ORC织物未显示出对数减少。该结果表明，庆大霉素共价结合至ORC织物并保持其抗菌效力。

表1.共价结合有庆大霉素的ORC(ORC-GM-CVB)的效力

^*对数减少＝种菌的log CFU-处理过的样品的log CFU

实例3(比较例)M与ORC的共价连接

材料

除非另外指明，否则所有材料均购自Sigma-Aldrich并可直接使用。M(聚季铵盐1)从Stephen公司(Maywood，NJ)作为32％的水溶液获得(批号为5572-c)并可直接使用。氧化再生纤维素(ORC)织物可以商品名获自Ethicon，Inc.。

步骤

合成在图4中示出。

将ORC织物切成重0.25克的1″的条带。将切下的ORC带在室温下于真空中干燥过夜。

将干燥的ORC带置于100ml RBF中的M溶液(40ml)中。将0.32克1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺(EDC)与5ml水混合并通过玻璃吸管逐滴加入至反应混合物中。

将反应混合物用N₂封闭并在室温下保留在摇动器上过夜。

从反应混合物中取出ORC片，用大量流动的DI水冲洗，在烧杯中的150ml水中搅动浸湿30分钟以及在100ml甲醇中搅动浸湿30分钟。将处理过的ORC织物在真空中干燥2小时。

干燥后，获得1.07克淡黄色的处理过的ORC。共价结合至ORC的M(ONM)的量为约7％。将FT-IR用于比较处理过的ORC样品和未处理过的ORC样品。

在图5中，如在1603cm^-1处的信号所指示的，FT-IR数据证实ORC与ONM之间形成了共价键。

实例4(比较例)

下面的研究表明，共价结合至ORC的M(ONM)丧失了抗菌效力(表2)。通过对数减少测定法来测定来自实例3的共价结合至ORC的ONM样品(ORC-ONM-CV)的体外效力。在对数减少测定法中，用试验制品表面上约1-2×10e4 CFU的细菌测试试验制品(每片约4.0mg的正方体)1小时。为方便测定共价结合有ONM的试验制品的表面的效力，给每片试验制品提供10ul的种菌，该体积相对于试验制品来说较小使得种菌能被试验制品完全吸收，这样种菌处于试验制品表面上。种菌在20x磷酸钾缓冲液中制备，该缓冲液使试验制品的pH保持接近中性。在中性pH下ORC的抗微生物效力将变得最小，从而对数减少将指示ONM的抗菌效力而非ORC的抗菌效力。测试后，将试验制品浸入盐水中，摇动移出存活的细菌，并通过平板计数测量存活的细菌。平板计数在胰蛋白胨大豆琼脂中，在37℃下孵育24小时进行。在该测定法中包括阳性ONM对照，以说明游离形式的ONM确实具有对抗测试用细菌的效力。

表2.共价结合有M(ONM)的ORC的效力

^*对数减少＝种菌的log CFU-处理过的样品(种菌下面的三个样品)的log CFU