茜草降血糖有效部位及有效成分及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种茜草降血糖有效部位及其制备方法，同时还涉及一种由该降血糖有效部位提取获得的有效成分及其制备方法，还涉及茜草在降血糖方面的应用及其有效部位及有效成分的应用。该有效部位为药用植物茜草根经粉碎、润湿，并依次用氯仿和甲醇浸提而得到的氯仿有效部位和甲醇有效部位。本发明采用传统中药茜草为原料，茜草来源丰富，作为一种天然植物药具有相对安全和价格低廉的特点，本发明提供了更为广泛的糖尿病治疗药物来源，具有很好的社会价值和经济价值。另外，对开发高效、安全的降低餐后血糖新药物具有重要作用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种茜草降血糖有效部位及其制备方法，同时还涉及一种由该降血糖有效部位提取获得的有效成分及其制备方法，还涉及茜草在降血糖方面的应用及其有效部位及有效成分的应用。

背景技术

糖尿病是一种以高血糖为特征，代谢紊乱为表现，与胰岛素分泌密切相关的全身性疾病，是由于遗传和环境因素相互作用而引起的临床综合症。因胰岛素分泌绝对或相对不足以及靶组织对胰岛素敏感性降低，引起糖、蛋白、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱。糖尿病主要分为两种类型：I型糖尿病(即胰岛素依赖型糖尿病)和II型糖尿病(即非胰岛素依赖型糖尿病)，后者约占患者总数的99％-95％。糖尿病的临床表现为三多(多食、多饮、多尿)、一少(体重下降)、高血糖症状。糖尿病引起的并发症(如心血管、肾、视网膜和神经系统的慢性并发症、糖尿病酮症酸中毒、高渗性非酮症糖尿病昏迷等急性并发症)是导致患者死亡的主要原因。所有的糖尿病并发症可以通过严格血糖控制，从最大程度上进行预防，如果糖尿病患者能将自己的血糖水平控制在接近正常的血糖范围内，则糖尿病并发症就不会出现，或者出现得比较晚并且程度也较轻。目前，我国糖尿病患者约1200万，全球约1.5亿，已成为威胁人类的第3号“健康杀手”，所以预防和治疗糖尿病已成为全球性的问题。多年来糖尿病的治疗主要以控制空腹血糖为目标，治疗药物长期以来主要集中于磺脲类与双胍类药物。近年来研究发现，餐后血糖也是糖尿病并发症发生的主要危险因子，餐后血糖是一天中血糖水平最高的阶段，其持续时间可达8小时之久或更长，长时间高水平的餐后血糖可加重糖尿病本身，使血糖进一步升高，如果在进餐时就能很好的控制高血糖，则可以避免其餐后血循环中的糖分堆积，因此，控制餐后血糖可以说是控制高血糖、防治糖尿病的重要举措。现有的糖尿病治疗药物中，磺脲类药物通过刺激胰岛素的分泌而降低血糖；双胍类药物则通过增加外周组织对葡萄糖的利用而降低血糖，两者对降低II型糖尿病病人空腹血糖均有较好疗效，但对降低餐后血糖的作用却非常有限。

食物中的绝大多数碳水化合物为淀粉与蔗糖等，淀粉先后经唾液及胰液中α-淀粉酶分解为寡糖，寡糖在小肠上皮细胞刷状缘处被α-葡萄糖苷酶分解为葡萄糖而被吸收后，导致餐后血糖高峰，因此，抑制α-葡萄糖苷酶的活性成为降低餐后血糖的一个有效途径。α-葡萄糖苷酶抑制剂是七十年代后期研究开发出的一类新型口服降血糖药物，其作用机理在于：竞争性的抑制α-葡萄糖苷酶，延缓和阻碍碳水化合物的消化，延迟来自双糖、低聚糖及多糖的葡萄糖的吸收，有效推迟并减轻餐后血糖升高的时间及程度，长期服用还可以降低空腹血糖水平，此类药物对I、II型糖尿病均适用。α-葡萄糖苷酶抑制剂不仅对糖尿病有确切的疗效，而且对于肥胖症、慢性乙肝、艾滋病及肿瘤都有一定的治疗作用。目前用于临床的此类药物有阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇。现有的此类药物成本较高，并具有肠道副作用。

茜草即茜根，俗名血见愁、小活血、活血草、锯子草、拉拉藤、小血藤，为茜草科植物茜草(Rubia cordifolia L.)的干燥根及根茎。茜草科茜草属植物全世界有60余种，主要分布于亚洲、欧洲、美洲和非洲。我国有24种10变种，遍布全国各地，尤以西南地区种类最多。茜草分布甚广，但至今仍以陕西、山西和河南为主产区，茜草性寒味苦，归心肝经，具有凉血止血、祛风除湿、祛淤通经、活血祛瘀、止咳祛痰之功效，主治吐血、衄血、血热崩漏、闭经、跌打损伤。茜草中主要含有水溶性的环己肽系列物、脂溶性成分蒽醌及其糖苷、萘醌及其糖苷，此外还含有萜类、β-谷甾醇、脂肪酸化合物和微量元素。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从植物茜草中提取制备具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的有效部位——氯仿部位，同时还提供一种从该有效部位分离得到有效成分的方法。

本发明的目的还在于提供一种该茜草有效部位和有效成分在制备降血糖药物方面的应用，尤其是在做为α-葡萄糖酶抑制剂方面的应用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种茜草降血糖有效部位，该有效部位为茜草植物经粉碎、润湿，并依次用氯仿和甲醇浸提而得到的氯仿有效部位和甲醇有效部位。

所述的降血糖有效部位优选为氯仿有效部位。

同时，本发明的技术方案还在于提供一种茜草降血糖有效成分，该有效成分由氯仿有效部位经硅胶柱色谱并用石油醚-丙酮梯度洗脱后，再经过硅胶H柱色谱，石油醚-丙酮洗脱，以TLC检测合并，经Sephadex LH-20柱色谱，丙酮洗脱，得到的化合物1 1，3-二羟-2-甲基基蒽醌，化合物2 1-羟基-2-甲基蒽醌以及化合物3 1，2-二羟基蒽醌。

本发明的技术方案还在于提供一种茜草降血糖有效部位的制备方法，包括以下步骤：将茜草根茎粉碎，用醋酸润湿，依次用氯仿和甲醇室温下分别浸提1-3次，过滤，回收溶剂，得到氯仿有效部位和甲醇有效部位。

得到的氯仿有效部位经过200-300目硅胶柱色谱，石油醚-丙酮梯度洗脱(95∶5～9∶1)，得到具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的部分；将该部分经硅胶H柱色谱，石油醚-丙酮(15∶1)洗脱，以TLC检测合并，经Sephadex LH-20柱色谱，丙酮洗脱，制得降血糖有效成分，即化合物1 1，3-二羟-2-甲基基蒽醌，化合物2 1-羟基-2-甲基蒽醌以及化合物3 1，2-二羟基蒽醌。

本发明的技术方案还采用了茜草在降血糖方面的应用。

更进一步讲，茜草降血糖有效部位——氯仿部位在制备降血糖药物方面的应用。特别是在做为α-葡萄糖苷酶抑制剂方面的应用。

本发明的技术方案还采用了该茜草降血糖有效成分，即化合物1，3-二羟-2-甲基基蒽醌，化合物1-羟基-2-甲基蒽醌以及化合物1，2-二羟基蒽醌在制备降血糖药物方面的应用，尤其是在做为α-葡萄糖苷酶抑制剂方面的应用。

本发明的茜草有效成分经结构鉴定，其结构类型主要为蒽醌类化合物。这些化合物在植物中分布普遍且易得，本发明所涉及的活性化合物来自任何含有此类化合物的原料药，优选来自中药茜草原料药中的氯仿部位。

本发明的茜草降血糖有效部位具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，在相同条件下比临床常用的降糖药阿卡波糖的α-葡萄糖苷酶抑制活性要好的多。从该有效部位得到的有效成分，即化合物1，3-二羟-2-甲基基蒽醌，化合物1-羟基-2-甲基蒽醌以及化合物1，2-二羟基蒽醌均具有很高的α-葡萄糖苷酶抑制活性，且化合物1，3-二羟-2-甲基基蒽醌和化合物1-羟基-2-甲基蒽醌具有竞争性抑制α-葡萄糖苷酶的活性，与阿卡波糖属于同一α-葡萄糖苷酶抑制类型，但其抑制活性远远高于阿卡波糖，可以用于制备餐后降血糖新药物。本发明采用传统中药茜草为原料，茜草来源丰富，做为一种天然植物药具有相对安全和价格低廉的特点，本发明提供了更为广泛的糖尿病治疗药物来源，具有很好的社会价值和经济价值。另外，对开发高效、安全的降低餐后血糖新药物具有重要作用。

实验研究表明茜草提取物即有效部位及有效成分均具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，其提取物特别是脂溶性部位提取物及从中分离得到的化合物的活性强度与目前广泛使用的降血糖药物阿卡波糖更高。

附图说明

图1为从茜草中提取得到的有效成分1，3-二羟-2-甲基基蒽醌的抑制作用动力学曲线；

图2为从茜草中提取得到的有效成分1-羟基-2-甲基蒽醌的抑制作用动力学曲线；

图3为从茜草中提取得到的有效成分1，2-二羟基蒽醌的抑制作用动力学曲线。

具体实施方式

实施例1

本实施例为茜草各提取物即有效部位的提取方法及初步活性筛选。

茜草降血糖有效部位的制备方法为：将茜草根茎500g，粉碎后，用醋酸润湿，依次用氯仿和甲醇室温下分别浸提2次，过滤，回收溶剂，得到氯仿降血糖有效部位(Rc，4.5g)和甲醇降血糖有效部位(Rm，12.8g)。

活性测定：

方法：微孔板法

原理：α-D-葡萄糖苷酶催化水解4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNP-G)，产生硝基苯酚(PNP，黄色物质，在400m左右有最大吸收)，α-糖苷酶抑制剂可抑制α-葡萄糖苷酶与底物结合从而降低PNP的释放量。以一定时间内反应体系中PNP的含量变化来计算提取物的酶抑制活性。

仪器：Multiskan MK3酶标仪(热电上海仪器有限公司)，96微孔板，各种规格移液器，LRH-150生化培养箱(上海一恒科技有限公司)。

试剂：α-葡萄糖苷酶(Sigma公司，EC 3.2.1.20，from baker’s yeast，批号：105K1313)，对-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG，Sigma公司，批号：026K1516)，磷酸盐缓冲液(PH 6.8)，阿卡波糖(拜糖平，Sigma公司，批号：16869)，其他试剂均为分析纯。

检测方法：

112L磷酸钾缓冲液(pH 6.8)，加入20μL(浓度为0.2U/mL)α-葡萄糖苷酶，8μL样品溶液，37℃恒温15min，加入20μL 2.5mmol/L PNPG，37℃恒温反应15min。再加入80μL(浓度为0.2mol/L)的终止剂Na₂CO₃溶液，于405nm波长下测OD值。实验共设4个组，每组三孔，分别为：a.阴性对照组；b.空白组；c.样品测定组；d.样品对照组。按下面方法计算抑制率，并用Origin软件求出相应IC₅₀值。

抑制率计算：

实验结果如表1所示：茜草氯仿提取物和甲醇提取物均比临床常用的降糖药阿卡波糖的α-葡萄糖苷酶抑制活性要好的多，且半数抑制率IC₅₀更确切显示氯仿提取物可作为茜草抑制α-葡萄糖苷酶的有效部位。

表1茜草不同提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性

实施例2

本实施例为在活性指导下，从茜草氯仿有效部位制备有效成分即活性化合物的方法。

具体方法为：将实施例1得到的氯仿有效部位(4.5g)经过200～300目硅胶柱色谱，石油醚-丙酮梯度洗脱(95∶5～9∶1)，得到4个部分，其中第3部分(Rc-3，1.6g)具有抑制α-葡萄糖苷酶活性(表-2)。该部分经硅胶H柱色谱，石油醚-丙酮(15∶1)洗脱，以TLC检测合并，经Sephadex LH-20柱色谱，丙酮洗脱，得到化合物1(12.5mg)，化合物2(5.5mg)和化合物3(120.7mg)。

实施例3

本实施例为茜草中化合物抑制α-葡萄糖苷酶的活性测定。

测定方法：同实施例1。

测定结果：实验结果见表2。3种化合物初筛抑制率均高于阳性对照Acarbose，而IC₅₀值均低于50μg·mL^-1，远小于临床常用的降糖药Acarbose(IC₅₀＝1081.27μg·mL^-1)，具有很高的α-葡萄糖苷酶抑制活力，可作为茜草抑制α-葡萄糖苷酶的有效成分进行开发。

表2茜草中有效成分的α-葡萄糖苷酶抑制活性

实施例4

本实施例为受试化合物α-葡萄糖苷酶抑制类型的确定。

3种化合物分别取合适的两个不同浓度(见图)，反应底物PNPG取5个不同浓度，在400nm下分别测定酶活性，保证反应总体积和酶用量不变，且每个浓度下都以不加酶的相同混合液作为对照。由系列不同底物浓度条件下的酶活力，按Lineweave-Burk作图法，以1/[S]为横坐标，1/V为纵坐标，分别绘制3个化合物的抑制作用动力学曲线(见附图)，得到α-葡萄糖糖苷酶的K_m值为6.04mmol·L^-1。

由图1-图3可知，化合物1和化合物2对α-葡萄糖糖苷酶抑制作用属于竞争性抑制剂，反应速度V_max随抑制剂浓度增大保持不变，根据竞争性抑制动力学方程：1/K_m′＝1/{K_m(1+[I]/K_i)}求得化合物1和2的K_i值分别为：25μg·mL^-1和11.26μg·mL^-1。说明化合物1和2与α-葡萄糖糖苷酶底物在该酶上的络合位点是一样的，属于同一α-葡萄糖苷酶抑制类型，但其抑制活性远远高于阿卡波糖，表明该化合物具有一定的应用价值。

化合物3则属非竞争性抑制，反应速度V_max随着抑制剂浓度的增大而变小，米氏常数K_m保持不变。根据非竞争性抑制动力学方程：1/V′_max＝1/V_max(1+[I]/K_i)，可以求出化合物3的K_i值为3.33μg·mL^-1。说明它既可以和酶，也可以和酶-底物复合物结合，从而降低酶活性，达到降低血糖作用。

实施例5

本实施例为茜草中具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的活性成分的结构鉴定。

化合物1黄色针晶(丙酮)，mp 244～245℃，EIMS m/z(％)：254[M]⁺(100)，238(18)，226(15).¹H NMR(400MHz，CD₃COCD₃)δ：12.99(1H，s，1-OH)，8.30(1H，dd，J＝2.1，7.7Hz，H-8)，8.22(1H，dd，J＝2.1，7.7Hz，H-5)，7.90(2H，m，H-6，7)，2.27(3H，s，2-CH₃).以上数据与文献报道一致，确定化合物1为1，3-二羟-2-甲基基蒽醌。

化合物2黄色针晶(丙酮)，mp 184～185℃，EIMS m/z(％)：238[M]⁺，209(10)，181(18)，152(10).¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ：12.96(1H，s，1-OH)，8.31(2H，m，H-5，8)，7.80(2H，m，H-6，7)，7.76(1H，d，J＝7.6Hz，H-3)，7.53，(1H，d，J＝7.6Hz，H-4)，2.38(3H，s，2-CH₃)。以上数据与文献报道一致，确定化合物2为1-羟基-2-甲基蒽醌。

化合物3红褐色针状结晶(丙酮)，mp 288～289℃，EIMS m/z(％)：240[M]⁺(100)，212(20)，184(12)，155(10)，138(10)，128(10).¹H NMR(400MHz，DMSO)δ：7.62(1H，d，J＝8.3Hz，H-3)，7.20(1H，d，J＝8.3Hz，H-4)，8.19-8.12(2H，m，H-5，8)，7.92-7.86(2H，m，H-6，7).¹³C NMR(100MHz，DMSO)δ：150.7(C-1)，152.7(C-2)，121.1(C-3)，120.8(C-4)，121.0(C-4a)，132.8(C-4b)，126.7(C-5)，135.0(C-6)，133.9(C-7)，133.5(C-8)，188.7(C-9)，180.4(C-10)，133.4(C-8a)，116.1(C-8b)。数据与文献报道的一致，确定化合物3为1，2-二羟基蒽醌。