苜蓿木葡聚糖转葡糖苷酶(MtXET)及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了一种苜蓿木葡聚糖转葡糖苷酶(xyloglucan endotransglycosylase，XET)及其编码基因与应用，所述苜蓿木葡聚糖转葡糖苷酶(MtXET)及其编码基因可以用于调节植物的根系发生发展，由此调节提高植物的抗旱和抗寒能力。本发明的苜蓿木葡聚糖转葡糖苷酶在培育根系更加发达的植物品种中具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，更具体地，涉及一种苜蓿木葡聚糖转葡糖苷酶MtXET及其编码基因与应用，特别是可以将该基因用于调节植物的根系发生发展，由此调节提高植物的抗旱和抗寒能力。本发明的苜蓿木葡聚糖转葡糖苷酶及其编码基因在培育根系更加发达的植物品种中具有重要意义。

背景技术

根系发生发展的一个现象就是产生细胞壁重建，促进植物的细胞分裂、器官分化、生长发育等生命过程的进行。细胞的形状、大小，乃至功能都与细胞壁的形态建成和结构有关。植物细胞的初生壁具有韧性的动态结构，主要由纤维素、半纤维素、木质素和结构蛋白组成，其中纤维素微纤丝是细胞壁的主要承载结构。木葡聚糖转葡糖苷酶(XET)是一个新发现的细胞壁代谢酶。其功能是将构成细胞壁微纤丝木葡聚糖的β-1，4糖苷键切断，并将切下的寡聚糖分子转移并重接到同类分子末端，这种功能又被称为切链转移作用。因此XET一经发现在细胞分化、扩展和细胞特化等多方面受到重视，有人甚至认为它可能是植物生长机制中的核心酶。XET还在细胞伸长过程中扮演重要的角色，研究表明，在细胞快速伸长期伴有XET基因的表达，且XET的活性与细胞、组织的伸长呈正相关。XET促进细胞伸长是通过改变细胞壁网络结构引起细胞壁松弛来实现的，在此过程中，木葡聚糖既是供体又是受体。首先，XET内分解木葡聚糖多聚体，使纤维素微纤丝分离，改变木葡聚糖/微纤丝网络结构，导致细胞壁松弛和细胞扩展；随后XET将新形成的还原末端，连接到其它含非还原末端的木葡聚糖多聚体上，使细胞壁恢复其稳定结构。这样，既使细胞壁松弛引起细胞伸长，同时又保持细胞壁的稳定结构和完整性。近来的研究还认为XET在次生壁沉积的早期阶段起作用，可能是加强初生和次生壁之间的衔接。

苜蓿(Medicago truncatula)是极耐寒和耐旱的牧草之一，具有较发达的根系，该植物的木葡聚糖转葡糖苷酶MtXET基因的克隆对培育根系更加发达的植物新品种具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供苜蓿的一种木葡聚糖转葡糖苷酶(MtXET)及其编码基因，该基因在植物根系发生发展中具有调控作用。

本发明提供的1个苜蓿木葡聚糖转葡糖苷酶MtXET，它具有序列表中SEQ ID NO.2的氨基酸序列或将SEQ ID NO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO.2的氨基酸序列相同活性的由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质。

序列表中SEQ ID NO.2的苜蓿MtXET由292个氨基酸组成。

苜蓿木葡聚糖转葡糖苷酶MtXET的编码基因，是下列核苷酸序列之一：

1)SEQ ID NO.1的DNA序列：

2)与SEQ ID NO.1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

SEQ ID NO.1编码苜蓿木葡聚糖转葡糖苷酶MtXET的基因由910个碱基组成。该基因的读码框为自5’端第27到第908位碱基。

本发明所提供的苜蓿木葡聚糖转葡糖苷酶MtXET主要在胚根和肉质根中表达。其编码基因都含有高度保守的糖基水解酶16族(glycosylhydrolase family 16，GH16)和一个氨基酸的C-末端结构域序列，与拟南芥EXGT-A4(内转糖基化酶)的同源性达80％，代表了苜蓿中的一种内转糖基化酶家族。

用本发明所提供的木葡聚糖转葡糖苷酶MtXET的基因，使用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体(这些植物表达载体包括双元农杆菌载体以及用于双子叶植物微弹轰击的载体)转化植株，都可获得根系增强的转基因植株。载体还可包括3’非翻译区域，包含聚腺苷酸信号和任何其它的可效应mRNA加工或基因表达的DNA片段。聚腺苷酸信号引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。3’区域的例子有农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’转录的非翻译区等。本发明的木葡聚糖转葡糖苷酶MtXET基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种强启动子或诱导型启动子。这些启动子很多，如花椰菜花叶病毒(CAMV 35S)和rd29A启动子等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。本发明的3个基因在构建到植物表达载体中时，也可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。这些增强子区域可以是ATG起始密码子和邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的翻译。翻译控制信号和起始密码子可以是天然或合成等多种不同来源的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

本发明还提供木葡聚糖转葡糖苷酶MtXET的基因的RNA干扰(RNAi)表达载体，使用该载体可使根系生长明显停滞，抑制植物的根系发生发展。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，包括加入植物可选择性标记。使用的选择性标记可以是编码对抗生素抗性酶的基因，抗生素包括庆大霉素、潮霉素、卡那霉素等。也可以是产生颜色变化的酶或发光化合物的基因，如GUS、荧光酶，还可以是抗化学试剂(例如除莠剂)的基因。当然，也可以不用任何筛选标记。

携带有本发明木葡聚糖转葡糖苷酶MtXET基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach，1998，Method for PlantMolecular Biology VIII，Academy Press，NowYork，pp.421-463；Geisersonand Corey，1998，Plant Molecular Biology(2^nd Edition))。

可使用包括本发明的木葡聚糖转葡糖苷酶MtXET基因的植物表达载体转化植物宿主(既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等)，培育根系增强的植物品种，由此获得耐寒和/或耐旱的转基因植物品种。

因此，本发明还提供本发明的木葡聚糖转葡糖苷酶MtXET基因在调节(促进或减弱)植物的根系发生发展中的应用。本发明的MtXET基因可以用于促进或减弱植物根系的发展，由此调节(促进或减弱)植物(例如上述单子叶和双子叶植物，例如(蒺藜)苜蓿)的抗旱和抗旱能力。

本发明相应地提供一种调节(促进或抑制)植物的根系生长中的方法，所述方法包括以下步骤：1)构建含有本发明的木葡聚糖转葡糖苷酶MtXET基因的植物表达载体。优选所述载体是双元农杆菌载体以及用于双子叶植物微弹轰击的载体；和2)用构建后的载体(例如通过农杆菌转染法)转染所述植物，获得转基因植物，由此所述植物的根系生长被促进或抑制。所述植物可以是单子叶植物，或双子叶植物，如水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或(蒺藜)苜蓿。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1MtXET基因在细菌中的蛋白表达实验(M：蛋白质Marker；BL21为阴性对照；pRSET：pRSET-B-BL21为含空载体的阴性对照；MtXET：IPTG诱导后的pRS-XET-BL)；

图2MtXET基因在水培、琼脂、沙培和暗培养(琼脂)条件下在胚根(4天)中的RT-PCR表达模式及平均根长(左)及MtXET基因在胚轴(4天)中高丰度表达(右)；

图3基于PCR法构建RNAi载体图释；

图4由长引物PCR法产生反义-spacer-正义结构.(A)所用引物及其产生的长引物、扩增产物示意图；内有白色箭头的黑色矩形(或粗线)代表反义(左箭头)和正义(右箭头)基因片段，灰色矩形(或虚线)代表spacer；(B)连接产物AC的产生.长引物为mpAB(535bp，箭头所指)，AC为加触发引物而产生的特异目的产物(942bp，*所示)，negI为未加模板和触发引物的阴性对照，negII为只加模板而未加触发引物的扩增产物；(C)用引物mpAC+d+a扩增的特异连接产物AD(1436bp，箭头所指)，neg：未加触发引物的阴性对照；(D)AD被插入克隆载体和表达载体的酶切验证图，vecI：pBin438(13kb)，vec II：pGEM-T Easy Vector(3kb).vecI用BamHI/SalI酶切，vecII用EcoRI酶切；

图5过量表达MtXET发夹结构RNA对蒺藜苜蓿根系发展的影响。4-周的蒺藜苜蓿苗，wt：转化了空pBin438作对照；35S：RNAi：转化了pBin438-35S-RNAi；35S：XET：转化了pBin438-35S-XET；

图6SEQ ID NO.1，MtXET的基因序列(基因的读码框为自5’端第27个碱基到第908位碱基)；

图7SEQ ID NO.2，MtXET的氨基酸序列。

具体实施方式

实施例1、苜蓿木葡聚糖转葡糖苷酶MtXET的基因的表达特征MtXET基因克隆的具体步骤：

1.材料预处理：蒺藜苜蓿种子从National Medicago Collection(Australia)购买，置于4℃冷藏一周。取出材料用温水浸泡半小时，置于无菌琼脂培养基上，培养3-5天，选取根长4-5cm的植株，收集材料根系之后，以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。

2.蒺藜苜蓿根RNA的提取：用于Trizol法(Invitrogen)：在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解，在室温15～30℃下放置5分钟；在EP管中，按照每1ml Trizol加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下(15℃～30℃)放置2～3分钟后，12000g(2℃～8℃)离心15分钟；取上层水相置于新EP管中，按照每1mlTrizol加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下(15℃～30℃)放置10分钟，12000g(2℃～8℃)离心10分钟；弃上清，按照每1ml Trizol加1ml75％乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g(2℃～8℃)离心5分钟，弃上清；让沉淀的RNA在室温下自然干燥；用RNase-free/DEPC水溶解RNA沉淀。

3.RT(反转录)：20μl反应体系中加入：上述RNA 1-2μg；4μl dNTP Mix；2μl 10×RT Buffer；1μl RNase Inhibitor；1μl M-MLV Reverse Transcriptase(Ambion)；加入20μl Nuclease-free Water；反应程序：65℃10min，42℃1h；-20℃保存.

4.设计引物：5’CTGTACGCCAGTGGTCGTAC 3’(正向)；5’TCCTGATATCA ACATCGCACTTCA 3’(反向)，并在Invitrogen公司合成。PCR扩增采用20μl PCR反应体系。退火温度为55℃。PCR产物进行电泳分析。测序结果如SEQ ID NO：1所示。将PCR产物克隆到克隆载体pGEM-T Easy Vector(Invitrogen)中，获得重组质粒pGEM-MtXET。

蛋白表达实验

1.原核表达载体的构建：用原核表达载体：pRSET B(Invitrogen)和含XhoI和EcoRI酶切位点的引物；XhoI和EcoRI酶(TaKaRa)；T4DNA ligase(Promega)，TOP10感受态细胞(TianGen)；大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(TianGen).以重组质粒pGEM-MtXET为模板，通过PCR扩增(引物：5’CTGTACGCCAGTGGTCGTAC 3’(正向)；5’TCCTGATATCAACATCGCACTTCA 3’(反向))得到两端带有Xho I和EcoRI酶切位点的MtDREB2A基因全长；将PCR产物用Xho I和EcoRI酶切，并插入同样用Xho I和EcoRI酶切的pRSET B原核表达载体，获得重组表达载体pRS-XET-BL，并进行PCR，酶切和测序验证。经验证的重组质粒pRS-XET-BL用转化TOP 10大肠杆菌的方法转化BL21(DE3)感受态，得到阳性菌株。

2.基因在原核中的诱导表达与电泳：从对照菌和重组菌分别挑取一个菌落，接入5ml含50mg/l Amp的LB液体培养基中，37℃200r/min振荡培养过夜；按1/25比例接种到5ml新鲜LB液体培养基(含50mg/l Amp)中，37℃200r/min振荡培养，OD₆₀₀＝0.2时，加入IPTG至终浓度1mM，37℃诱导后，离心收集菌体，10％SDS-PAGE检测过量表达产物。染色：从电泳装置上卸下玻璃板，用刀撬开玻璃板，将胶放入R250染色液中染色过夜；脱色：将染好色的凝胶再放入脱色液中，一开始脱色时注意换脱色液，脱好色后即可观察、分析并照相。

构建好的重组表达载体pRS-XET-BL被用来转化BL21(DE3)感受态，获得的阳性菌株被用来诱导表达和电泳。电泳结果如图1所示，结果表明，pRS-XET-BL能在大肠杆菌中表达一条约25kD大小的目的蛋白，与目的蛋白条带大小预期一致。

根据对MtXET基因EST的表达特性分析，我们选用蒺藜苜蓿的幼根(培养4天)作为RNA提取材料。培养的方式有：水培、琼脂培养基、沙培(都有上述正常光照)和暗培养。

20μl RT反应和PCR反应体系。退火温度调整为55℃。同时用蒺藜苜蓿Actin(肌动蛋白基因)基因作内对照。扩增该基因的引物为：正向引物：5’CTGTACGCCAGTGGTCGTAC 3’；反向引物：5’TCCTGATATCAACATCGCACTTCA 3’。上述扩增目的基因条带在进行电泳检测。

实验结果(参见图2)表明，在根系快速生长期，MtXET能大量表达，比看家基因Actin基因表达量大得多。同时，在快速生长的上胚轴中也能检测到MtXET的大量表达。

实施例2用基于PCR的方法构建MtXET基因表达载体，用于RNAi法鉴定MtXET基因的功能

RNA干扰表达载体的构建

将改进的基因剪接方法(Ji-Ren Chen，Jing-Jing Lü，Hua-Fang Wang.Rapid and Efficient Gene Splicing using Megaprimer-Based Protocol.MolBiotechnol(2008)40：224-230)用于RNA干扰表达载体的构建。

PCR模板：用已经克隆的MtXET基因(在pGEM-T Easy Vector中，pGEM-MtXET，GenBank序列号DQ855285)；β-glucuronidase/GUS gene，在pBI121中，pBI121-GUS(Clontech)(AF485783，用于spacer(Chuang etal.，2000；Hirai et al.，2007，见后文参考文献列表))。

引物包括四条，一条正向引物，两条中间引物，一条反向引物；增加的限制酶位点用于表达载体连接，下划线表示；虚线代表的是GUS基因序列，其它的为MtXET基因序列。如图3所示。

a：5’CGGGATCCCACAATCTGGTACATGTTCCATAG 3’(含BamHI)

b：5’CAACTTAAAAACAACACAC 3’

c：5’GGTGTGTTGTTTTTAAGTTGTCC3’

d：5’ACGCGTCGACTTCTTGAACACCCTGATTGG 3’(含SalI)

PCR#1-产生含spacer 3’末端的基因PCR产物50μl反应体系包括：1U Pfu DNA聚合酶(Stratagene)，1×反应缓冲液，125μM dNTPs(Tiangen)，5ng DNA模板(pGEM-MtXET)，引物a和b各0.5μM.PCR程序：94℃，5min(一个循环)；94℃，30s；55℃，30s；72℃，1.5min(30个循环)；72℃，7min(一个循环).PCR：T-gradient PCR machine(Biometra，Goettingen，Germany)。目的产物(记为AB)切胶回收定量。

PCR#2-产生MtXET-GUS连接PCR产物50μl反应体系包括与PCR#1相同的酶和buffer，dNTPs；模板，引物列表如下：

PCR程序：94℃，5min(一个循环)；94℃，30s；58℃，30s；72℃，2min(30个循环)；72℃，7min(一个循环).反应在同一PCR仪中.目的产物记为AC，切胶回收定量.

亚克隆和测序验证(可选)为验证目的基因与spacer连接的准确性，对预期大小相符的条带进行亚克隆和测序。但是用Pfu扩增的PCR产物由于Pfu的3’-5’外切酶而成了平末端，需要加A后才能进行TA连接。可以用加A试剂盒进行加A，也可以简单地用以下方法加A：10μl加A反应体系中加1×Taq Buffer；200μM dATP；2U Taq polymerase(Tiangen)；150ng的纯化PCR产物AC。PCR程序为72℃，20-30min，一个循环。然后取3.5μl用于TA连接(Tiangen)，连接产物标记为AC，经PCR或测序验证后用于下一步实验。

PCR#3产生MtXET(反向)-GUS-MtXET(正向)结构50μl反应体系包括：1U Pfu DNA polymerase(Stratagene)，1×reaction buffer，125μMdNTPs(Tiangen)，25ng DNA模板(pGEM-MtXET)，0.5μM引物d，0.05μM引物a，100ng AC.PCR程序：94℃，5min(一个循环)；94℃，30s；58℃，30s；72℃，2.5min(30个循环)；72℃，7min(一个循环).PCR：T-gradient PCRmachine(Biometra，Goettingen，Germany).目的产物(记为AD)切胶回收定量，用于亚克隆和测序(同上).

将经测序验证的AD经BamHI/SalI酶切插入同样经BamHI/SalI酶切的pBin438(Clontech)，获得重组质粒pBin438-35S-RNAi，经PCR、酶切验证后转化农杆菌AGL1(CRC Industries UK Ltd.)用含50mg/l Kan的YEB培养基进行筛选和PCR验证。

用PCR连接方法将反义和正义基因片段连接到spacer(或intron)的形成发夹结构。如图3所示，三个PCR可将反义基因片段、spacer和正义片段剪接在一起.在第一轮PCR，产物AB 3’端带有一段spacer的互补序列，因此，重要的是将引物b设计成一个中间引物，由跨越基因和spacer的两部分组成；第二个PCR，产物AB被用作长引物，用来产生连接产物AC；在第三个PCR，正义片段通过PCR法连接到了spacer上。在连接到植物表达载体后，表达的RNA可形成发夹结构，诱导RNAi的发生，从而导致目的基因沉默。运用这一方法，快速地构建了MtXET基因的表达载体，并且通过测序和酶切验证为正确序列(图4)。

实施例3、用RNAi方法鉴定苜蓿木葡聚糖转葡糖苷酶MtXET的基因对根系发生、生长的影响

MtXET表达载体的构建：

PCR引物中增加的限制酶位点用于表达载体连接，5’CGGGATCCGGACAACTTAAAAACAACACAC 3’(含BamHI位点)；5’ACGCGTCGACATTTATATGTCACGGTCTCTTTTGC 3’(含SalI位点)，PCR模板为含有克隆的MtXET基因的重组质粒pGEM-MtXET；

PCR程序：94℃，5min(一个循环)；94℃，30s；55℃，30s；72℃，1.5min(30个循环)；72℃，7min(一个循环)。将经测序验证的MtXET基因片段经BamHI/SalI酶切插入同样经BamHI/SalI酶切后的pBin438(Clontech)，获得重组表达质粒pBin438-35S-XET，经PCR、酶切验证后转化农杆菌AGL1(CRC Industries UK Ltd.)，用含50mg/l Kan的YEB培养基进行筛选和PCR验证。

将含pBin438-MtXET的工程菌株GV3101转化蒺藜苜蓿根尖。简而言之，就是将长有长约1-2mm胚根的蒺藜苜蓿种子用沾含pBin438空载体、pBin438-35S-XET或pBin438-35S-RNAi的农杆菌GV3101的锋利刀片割伤根尖。共培养3-5天后置于含200mg/l Cef(头孢霉素)的培养基上培养4周，拍照。

如图5所示，利用实施例2构建的MtXET基因的表达载体pBin438-RNAi进行RNAi后，蒺藜苜蓿的根系生长明显受到抑制，而通过转染pBin438-35S-XET来过表达MtXET基因的蒺藜苜蓿的根系生长得到明显促进。

参考文献列表

1.Ji-Ren Chen，Jing-Jing Lü，Hua-Fang Wang.Rapid and Efficient GeneSplicing using Megaprimer-Based Protocol.Mol Biotechnol(2008)40：224-230

2.Chuang C，Meyerowitz E.2000.Specific and heritable genetic interferenceby double-stranded RNA in Arabidopsis thaliana.Proc Natl Acad Sci，USA，97：4985-4990.

3.Hirai S，Oka S I，Adachi E，Kodama H.2007.The effects of spacersequences on silencing efficiency of plant RNAi vectors.Plant Cell Rep，26：651-659.

序列表

<110>北京林业大学

<120>苜蓿木葡聚糖转葡糖苷酶MtXET及其编码基因与应用

<130>IB094074

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>910

<212>DNA

<213>Medicago truncatula

<400>1

ggacaactta aaaacaacac accaaaatga gttcttcatt ttggtcttta tgtttgatct   60

tagcatcact agtttcttct tcactctgtg ctcctccaag gaagccagtt gatgtaccat  120

ttggaagaaa ctattacccc acttgggctt ttgatcatat caaatacttc aatggtggtt  180

ctgagattca acttcatctt gacaagtaca ctggtactgg ttttcagtcc aaaggttcat  240

acttgtttgg tcatttcagt atgaacatta agatggttcc tggtgattca gctggcacag  300

tcactgcttt ctatctatct tcacaaaatg ctgaacatga tgaaatagat tttgagttct  360

tggggaacag aacaggacaa ccttacattt tacaaacaaa tgtgttcact ggtggacaag  420

gtaacaaaga acaaaggatc tttctttggt ttgatcctac aaaggagttt cacagatact  480

ctattctatg gaacatgtac cagattgtgt tttttgtaga tgatgtacca atcagggtgt  540

tcaagaacag caaggactta ggagtgaaat ttccatttga ccaaccaatg aaaatttaca  600

acagtttatg gaatgcagat gattgggcca caaggggtgg attagaaaaa actgattggt  660

caaaagcacc attcatagca ggttacaaaa gtttccacat tgatggttgt gaatcatctg  720

ttaatgcaaa gttttgtgca acacaaggta aaagatggtg ggatcaacct gaatttcgtg  780

atcttgatgc tgctcaatgg cgtagactaa gatgggtgcg ccaaaaatac accatttata  840

actattgcac cgataggaaa cgtttgcctc aaattccacc tgaatgcaaa agagaccgtg  900

acatataaat                                                         910

<210>2

<211>293

<212>PRT

<213>Medicago truncatula

<400>2

Met Ser Ser Ser Phe Trp Ser Leu Cys Leu Ile Leu Ala Ser Leu Val

1               5                   10                  15

Ser Ser Ser Leu Cys Ala Pro Pro Arg Lys Pro Val Asp Val Pro Phe

            20                  25                  30

Gly Arg Asn Tyr Tyr Pro Thr Trp Ala Phe Asp His Ile Lys Tyr Phe

        35                  40                  45

Asn Gly Gly Ser Glu Ile Gln Leu His Leu Asp Lys Tyr Thr Gly Thr

    50                  55                  60

Gly Phe Gln Ser Lys Gly Ser Tyr Leu Phe Gly His Phe Ser Met Asn

65                  70                  75                  80

Ile Lys Met Val Pro Gly Asp Ser Ala Gly Thr Val Thr Ala Phe Tyr

                85                  90                  95

Leu Ser Ser Gln Asn Ala Glu His Asp Glu Ile Asp Phe Glu Phe Leu

            100                 105                 110

Gly Asn Arg Thr Gly Gln Pro Tyr Ile Leu Gln Thr Asn Val Phe Thr

        115                 120                 125

Gly Gly Gln Gly Asn Lys Glu Gln Arg Ile Phe Leu Trp Phe Asp Pro

    130                 135                 140

Thr Lys Glu Phe His Arg Tyr Ser Ile Leu Trp Asn Met Tyr Gln Ile

145                 150                 155                 160

Val Phe Phe Val Asp Asp Val Pro Ile Arg Val Phe Lys Asn Ser Lys

                165                 170                 175

Asp Leu Gly Val Lys Phe Pro Phe Asp Gln Pro Met Lys Ile Tyr Asn

            180                 185                 190

Ser Leu Trp Asn Ala Asp Asp Trp Ala Thr Arg Gly Gly Leu Glu Lys

        195                 200                 205

Thr Asp Trp Ser Lys Ala Pro Phe Ile Ala Gly Tyr Lys Ser Phe His

    210                 215                 220

Ile Asp Gly Cys Glu Ser Ser Val Asn Ala Lys Phe Cys Ala Thr Gln

225                 230                 235                 240

Gly Lys Arg Trp Trp Asp Gln Pro Glu Phe Arg Asp Leu Asp Ala Ala

                245                 250                 255

Gln Trp Arg Arg Leu Arg Trp Val Arg Gln Lys Tyr Thr Ile Tyr Asn

            260                 265                 270

Tyr Cys Thr Asp Arg Lys Arg Leu Pro Gln Ile Pro Pro Glu Cys Lys

        275                 280                 285

Arg Asp Arg Asp Ile

    290