文心兰花梗芽组培用的培养基和组培苗繁殖方法

摘要

本发明公开了一种文心兰组培用的培养基及组培苗繁殖方法。这种培养基的主要特征是，其大量元素成分的浓度组合是现有文心兰组培用的培养基中没有的。文心兰组培苗繁殖方法包括：利用上述培养基诱导花梗芽产生愈伤组织及其原球茎的分化，该原球茎萌发形成具有假球茎的组培苗后，将其转移到生根培养基中，诱导生根，然后用常规组培苗移栽方法将生根组培苗移栽到基质中。采用本发明提供的技术方案，以文心兰杂种品种花梗芽为外植体，通过原球茎分化途径快速繁殖文心兰种苗，加快文心兰种苗的繁殖速度。

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物生物技术中组培苗(试管苗)繁殖技术，具体而言，涉及一种文心兰组培用的培养基及组培苗繁殖方法。

技术背景

文心兰是兰科文心兰属(Oncidium)植物的总称，该属植物原生种多达几百种，但用于观赏的种类仅有几个。通过种间或与邻近属间种类的杂交，现已培育出众多观赏价值高和商业价值大的杂交品种，尤其是罗汉文心兰(Onc.Aloha Iwanaga)，蜜糖文心兰(Onc.Swcct Sugar)，罗斯文心兰(Onc.Gower Ramsey)，金西文心兰(Onc.Kinsei)，沃尔卡诺女王文心兰(Onc.Volcano Queen)和香水文心兰(Onc.Sharab baby“sweetfrance”)在我国花卉市场倍受青睐，是我国兰花产业的重要组成部分。

文心兰传统的繁殖方法是分株或播种繁殖，由于分株繁殖系数低，且播种的实生苗变异大等缺点，使传统繁殖方法繁殖文心兰不能满足生产的需求。利用组织培养方法开辟了一条既能大量生产文心兰种苗、又能保持该种苗性状稳定的途径。迄今为止，国内外对文心兰组织培养进行了许多研究，分别在诱导文心兰丛生芽、原球茎或类原球茎(曾宋君等，2004，专利号ZL200410077727.6)和体细胞胚胎形成3个方面，开展了文心兰种苗快速繁殖的研究。其中，诱导文心兰培养物形成原球茎或类原球茎的研究备受关注。李文玲(2004)取罗汉文心兰幼苗侧芽的茎尖，培养在添加适宜的植物生长调节剂的MS培养基上，诱导外植体形成类原球茎；崔广荣(2004)在MS培养基上诱导金西文心兰试管苗的茎尖分化为类原球茎；Chen(2000)将蜜糖文心兰花梗节间培养在1/2MS培养基上，诱导花梗形成愈伤组织，再诱导愈伤组织分化为类原球茎；魏翠华(2007)以蜜糖文心兰顶芽和侧芽生长的小苗为材料，研究了改良1号，改良KC，MS培养基对类原球茎分化的影响；杨金凤(2009)、郑维全(2009)各采用1/2MS和MS基本培养基与适宜植物生长调节剂，分别诱导蜜糖文心兰侧芽茎尖分化类原球茎。对于罗斯文心兰来说，侧芽茎尖和带2～3个花蕾的花穗培养在MS培养基上(陈兴贻，1989)，假球茎茎段培养在MS和VW培养基上(Bagde等，1997；Kanika等，2003)，茎尖和带2花芽花梗茎段培养在MS和N₆培养基上(彭晓明等，2000)，茎尖胚性愈伤组织培养在MS培养基上(Jheng等，2006)，无菌幼苗茎尖培养在1/2MS培养基上(张超等，2008)，分别在各培养基中添加适宜的植物生长调节剂诱导下形成类原球茎。

综上所述，通过原球茎或类原球茎途径繁殖文心兰杂种品种所使用过的培养基是VW、改良1号，改良KC、N₆、1/2MS和MS；使用过的外植体多数为幼苗侧芽茎尖、组培苗茎尖，少数为花穗、带花芽花梗茎段和假球茎茎段，而具有100～150朵花的文心兰花梗芽外植体未得到充分利用；研究数据表明文心兰原球茎的增殖率尚低于不定芽的，例如在N₆和MS培养基上不定芽的增殖率高达450％，而原球茎的增殖率较低，为250％(彭晓明等，2000)。明显可见，从利用花梗芽外植体和提高原球茎增殖率方面进行组培技术的改进，可以使提高文心兰通过原球茎繁殖途径繁殖组培苗的效率，促进文心兰种苗的产业化生产。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述现有技术中的不足，而提出一种文心兰杂种品种组培用的培养基及组培苗繁殖方法，使用该培养基及方法繁殖文心兰杂种品种种苗，能诱导罗汉文心兰(Onc.Aloha Iwanaga)，蜜糖文心兰(Onc.Swcct Sugar)和香水文心兰(Onc.Sharab Baby“sweet france”)等品种花梗芽形成愈伤组织及其原球茎的分化，在继代增殖培养过程中，原球茎的增殖可达到5～8倍，同时原球茎相继萌发生长为组培苗。本发明不但减少了因取茎尖外植体引起的母株损失、或减少了从培养组培苗后再取茎尖诱导原球茎的组培环节，而且提高了原球茎的增殖率，加快文心兰组培苗的繁殖速度。

本发明所提供的技术方案是：

一种文心兰花梗芽组培用的培养基，用于诱导花梗芽愈伤组织及其原球茎分化和组培苗的生长，包含下列成分：

(1)大量元素成分

KNO₃，400～800mg/L；(NH₄)₂SO₄，100～300mg/L；Ca(NO₃)₂·4H₂O，200～400mg/L；MgSO₄·7H₂O，150～400mg/L；KH₂PO₄，100～250mg/L；

(2)微量元素成分

FeSO₄·7H₂O，13.9～27.8mg/L；Na₂EDTA·2H₂O，18.65～37.3mg/L；KI，0～0.83mg/L；H₃BO₃，0～6.2mg/L；MnSO₄·4H₂O，11.2～25mg/L；ZnSO₄·7H₂O，4.3～10mg/L；Na₂MoO₄·2H₂O，0.25mg/L；CuSO₄·5H₂O，0.01～0.025mg/L；CoCl₂·6H₂O，0.025mg/L；

(3)有机营养成分

肌醇，500～1000mg/L；烟酸，0.5～5mg/L；盐酸吡哆醇，0.5～1mg/L；盐酸硫胺素，0.1～1mg/L；甘氨酸，2mg/L；

(4)其他有机营养成分：

椰子汁，0～150ml/L；牛肉蛋白胨，0～2g/L；水解酪蛋白，0～0.5g/L；

(5)生长调节剂

α-萘乙酸，0.1～0.5mg/L，6-苄氨基嘌呤，0.5～6mg/L； 6-糠氨基嘌呤，0.5～0.5mg/L；

(6)碳源：蔗糖，10～30g/L；

(7)凝固剂：琼脂，6～7g/L；

最终pH调节为5.6～5.8；

一种文心兰组培苗繁殖方法，包括如下步骤：

(1)诱导花梗芽产生愈伤组织及其原球茎的分化

利用权利要求1或2所述的培养基诱导产生愈伤组织及其原球茎的分化：将营养繁殖的盆栽苗花梗芽在采用配方1配制的培养基上，培养2周左右后，花梗芽产生愈伤组织，随着愈伤组织生长，逐渐分化出原球茎，同时原球茎萌发生长成组培苗(图1)；

(2)原球茎增殖

将上述愈伤组织和原球茎继代到权利要求1或2所述的培养基上，增殖愈伤组织和原球茎，在原球茎增殖过程中部分原球茎萌发生长为组培苗；每6～7周继代一次，按1∶5比例继代增殖培养；

(3)组培苗生根诱导和移栽

将长度3cm以上并具有假球茎的组培苗转移到生根培养基中，经过2～4周培养后，茎基部产生新根，新根生长到2～3cm长时，采用常规组培苗移栽方法将生根组培苗移栽到基质中；

优选地，所述诱导培养基的大量元素成分为KNO₃，550mg/L；140mg/L(NH₄)₂SO₄；Ca(NO₃)₂·4H₂O，236mg/L；MgSO₄·7H₂O，370mg/L；KH₂PO₄，250mg/L；

进一步地，所述的文心兰组培繁殖方法，其中第3步所用的生根培养基为权利要求1培养基中大量元素含量减半的基本培养基成分、萘乙酸0.05～0.2mg/L、蔗糖10～30g/L、琼脂6～7g/L，最终pH值为5.6～5.8。

本发明有如下优点：(1)建立了新的文心兰花梗芽愈伤组织诱导、原球茎分化与增殖，以及组培苗生长的培养基，该培养基中的大量元素成分的浓度组合是现有培养基中没有的；(2)建立了以文心兰花梗芽为外植体的组培苗快速繁殖的体系，比较充分地利用了数量多的花梗芽外植体；(3)利用本发明所述的培养基，可以进行花梗芽愈伤组织的诱导、原球茎分化与增殖，以及组培苗培养；利用该培养基的大量元素含量减半、添加适量萘乙酸，能诱导具有假球茎的组培苗生根形成完整植株。提高了原球茎及其组培苗的增殖倍数，每次继代的原球茎增殖倍数可达到5～8倍；(4)已成功繁殖文心兰3个杂交品种，即罗汉文心兰、蜜糖文心兰和香水文心兰，各品种的原球茎分化和增殖倍数相似。

附图说明：

图1：诱导花梗芽产生的愈伤组织、原球茎和组培苗

具体实施方式

首先配制繁殖文心兰组培苗所需的培养基，培养基采用常规的培养基配制方法，按下列配方分别配制。

愈伤组织诱导和原球茎分化的培养基，其组成为：

大量元素成分：KNO₃，550mg/L；140mg/L(NH₄)₂SO₄；Ca(NO₃)₂·4H₂O，236mg/L；MgSO₄·7H₂O，370mg/L；KH₂PO₄，250mg/L；

微量元素成分：FeSO₄·7H₂O，13.9mg/L；Na₂EDTA·2H₂O，18.65mg/L；KI，0.83mg/L；H₃BO₃，6.2mg/L；MnSO₄·4H₂O，22.3mg/L；ZnSO₄·7H₂O，8.6mg/L；Na₂MoO₄·2H₂O，0.25mg/L；CuSO₄·5H₂O，0.025mg/L；CoCl₂·6H₂O，0.025mg/L；

有机营养成分：肌醇，1000mg/L；烟酸，0.5mg/L；盐酸吡哆醇，0.5mg/L；盐酸硫胺素，0.1mg/L；甘氨酸，2mg/L；

其他有机营养成分：椰子汁，150ml/L；

生长调节剂：α-萘乙酸，0.2mg/L；6-苄氨基嘌呤，4.0mg/L；6-糠氨基嘌呤，2.0mg/L；

碳源：蔗糖，20g/L；

凝固剂：琼脂，6g/L；

最终pH调节为5.6。

愈伤组织生长、原球茎增殖和组培苗生长的培养基，其组成为：

大量元素成分：KNO₃，550mg/L；140mg/L(NH₄)₂SO₄；Ca(NO₃)₂·4H₂O，236mg/L；MgSO₄·7H₂O，370mg/L；KH₂PO₄，250mg/L；

微量元素成分：FeSO₄·7H₂O，13.9mg/L；Na₂EDTA·2H₂O，18.65mg/L；KI，0.83mg/L；H₃BO₃，.6.2mg/L；MnSO₄·4H₂O，22.3mg/L；ZnSO₄·7H₂O，8.6mg/L；Na₂MoO₄·2H₂O，0.25mg/L；CuSO₄·5H₂O，0.025mg/L；CoCl₂·6H₂O，0.025mg/L；

有机营养成分：肌醇，1000mg/L；烟酸，0.5mg/L；盐酸吡哆醇，0.5mg/L；盐酸硫胺素，0.1mg/L；甘氨酸，2mg/L；

其他有机营养成分：牛肉蛋白胨，2g/L；水解酪蛋白，0.5g/L；

生长调节剂：α-萘乙酸，0.2mg/L；6-苄氨基嘌呤，4.0mg/L；6-糠氨基嘌呤，2.0mg/L；

碳源：蔗糖，20g/L；

凝固剂：琼脂，6g/L；

最终pH调节为5.6。

生根培养基为上述大量元素含量减半的基本培养基，其组成为：

大量元素成分：KNO₃，275mg/L；70mg/L(NH₄)₂SO₄；Ca(NO₃)₂·4H₂O，118mg/L；MgSO₄·7H₂O，185mg/L；KH₂PO₄，125mg/L；

微量元素成分：FeSO₄·7H₂O，13.9mg/L；Na₂EDTA·2H₂O，18.65mg/L；KI，0.83mg/L；H₃BO₃，6.2mg/L；MnSO₄·4H₂O，22.3mg/L；ZnSO₄·7H₂O，8.6mg/L；Na₂MoO₄·2H₂O，0.25mg/L；CuSO₄·5H₂O，0.025mg/L；CoCl₂·6H₂O，0.025mg/L；

有机营养成分：肌醇，100mg/L；烟酸，0.5mg/L；盐酸吡哆醇，0.5mg/L；盐酸硫胺素，0.1mg/L；甘氨酸，2mg/L；

生长调节剂：α-萘乙酸，0.1mg/L；

碳源：蔗糖，10g/L；

凝固剂：琼脂，6g/L；

最终pH调节为5.8。

将培养基中的大量元素成分、铁营养成分、其他微量元素成分和有机营养成分分别按10倍、200倍、1000倍和100倍浓度配制成贮备液，同时将所需的生长调节剂配制成1mg/ml的母液，保存在4℃冰箱中。然后按需要量配制各培养基并用1mol/L NaOH调节pH，煮沸后分装到体积为50ml的三角瓶中，在121℃高压灭菌锅中灭菌15分钟，冷却后备用。

取未完全形成花蕾的花梗，流水冲洗30分钟后用洁净滤纸吸干水分，将外植体剪成适当大小置于无菌烧杯中，在超净工作台内进行下述表面消毒。70％乙醇浸泡30秒，再用0.1％HgCl₂处理6～8分钟，消毒过程中间歇摇动烧杯。表面消毒后，用无菌去离子水清洗外植体5次，每次停留时间为3～5分钟，并摇动烧杯充分洗除外植体上残留的消毒液。

将消毒清洗后的花梗，切取长1cm左右、中部有1个芽的花梗茎段，将芽表面的苞片摘除，把带芽的花梗茎段接种到愈伤组织诱导和原球茎分化的培养基上，每个三角瓶中接种3～4个外植体。将接种的外植体放在黑暗条件下培养，培养温度为25±1℃。

接种2周左右，花梗上的芽体部位生长出浅黄色愈伤组织，此时将培养物转移到光照条件下培养，伴随着愈伤组织生长，愈伤组织表面逐渐分化出原球茎，接种培养6～7周后，明显可见愈伤组织表明分化大量的原球茎，而且有的原球茎萌发生长成组培苗。从这以后的培养条件均为：光照强度4000lx，光周期为照光16小时和黑暗8小时，温度25±1℃。

将带有原球茎的愈伤组织继代到愈伤组织生长、原球茎增殖和组培苗生长的培养基上，愈伤组织生长、原球茎增殖和组培苗生长同时进行，有的原球茎上分化出次级原球茎。继代培养6～7周后，原球茎增殖倍数为5～8倍。每6～7周继代一次。

组培苗生长成具有假球茎的组培苗后，从假球茎基本切离组培苗，将其转移到生根培养基中诱导生根。诱导生根后10天左右，假球茎基部生长出新根；当新根生长到2～3cm长时，从培养瓶中取出生根的完整植株，用自来水清洗植株根系上的琼脂，然后用水苔包裹根系并转移到穴盘中，在温室条件下育苗，空气相对湿度为70～90％，温度20～25℃，光照强度3000～5000lx。组培苗移栽成活率在95％以上。