毛细管电泳分离和化学发光检测的微芯片分析系统

摘要

一种集成芯片毛细管电泳分离和化学发光检测的微芯片分析系统，由微流控芯片、单路高压电源、微型真空泵、三通阀、接口、针形调节阀、U型管压力计、光电倍增管、真空瓶、电接点真空表和时间继电器组成。本发明提供的微芯片分析系统，结构简单，电泳分离和化学发光检测互不干扰，兼有毛细管电泳的高分离效率和化学发光法的高灵敏度；具有分离效率高、检测灵敏度高、体积小，重量轻，操作方便、成本低廉等特点，是理想的便携式微芯片分析系统。

说明书

技术领域

本发明涉及微全分析系统，特别是涉及集成芯片毛细管电泳分离和化学发光检测的便携式微芯片分析系统。

背景技术

自从1990年提出微全分析系统概念以来，微流控芯片技术在化学、生命科学、环境科学和食品科学等领域开辟了广阔的发展空间。由于芯片毛细管电泳具有分离效率高、易携带、试剂消耗少、分析时间短等优点，是微芯片分析系统中常用的分离技术。但是芯片毛细管电泳的检测体积小、光程短，与其联用的检测器必需具有极高的灵敏度。

由于激光诱导荧光检测器灵敏度高，与芯片毛细管电泳联用的技术难度小，因此，到目前为止，激光诱导荧光检测器在微流控芯片分析系统中得到广泛应用，它也是目前在商品化微流控芯片分析系统中唯一被采用的检测器。但是激光诱导荧光检测器体积较大，结构较复杂、成本较高，难以微型化。

化学发光检测法，因其无需激发光源、结构简单、灵敏度高和易于微型化等特点，理论上是芯片毛细管电泳最具吸引力的检测方法之一。但是，芯片毛细管电泳需要采用多路电源将皮升级的样品引入微流控芯片的分离通道，进行分离分析。而化学发光法又需要增置额外的注射泵、蠕动泵或电渗流(泵)将化学发光试剂引入检测通道，通过与芯片毛细管电泳分离后的待分析物在检测通道内发生化学发光反应，才能对待测物进行定性定量分析。由于这些泵和多路电源价格昂贵，体积大，从而增加了微芯片分析系统的成本和微型化的难度。且在实验操作时必须严格控制发光试剂的流速和流向，使它不能倒流进入芯片毛细管电泳的分离通道而影响分离效率。但由于微流控芯片的网络结构，操作难度很大。因此，与激光诱导荧光检测器相比较，化学发光检测器在微流控芯片分析系统未得到广泛的应用，也未见集成芯片毛细管电泳分离和化学发光检测的商品化仪器。

发明内容

本发明的目的之一是为了提供一种操作方便、结构简单、体积小和价格低的集成芯片毛细管电泳分离和化学发光检测的便携式微芯片分析系统，目的之二是利用本发明的微芯片分析系统进行毛细管电泳分离和化学发光检测。

本发明提供的集成芯片毛细管电泳分离和化学发光检测的微芯片分析系统，由微流控芯片、单路高压电源、微型真空泵、三通阀、针形调节阀、U型管压力计、光电倍增管、真空瓶、电接点真空表和时间继电器组成；所述微流控芯片中的微通道按功能可分为进样通道，分离通道，鞘流通道和检测通道；进样通道与分离通道相交点和分离通道与鞘流通道相交点之间的通道是有效分离通道，有效分离通道中有微孔塞；分离通道终端和废液池之间的通道是检测通道；光电倍增管直接置于检测通道下方，用于检测化学发光反应发出的光强度；各微通道的二端有储液池，它们分别是缓冲液储液池、样品储液池、样品废液池、鞘流储液池、废液池；负压源由真空瓶与电触点真空表和微型真空泵连接构成；真空瓶通过连接管与微型三通阀的a端口相连接，微型三通阀的c端口直接与大气相通，三通阀的公共端口b通过聚四氟乙烯管和硅橡胶管和样品废液池相连，插入废液池的聚四氟乙烯管和硅橡胶管高于废液池内的电泳缓冲液的液面，始终保持不与样品废液池内的电泳缓冲液的液面相接触，同时保证接口的气密性；针型调节阀的一端和废液池连接，针型调节阀的另一端与真空瓶相连接；时间继电器精确控制进样阶段的时间。

本发明的微芯片分析系统电泳分离电场连接于缓冲液储液池和其中一个鞘流储液池之间，由于单路高压电源所施加的电泳分离电场不经过检测通道，电泳分离的稳定性和结果的重现性好，并适用各种化学发光体系，包括不导电的非水发光体系。当化学发光试剂是不导电的非水溶液时，使化学发光试剂的非水溶液在其中一条鞘流通道中流动，而在另一条鞘流通道加入电泳缓冲液，并将芯片毛细管电泳的分离电场通过电泳缓冲液流过的鞘流通道施加在分离通道上。当化学发光试剂是导电的水溶液时，将芯片毛细管电泳的分离电场通过化学发光试剂流过的鞘流通道施加在分离通道上。

本发明的微芯片分析系统通过微型真空泵和电接点真空表使真空瓶中产生和保持稳定的负压，真空瓶内的负压有二个作用，A.真空瓶内的负压与单路高压电源和微型三通阀相结合，控制微流控芯片毛细管电泳的进样和分离的操作；B.真空瓶内的负压通过针型调节阀调节负压后，使化学发光试剂在整个分析阶段以恒定的流速经过检测通道，与芯片毛细管电泳分离后的待分析组分相混合后在检测通道内发生发光反应，得到相应的电泳峰，根据电泳峰迁移时间和峰高，对待测组分进行定性和定量分析。

本发明的微芯片分析系统通过控制针形调节阀的开启程度在废液池上方施加一个低于大气压的负压，使鞘流储液池中发光试剂由鞘流通道经检测通道向废液池流动；通过调节针形调节阀的开启程度，控制发光试剂和电泳分离后各组分在检测通道内的流速和电泳峰的宽度。从而使芯片毛细管电泳分离和化学发光检测联用装置的控制设备和操作大大简化，体积大大缩小。

本发明的微芯片分析系统用U型管压力计或测定真空度的仪表监控施加在废液池上方的负压。

本发明的微芯片分析系统通过三通阀的阀位控制芯片毛细管电泳的进样阶段或分离阶段；三通阀的阀位用电动和手动两种方法控制，当用电动方法控制时，用时间继电器精确控制进样阶段的时间。三通阀包括：三通电磁阀、由电机驱动的三通阀和手动三通阀。

本发明的微芯片分析系统使用的微流控芯片在分离通道中制作了微孔塞。该微孔塞对压力流的阻力很大，而对电渗流阻力很小，因此被分析的样品可以在电渗流的驱动下，进入有效分离通道进行电泳分离，而不会被施加在废液池上的负压吸入分离通道，影响分离效率。同时，也防止了施加在样品废液池上的负压将发光试剂吸入分离通道，影响电泳分离。

本发明微芯片分析系统的具体操作过程是：通过设定电触点真空表的最大和最小真空度，接通微型真空泵电源，使真空瓶内形成负压，当瓶内真空度达到设定真空度上限时，电触点真空表关闭微型真空泵电源，当瓶内真空度低于设定真空度下限时，电触点真空表启动微型真空泵，使瓶内真空度稳定在设定的范围内。

本发明的微芯片分析系统的微流控芯片毛细管电泳分析的操作由进样和分离两个阶段组成。在进样阶段，使三通电磁阀公共端口b与a端口连通。此时微流控芯片样品废液池与真空瓶相连接。在负压的作用下，缓冲液池中的溶液及样品池中的样品溶液均通过微流控芯片交叉口处而流向样品废液池。由于分离通道中制作的微孔塞对压力流的阻力很大，在样品废液池上方施加的负压不能使鞘流储液池和废液池中的溶液通过微通道而流入样品废液池。与此同时，样品溶液在流经微流控芯片交叉口处时，在高电压产生电渗流的驱动下，进入有效分离通道中，进入有效分离通道中样品塞长度与进样阶段持续时间成正比。在分离阶段，使三通电磁阀b端和c端连通。由于三通电磁阀的c端直接与大气相通，使样品废液池与大气相通，它与其他液池之间的压力差立即同时消失。已进入有效分离通道的样品塞被加在分离通道上的电场所产生电场力的作用下，在有效分离通道中予以分离。通过优化各储液池的液面高度，可以防止样品溶液在分离时进入分离通道而影响分离效果。通过控制微型针形调节阀的开启程度，可以使发光试剂在进样和分离二个阶段均以恒定的流速经过检测通道流入废液池，当芯片毛细管电泳分离后的待分析组分与发光试剂在分离通道与鞘流通道相交点相遇后在检测通道内混合发生化学发光反应，从而得到相应的电泳峰，根据电泳峰迁移时间和峰高可以对待测组分进行定性和定量分析。

本发明提供的微芯片分析系统，电泳分离和化学发光检测互不干扰，保证了毛细管电泳的高分离效率和化学发光法的高灵敏度。具有分离效率高、检测灵敏度高、结构简单，体积小，重量轻，操作方便、成本低廉、兼有毛细管电泳的高分离效率和化学发光法的高灵敏度的特点，是制作便携式微全分离系统理想的联用技术。

附图说明

图1集成芯片毛细管电泳分离和化学发光检测的微芯片分析系统示意图

图中：1-微流控芯片，2-微孔塞，3-高压电源，4-硅橡胶管，5-聚四氟乙烯管，6-U型管压力计，7-针型调节阀，8-电触点真空表，9-真空瓶，10-微型真空泵，11-光电倍增管，12-三通阀及a、b、c三个端口，13-时间继电器。

图2芯片毛细管电泳分离和化学发光检测分析水样中重金属离子的电泳图

具体实施方式

实施例1

参见图1，微流控芯片1上有缓冲液储液池B、样品储液池S、样品废液池SW、鞘流储液池L和H、废液池W。其中，微流控芯片进样通道为S-SW，分离通道为B-P₂，进样通道与分离通道相交P₁，分离通道与鞘流通道相交P₂，P₁和P₂之间的通道是有效分离通道P₁-P₂。有效分离通道P₁-P₂中有微孔塞2，鞘流储液池L和H与分离通道连接点P₂之间构成鞘流通道L-P₂和鞘流通道H-P₂，分离通道终端P₂和废液池W之间的通道是检测通道P₂-W，光电倍增管直接置于检测通道下方，用于检测化学发光反应发出的光强度。负压源由真空瓶9与电触点真空表8和微型真空泵10连接构成。真空瓶9通过聚四氟乙烯连接管与微型三通阀12的a端口相连接，三通阀12的c端口直接与大气相通，b端口通过聚四氟乙烯管5和硅橡胶管4和样品废液池SW相连，插入废液池SW的聚四氟乙烯管和硅橡胶管始终保持不与SW储液池内的电泳缓冲液的液面相接触，同时保证接口的气密性。用同样的方法连接将针型调节阀7和废液池W，针型调节阀7的另一端与真空瓶9相连接。

在微流控芯片上的样品储液池S中加入样品溶液，在鞘流储液池L和H中加入化学发光试剂，在缓冲液储液池B、样品废液池SW、废液池W中加入不同体积的电泳缓冲液。保持样品储液池S中液面的高度小于缓冲液储液池B的液面高度，样品废液储液池SW中的液面高度小于样品储液池S中液面的高度。在缓冲液储液池B端施加+1200V高电压，鞘流储液池L端接地。

首先设定电触点真空表的最大真空度和最小真空度。使微型三通阀12的b端和c端连通，a端截止，同时关闭针型调节阀。开启微型真空泵10，使真空瓶9内形成负压，当瓶内压力达到设定真空度上限时，电触点真空表8关闭微型真空泵，当瓶内压力低于设定真空度下限时，电触点真空表启动微型真空泵10，使瓶内真空度稳定在设定范围内。

真空瓶内的负压有两个作用，1)和单路高压电源3和三通阀12相结合，控制芯片毛细管电泳进样和分离的操作。2)通过针型调节阀7减小负压后，使鞘流储液池L和H中的化学发光试剂在进样和分离二个阶段均以恒定的流速经过检测通道流入废液池W，当芯片毛细管电泳分离后的待分析组分与发光试剂在P₂点相遇后在检测通道混合发生发光反应，从而得到相应的电泳峰，从电泳峰迁移时间和峰高可以得到对待测组分进行定性和定量分析。

微流控芯片毛细管电泳分离的操作由进样和分离两个阶段组成。在进样阶段，三通阀12的b端和a端连通，真空瓶9经通过聚四氟乙烯管5和样品废液池SW相通，使样品废液池上方形成小于大气压的负压，微流控芯片上储液池S中样品溶液和储液池B中缓冲液在负压的作用下向样品废液池SW流动，由于制作了微孔塞的有效分离通道对压力流的阻力很大，而对电渗流阻力很小，因此使样品溶液可以在电渗流的驱动下，进入有效分离通道P₁-P₂，而鞘流储液池L和H以及废液池W中的溶液流，不会通过分离通道而流入样品废液池。与此同时，样品溶液在流经微流控芯片交叉口P₁处时，被加在分离通道间电场的驱动下，进入分离通道，进入分离通道的样品塞长度与进样阶段的持续时间成正比。

在分离阶段，三通阀12的b端和c端连通。由于三通阀12的c端直接与大气相通，从而使样品废液池与大气相通，它与其它液池之间的压力差立即同时消失，可以使进入分离通道的样品塞被加在分离通道上的电场所产生的电渗流作用下带入分离通道，开始电泳分离。当芯片毛细管电泳分离后的待测组分与发光试剂在P₂点相遇后在检测通道混合发生发光反应，得到相应的电泳峰，从电泳峰迁移时间和峰高得到对待测组分进行定性和定量分析。

实施例2

根据实施例1提供一个用微芯片分析系统分析水样中重金属离子的实例。参见图1，微流控芯片1上样品储液池S和样品废液池SW之间的通道是进样通道，P₁和P₂之间的通道是有效分离通道，有效分离通道P₁-P₂中有微孔塞2，P₂和W之间的通道是检测通道，光电倍增管直接置于检测通道下方，用于检测化学发光反应发出的光强度。在通道两端各打小孔，用环氧树脂胶分别将三个内径为5.0mm，高为15.0mm的塑料储液池固定在孔S、SW、B周围；三个内径为7.0mm，高为25.0mm的塑料储液池分别固定在孔L、H、W周围，分别作为它们的储液池。储液池S、SW、B、W分别用于盛放样品、样品废液、电泳缓冲液和废液，储液池H、L分别用于盛放过氧化氢和鲁米诺的溶液。储液池S、SW、B距离十字交叉点P₁的距离均为5.0mm，储液池L、H距离汇合点P₂均为5.0mm；分离通道B-P₂总长度为35.0mm，其中有效分离长度P₁-P₂为30.0mm。微流控芯片的通道均为30μm深，100μm宽；检测通道为螺旋形，其长度为26.6mm。在微流控芯片上的样品储液池S中加入样品溶液，在L中加入化学发光试剂1.0×10^-3M的鲁米诺的溶液，H中加入0.05M过氧化氢溶液。在储液池B、SW和W加入不同体积的电泳缓冲液(20mM NaAc+HAc pH 4.5+5mMα-HIBA)。保持样品储液池S中液面的高度小于储液池B的液面高度，样品废液储液池SW中的液面高度小于储液池S中液面的高度。在分离通道B端施加+1200V高电压，L储液池中的鲁米诺溶液接地。

在废液池W上方施加低于大气压的负压力，使L和H中的化学发光试剂在进样和分离两个阶段均以恒定的流速经过检测通道流入废液池W。

微流控芯片毛细管电泳分离的操作由进样和分离两个阶段组成。在进样阶段，三通阀12的b端和a端连通，真空瓶9经通过聚四氟乙烯管5和样品废液池SW相通，在样品废液池SW上方形成低于大气压的负压力，微流控芯片上S和B储液池中的样品溶液和缓冲液等在负压力的作用下向样品废液池SW流动，由于制作了微孔塞的分离通道对压力流的阻力很大，而对电渗流阻力很小，因此使被分析的样品可以在电渗流的驱动下，进入分离通道P₁-P₂，而L，H和W储液池中的溶液流不会通过分离通道而流入样品废液池。2秒后，切换三通阀12的b端和c端连通，使样品废液池与大气相通，它与其它液池之间的压力差立即同时消失，可以使进入分离通道的样品塞被加在分离通道上的电场所产生电渗流的作用下，开始电泳分离。电泳分离后的各组分和化学发光试剂在检测通道中相混合并发生发光反应，得到的电泳图见图2。