用作拮抗剂的抗促甲状腺激素受体的人单克隆抗体

摘要

本发明提供了一种分离的TSHR抗体，所述抗体是一种TSH的拮抗剂。本发明还涉及应用本发明的抗体的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及与促甲状腺激素(TSH)受体(TSHR)反应的抗体，并且具体而言，但非排他性地涉及这样的抗体，即这种抗体可与TSHR结合并且可通过TSH-刺激性抗体或TSHR-刺激性抗体阻断TSHR的激活。

背景技术

促甲状腺激素(Thyrotropin)或促甲状腺激素(thyroid stimulatinghormone)(TSH)是一种通过TSHR调节甲状腺功能的垂体激素(Szkudlinski MW，Fremont V，Ronin C，Weintraub BD 2002 Thyroid-stimulating hormone andTSHR structure-function relationships.Physiological Reviews 82：473-502)。TSHR是一种G蛋白偶联受体，由3个结构域组成：富含亮氨酸的结构域(LRD)、切割结构域(CD)和跨膜结构域(TMD)(Nunez Miguel R，Sanders J，Jeffreys J，Depraetere H，Evans M，Richards T，Blundell TL，Rees SmithB，Furmaniak J 2004 Analysis of the thyrotropin receptor-thyrotropininteraction by comparative modelling.Thyroid 14：991-1011)。TSH结合到TSHR上引发受体信号传导，其促进甲状腺激素：甲状腺素(T4)和三碘甲腺原氨酸(T3)的形成与释放。有一种反馈机制涉及循环中T4和T3的水平，这种机制控制从脑下垂体释放TSH(和下丘脑分泌的促甲状腺激素释放激素)，TSH又控制甲状腺激活和血清中甲状腺激素的水平。

本领域的很多资料说明，某些自身免疫性甲状腺病(AITD)的患者具有与TSHR反应的自身抗体(Rees Smith B，McLachlan SM，Furmaniak J 1988Autoantibodies to the thyrotropin receptor.Endocrine Reviews 9：106-121)。在大多数情况下，这些自身抗体与TSHR结合并模仿TSH的作用，从而刺激甲状腺产生高水平的T4和T3。这些自身抗体被称为甲状腺刺激性自身抗体或TSHR自身抗体(TRAb)，具有刺激性活性或TSH激动剂活性。上文提及的甲状腺功能控制的生理反馈机制在这种甲状腺刺激性自身抗体存在的情况下和出现甲状腺活动过度或甲状腺毒症(血清中甲状腺激素过量)的患者中是无效应的。这种病症被称为格雷夫斯病(Graves′disease)。人们认为，在一些患者中，具有刺激活性的TRAb在眶后组织中与TSHR相互作用，并且导致了格雷夫斯病的眼部征状。作为强大的甲状腺刺激因子的人单克隆抗体(hMAb TSHR1)被详细记载于专利申请WO2004/050708A2中。

与在一些患AITD的患者中不同，自身抗体可结合TSHR、阻止TSH结合于所述受体，但没有刺激TSHR的能力。这些类型的自身抗体被称为具有阻断活性或TSH拮抗活性的TRAb，并且在其血清中有阻断性TRAb的患者可能会出现甲状腺活性不足的症状(甲状腺功能减退症)(Rees Smith B，McLachlan SM，Furmaniak J 1988 Autoantibodies to the thyrotropin receptor.EndocrineReviews 9：106-121)。具体地，如果存在于怀孕女性的血清中，具有阻断活性的TRAb可穿过胎盘并且可以阻断胎儿的甲状腺TSHR，引起新生儿甲状腺功能减退症和严重的发育后果。再者，具有阻断活性的TRAb可出现于受感染母亲的母乳中，这可能在婴儿中进一步导致临床的甲状腺功能减退症。迄今为止，还尚未获得具有TSH拮抗剂活性的抗TSHR的人单克隆自身抗体。因此，针对这种类型的自身抗体怎样和TSHR相互作用的详尽研究，以及针对它们和TSHR的相互作用与刺激类型的自身抗体(例如M22)以及与TSH相比如何的详细研究均受到了限制。

人绒毛膜促性腺激素是一种在妊娠过程中产生的具有温和甲状腺刺激效应的激素。

对具有刺激活性或阻断活性的TRAb的性质的表征在下述研究中是绝对重要的，所述研究即其目标是改善对与TSHR的自身免疫反应相关的疾病的诊断和治疗。在专利申请WO2004/050708A2中描述的发明提供了关于具有强大刺激活性的人单克隆自身抗体的性质及其与TSHR的相互作用的详情。再者，专利申请WO2006/016121A公开了一种包括至少一个点突变的突变的TSHR制品，它可用于在来自待筛查的患者的体液样品中，对患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH进行差异筛查和鉴定。专利申请WO2004/050708A2还描述了具有TSHR阻断活性的小鼠单克隆抗体(9D33)。9D33以高亲和力(2×10¹⁰L/mol)与TSHR结合，并且是一种TSH、hMAb TSHR1(M22)和具有刺激活性或阻断活性的患者血清TRAb的有效拮抗剂(专利申请WO2004/050708A2和SandersJ，Allen F，Jeffreys J，Bolton J，Richards T，Depraetere H，Nakatake N，Evans M，Kiddie A，Premawardhana LD，Chirgadze DY，Miguel RN，BlundellTL，Furmaniak J，Rees Smith B 2005 Characteristics of a monoclonalantibody to the thyrotropin receptor that acts as a powerfulthyroid-stimulating autoantibody antagonist.Thyroid 15：672-682)。虽然小鼠单克隆抗体9D33至少可显示具有阻断活性的患者血清TRAb的一些特征，但它是一种通过以TSHR免疫实验动物产生的小鼠抗体，并因此不能真正代表人体内对TSHR自身免疫应答过程中产生的TSHR的自身抗体。作为一种小鼠单克隆抗体，为了应用于人体内，需要将9D33人源化。考虑到人源化过程中涉及的成本和复杂操作来看，这可能是不利的。

本发明起因于抗TSHR的人单克隆自身抗体(5C9)的产生和性质，该抗体在患者血清中是一种TSH和刺激性TRAb的有效拮抗剂。已经从具有甲状腺功能减退症和高水平TSHR自身抗体的患者的外周淋巴细胞分离到了5C9。通过以下方式将该淋巴细胞永生化：以爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)感染并将阳性克隆与小鼠/人细胞系融合，以形成稳定的克隆。从克隆培养物的上清液纯化IgG，评估5C9IgG结合于TSHR并影响TSHR活性的能力。具体地，研究了5C9抑制TSH与TSHR结合的能力，及抑制TSH的环AMP刺激活性的能力。再者，还评估了5C9抑制刺激性或阻断性的患者血清TRAb与TSHR的结合的能力，及抑制它们的生物活性的能力。另外，研究了5C9在对TSHR抗体、TSH和相关化合物的测定中的用途。对5C9的重链(HC)和轻链(LC)的可变区(V区)基因进行测序，并指定互补决定区(CDR)。

发明内容

根据本发明的第一方面，提供了一种分离的TSHR的人抗体，该抗体是一种TSH的拮抗剂。

根据本发明的第二方面，提供了一种分离的TSHR的人源化抗体，该抗体是一种TSH的拮抗剂。

根据本发明第一方面或第二方面的抗体为“一种根据本发明的抗体”。

根据本发明的抗体可为一种甲状腺刺激性抗体的拮抗剂。

根据本发明的抗体可具有患者血清TSHR自身抗体——一种TSH拮抗剂——的TSH拮抗剂特征。

根据本发明的抗体可为TSH的拮抗剂和甲状腺刺激性抗体的拮抗剂。

根据本发明的抗体可具有患者血清TSHR自身抗体——甲状腺刺激性抗体的拮抗剂——的拮抗剂特征。

根据本发明的抗体可以是一种TSH、M22或者对TSHR有刺激活性的抗体或有阻断活性的抗体与TSHR或其一部分结合的抑制剂。TSHR部分可包括LRD或其相当大的部分。优选地，一种可阻断这种结合的抗体。

根据本发明的抗体可为单克隆抗体或重组体抗体，或者包含其片段或由其片段组成，是一种TSH的拮抗剂。根据本发明的抗体可包含这样的V_H区，即该V_H区包含一种或多种选自图2中显示的CDR 1、CDR 2或CDR 3的CDR，或者一种或多种基本与这些CDR同源的氨基酸序列。此外或另外，根据本发明的抗体可包含这样的V_L区，即该V_L区包含一种或多种选自图3中显示的CDR 1、CDR 2和CDR 3的CDR，或者一种或多种基本与这些CDR同源的氨基酸序列。

根据本发明的抗体与人全长TSHR可具有约10¹⁰L/mol的结合亲和力。优选地，根据本发明的抗体与人全长TSHR可具有约10⁹L/mol的结合亲和力。

本发明可帮助本领域技术人员理解驱使刺激性和阻断性TSHR自身抗体发展和产生的免疫学机制。另外，本发明可帮助本领域技术人员理解具有甲状腺刺激活性的TSHR自身抗体与具有阻断活性的TSHR自身抗体之间的分子差异。另外，本发明的治疗处理方法和药物组合物提供了新的甲状腺相关病症疗法。

一种优选的本发明抗体为5C9。已意外地发现5C9可抑制促甲状腺激素受体的组成型活性，也就是说在不存在促甲状腺激素或M22的情况下，在测验系统中产生环AMP。这可能特别有利于对甲状腺中剩余的或转移的甲状腺癌细胞的治疗，尤其是在阻止或延迟再生长方面，这是因为促甲状腺激素受体的组成型活性可造成这些细胞更快速地生长。

本文使用的术语“抗体”及同系术语例如“多种抗体”根据上下文包括基于免疫球蛋白的结合部分，例如单克隆和多克隆抗体、单链抗体和多特异性抗体，并且还包括本领域技术人员可用于代替这种基于免疫球蛋白的结合部分的结合部分，例如结构域抗体、双链抗体、IgGΔC_H2、F(ab′)₂、Fab、scFv、V_L、V_H、dsFv、微型抗体、三链抗体、四链抗体、(scFv)₂、scFv-Fc和F(ab′)₃(Holliger P，Prospero T，Winter G 1993″Diabodies：small bivalent and bispecificantibody fragments″Proc Natl Acad Sci USA 90：6444-6448.)，(Carter PJ2006″Potent antibody therapeutics by design″Nat Rev Immunol 6：343-357)。

术语“TSHR”是指具有显示于图4中的氨基酸序列的全长人促甲状腺激素受体，或者它的与促甲状腺激素受体高度同源的变体或片段。优选地，这种变体和片段与显示于图4中的氨基酸序列有70-99.9％的同源性。

根据本发明的另一方面，提供了一种核苷酸，所述核苷酸包括：

a)编码根据本发明第一方面的抗体的核苷酸序列；

b)编码如图2或3中所示的抗体V_H结构域、抗体V_L结构域或CDR的氨基酸序列的如图2或3中所示的核苷酸序列；或者

c)与a)或b)的核苷酸序列高度同源并编码以至少约10⁹L/mol的亲和力与TSHR结合的抗体的核苷酸序列。

根据本发明的另一方面，提供了一种包含根据本发明的以上方面的核苷酸的载体。

所述载体可以为一种质粒、病毒或它们的片段。本领域技术人员已知多种不同类型的载体。

根据本发明的另一方面，提供了一种包含根据本发明的抗体、核苷酸和/或载体的分离的细胞；所述分离的细胞可表达一种根据本发明的抗体。优选地，所述分离的细胞分泌一种根据本发明的抗体。优选地，根据本发明的分离的细胞来自一个稳定的异源杂交瘤细胞系。

根据本发明的又一方面，提供了一种包含确定浓度的TSHR自身抗体并包含根据本发明的抗体的组合物。这种组合物可包含一种确定浓度的具有TSH拮抗剂活性的TSHR自身抗体，并包括一种根据本发明的抗体。

或者，根据本发明的该方面的组合物可包含一种确定浓度的TSHR自身抗体——甲状腺刺激性抗体拮抗剂，并包括一种根据本发明的抗体。一种组合物可包含一种确定浓度的具有TSH拮抗剂活性的TSHR自身抗体——甲状腺刺激性抗体拮抗剂，并包括一种根据本发明的抗体。

根据本发明的另一方面，提供了一种用于给予哺乳动物受试者进行甲状腺相关病症治疗的药物细合物，包含一种根据本发明的抗体和一种可药用的载体。所述甲状腺相关病症可选自甲状腺活动过度、格雷夫斯眼病、新生儿甲状腺功能亢进症、人绒毛膜促性腺激素诱导的甲状腺功能亢进症、胫骨前粘液水肿、甲状腺癌和甲状腺炎。

根据本发明的药物组合物可用于对人给药。优选地，根据本发明的药物组合物对受试者的免疫系统无显著的不利效应。

根据本发明的药物组合物可包含另外的促甲状腺激素受体拮抗剂。一种合适的另外的促甲状腺激素受体拮抗剂为WO2004/050708中公开的9D33。

已考虑到本发明的药物组合物可具有多种形式。用于治疗甲状腺相关病症的根据本发明的药物组合物可以为一种可注射的形式。用于治疗胫骨前粘液水肿的根据本发明的药物组合物优选地为一种局部给药形式。用于治疗格雷夫斯眼病的根据本发明的药物组合物优选地为滴眼剂的形式。

本发明的药物组合物包括根据本发明的任意抗体和可药用的任意载体、佐剂或运载体。可用于本发明药物组合物的药用载体、佐剂和运载体包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(如人血清白蛋白)、缓冲物质(如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质(如硫酸鱼精蛋白)、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅溶胶、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡，聚乙烯聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。

本发明的药物组合物可通过口服给药、非经肠给药、通过喷雾吸入给药、局部给药、通过滴眼液给药或眼膏给药、直肠给药、鼻腔给药、口腔给药、阴道给药或经由植入储存器给药。我们优选口服给药或注射给药。本文所用的术语“非经肠”包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输液技术。

所述药物组合物可为无菌可注射制剂的形式，如无菌可注射的水悬浮液或油悬浮液。这种悬浮液可依照本领域中已知技术使用合适的分散剂或润湿剂(如Tween 80)和助悬剂制成。无菌可注射试剂也可是由无毒肠外可接受的稀释剂或溶剂制成的无菌可注射溶液或悬浮液，如溶于1，3-丁二醇的溶液形式。可使用的可接受的运载体和溶剂是甘露醇、水、林格氏液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发性油通常被用作溶剂或助悬介质。为此目的，可使用任何温和的不挥发性油，包括合成的单甘油酯或双甘油酯。脂肪酸(如油酸及其甘油酯衍生物)可用于制备可注射剂，正如天然的药学可接受的油类(如橄榄油或蓖麻油)尤其是其聚氧乙基化形式一样。这些油溶液或悬浮液也可含有长链醇稀释剂或分散剂如Ph.Helv或类似的醇。

本发明的药物组合物可以任何口服可接受的药剂形式口服给药，包括但不限于胶囊、片剂、水悬浮液和溶液。对于口服用片剂，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还加入润滑剂如硬脂酸镁。对于口服用胶囊形式，有用的稀释剂包括乳糖和干的玉米淀粉。当水悬浮液为口服给药时，其活性成分与乳化剂和悬浮剂结合。如果需要，还可加入某些甜味剂和/或调味剂和/或着色剂。

本发明的药物组合物也可以直肠给药用栓剂形式给药。可通过将本发明的化合物与合适的非刺激性赋形剂混合来制备这些组合物，所述赋形剂在室温下为固态但在直肠温度下为液体，因而会在直肠中溶解从而释放出活性组分。这种材料包括但不限于可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。

当所需治疗包括局部施药容易到达的区域或器官时，本发明药物组合物的局部给药尤其有用。对于局部皮肤给药，所述药物组合物应该用含有悬浮或溶解于载体中的活性组分的合适软膏来配制。用于本发明化合物局部用药的载体包括但不限于矿物油、液体石油、白石油、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，所述药物组合物可以用含有悬浮或溶解于载体中的活性化合物的合适洗剂或霜剂来配制。合适的载体包括但不限于矿物油、脱水山梨醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、棕榈醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。本发明的药物组合物也可通过直肠栓剂制剂或以合适的灌肠剂形式用于下肠道。本发明还包括局部经皮膏药。

本发明的药物组合物可以鼻用喷雾剂或吸入剂的形式给药。这些组合物是按照药物制剂领域熟知的技术制备的，并可使用苯甲醇或其他合适防腐剂、增强生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物和/或其他本领域中已知的助溶剂或分散剂来制备为盐水溶液。

根据本发明的又一方面，提供了一种产生根据本发明的抗体的方法，所述方法包括培养一种或多种根据本发明的分离的细胞，从而由所述细胞表达所述抗体。优选地，所述抗体由所述细胞分泌。

根据本发明的又一方面，提供了一种在哺乳动物受试者中或者来源自该受试者的细胞中治疗甲状腺相关病症的方法，所述方法包括将所述受试者或所述细胞与本发明的抗体相接触。

根据本发明的另一方面，提供了一种在哺乳动物受试者的甲状腺中抑制甲状腺刺激性抗体刺激TSHR的方法，所述方法包括将所述受试者与本发明的抗体相接触。优选地，阻止甲状腺刺激性抗体与TSHR的结合。

根据本发明的另一方面，提供了一种在哺乳动物受试者中抑制甲状腺刺激性抗体与甲状腺外TSHR结合的方法，所述方法包括将所述受试者与本发明的抗体相接触。所述甲状腺外TSHR可存在于所述受试者的眶后组织和/或胫骨前组织中。当被应用于该方法中时，本发明的抗体优选地阻断TSHR自身抗体与甲状腺外TSHR的结合。

根据本发明的另一方面，提供了一种在受试者中或在源自受试者的甲状腺细胞中治疗甲状腺中的或转移的甲状腺癌的方法，所述方法包括将所述癌细胞与本发明的抗体相接触，目的是在所述细胞中抑制组成型促甲状腺激素受体活性。优选地，阻止或延迟甲状腺癌细胞的再生长。

还提供了一种在受试者中或在源自受试者的甲状腺细胞中治疗由组成型甲状腺活性造成的甲状腺活动过度的方法，所述方法包括将所述受试者或甲状腺细胞与本发明的抗体相接触，目的是抑制由组成型甲状腺活性造成的甲状腺活动过度。

在上述本发明的各方法中治疗的受试者优选地为人。

根据本发明的另一方面，提供了根据本发明的抗体在治疗甲状腺相关病症中的用途。或者，提供了根据本发明的抗体在制备用于治疗甲状腺相关病症的药剂中的用途。

还提供了一种在医学疗法中使用的根据本发明的抗体。具体而言，提供了根据本发明的抗体用于治疗甲状腺相关病症的用途。所述甲状腺相关病症可选自甲状腺活动过度、格雷夫斯眼病、新生儿甲状腺功能亢进症、人绒毛膜促性腺激素诱导的甲状腺功能亢进症、胫骨前粘液水肿、甲状腺癌和甲状腺炎。

根据本发明的另一方面，提供了一种表征TSHR抗体的方法，包括确定待测验的TSHR抗体与具有TSHR相关氨基酸序列的多肽的结合情况，其中所述方法涉及一个方法步骤，该步骤包括使用本发明的抗体。优选地，所述方法包括确定本发明的抗体对TSHR抗体与该多肽结合的效应。具有TSHR相关的氨基酸序列的多肽优选地包括全长人TSHR。

根据本发明的另一方面，提供了一种用于表征TSH及相关分子的方法，包括确定待测验的TSH或相关分子与具有TSHR相关氨基酸序列的多肽的结合情况，其中所述方法涉及一步包括使用本发明抗体的方法步骤。

用于表征TSHR抗体或TSH的方法以及上文描述的相关方法可以为ELISA形式。

根据本发明的另一方面，提供了一种确定在结合作为拮抗剂的TSHR自身抗体过程中涉及的TSHR氨基酸的方法，所述方法包括：提供一条具有本发明抗体可结合的第一TSHR相关氨基酸序列的多肽，在所述TSHR相关的氨基酸序列中修饰至少一个氨基酸以及确定这样的修饰对所述抗体结合的效应。

一种修饰本发明抗体的方法，所述方法包括修饰所述抗体的至少一个氨基酸以及确定这样的修饰对于与TSHR相关序列的结合的效应。优选地，选择对TSHR的亲和力增强的经修饰的TSHR抗体。

根据本发明的另一方面，提供了一种鉴定可抑制甲状腺刺激性抗体与TSHR结合的分子的方法，所述方法包括提供至少一种根据本发明的抗体作为参照物。优选地，选择可阻止甲状腺刺激性抗体与TSHR结合的待测验的分子。

还提供了一种鉴定可抑制甲状腺阻断性抗体与TSHR结合的分子的方法，所述方法包括提供至少一种根据本发明的抗体作为参照物。优选地，选择可阻止甲状腺阻断性抗体与TSHR结合的分子。

附图说明

现在通过参考附图1-4、仅以例证的方式对根据本发明的抗体和方法进行描述，其中：

图1的3幅系列图示出了来自患格雷夫斯病的患者(n＝40)和健康的捐血者(n＝10)的血清对¹²⁵I-5C9 IgG、¹²⁵I-TSH或¹²⁵I-M22与经TSHR涂覆的管结合的效应的比较。

a ¹²⁵I-5C9 IgG结合与¹²⁵I-TSH结合

b ¹²⁵I-5C9 IgG结合与¹²⁵I-M22 IgG结合

c ¹²⁵I-TSH结合与¹²⁵I-M22 IgG结合；

图2给出的序列为5C9重链(HC)的可变区序列

a 以未注释和注释的形式显示的5C9 HC的寡核苷酸序列。在注释的形式中，用于PCR引物的序列为框示的各个互补决定区(CDR)；及黑体所示的恒定区。

b 源自以未注释和注释形式显示的寡核苷酸序列的5C9 HC的氨基酸序列；

图3给出的序列为5C9轻链(LC)的可变区序列：

a 以未注释和注释(按照图2)的形式显示的5C9 LC的寡核苷酸序列。

b 源自以未注释和注释形式显示的寡核苷酸序列的5C9 LC的氨基酸序列；

图4显示了人TSHR的共有氨基酸序列(登记号P16473，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝protein&val＝62298994)。

具体实施方式

方法

人单克隆TSHR自身抗体5C9的淋巴细胞分离及克隆化

使用记载于WO2004/050708A2中的方法，常规地分离单克隆自身抗体5C9。最初从收集自患产后甲状腺功能减退症并具有高水平TRAb的患者的血样中分离到淋巴细胞(得到地方伦理委员会的批准)。如WO2004/050708A2中所述，以爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)(European Collection of Cell Cultures-ECACC；Porton Down，SP4 0JG，UK)感染所述淋巴细胞，并培养于小鼠巨噬细胞饲养层上。将分泌TSHR自身抗体的永生化淋巴细胞与小鼠/人杂交细胞系K6H6/B5(ECACC)融合，通过有限稀释克隆4次，以得到单集落。通过抑制¹²⁵I-标记的TSH与TSHR的结合，检测了处在不同克隆化阶段的细胞培养上清液中TSHR自身抗体(WO2004/050708A2)的存在情况。将产生TSHR自身抗体的单克隆扩大，并从培养物收集上清液用于进行自身抗体纯化。

5C9 IgG制品的纯化和标记

使用蛋白质A亲和色谱法在MabSelect(GE Healthcare，UK)上，根据(Sanders J，Jeffreys J，Depraetere H，Evans M，Richards T，Kiddie A，Brereton K，Premawardhana LD，Chirgadze DY，Nunez Miguel R，Blundell TL，Furmaniak J，Rees Smith B 2004 Characteristics of a human monoclonalautoantibody to the thyrotropin receptor：sequence structure andfunction.Thyroid 2004 14：560-570)记载从培养物上清液中纯化5C9 IgG，并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)评估纯度。

使用径向扩散测定(The Binding Site；Birmingham，B29 6AT，UK)确定5C9的重链同种型，通过蛋白质印迹法以抗人κ链和抗人λ链的特异性小鼠单克隆抗体(Sigma-Aldrich Company Ltd，Poole，UK)确定轻链同种型。

在室温下，将溶于20mmol/L乙酸钠溶液(pH 4.5)的10mg/mL的5C9 IgG与依照制造商说明书(Perbio Science UK Ltd，Cramlington，UK)制备的固定化胃蛋白酶振荡孵育4.5小时。此后，通过离心(在室温下，1000×g，5分钟)除去固定化胃蛋白酶，并在4℃下将上清液用300mmol/L NaCl，10mmol/LTris-HCl(pH 7.5)透析过夜。使用Sephacryl S-300High Resolution Matrix(GEHealthcare，Chalfont St Giles，UK)，分离包含5C9 F(ab′)₂和少量完整IgG的透析后混合物。以这种方式纯化的5C9 F(ab′)₂制品不包含完整的IgG，这是通过SDS-PAGE和HPLC凝胶过滤分析来判断的。

再者，在37℃下，使用终浓度100mmol/L的L-半胱氨酸对F(ab′)₂消减1小时。在室温下以终浓度50mmol/L的碘代乙酰胺终止该反应30分钟。如上文所述，使用Sephacryl S-300柱纯化F(ab′)。以这种方式纯化的F(ab′)制品不包含F(ab′)₂，这是通过SDS-PAGE和HPLC凝胶过滤分析来判断的。

另外，用汞木瓜酶(mercuripapain)(Sigma，UK)以1∶100的酶/蛋白质比处理5C9 IgG、将其透析入50mmol/L NaCl，Tris-HCl(pH 9.0)中，并通过阴离子交换Sepharose(购自GE Healthcare的Q-Sepharose Fast flow)柱，以从Fab制品分离完整的IgG或Fc。通过SDS-PAGE和凝胶过滤(Sephacryl S-300柱；如上述)的分析表明，在所述Fab制品中没有检测到完整的IgG。

如Sanders J，Oda Y，Roberts S，Kiddie A，Richards T，Bolton J，McGrathV，Walters S，Jaskolski D，Furmaniak J，Rees Smith B 1999.The interactionof TSH receptor autoant ibodies with ¹²⁵I-labelled TSH receptor.Journalof Clinical Endocrinology and Metabolism.1999 84：3797-3802中所述，以¹²⁵I标记5C9 IgG，或者以生物素酰肼(Perbio Science，Cramlington，UK)标记5C9 IgG。

对¹²⁵I-TSH、¹²⁵I-M22或¹²⁵I-5C9与TSHR结合的抑制

如WO2004/050708A2中的描述，使用经TSHR涂覆的管进行了结合抑制测定。在该测定中，在室温下将100μL试验样品(Mab制品、患者血清或未标记的TSH)和50μL起始缓冲液(RSR Ltd)在经TSHR涂覆的管中轻轻振荡孵育2小时。在吸出后，将所述管洗涤，并且加入100μL的¹²⁵I-标记的蛋白质(5×10⁴cpm)并在室温下振荡孵育1小时。然后，将所述管吸出、洗涤并在γ计数器中计数。

按照下式计算对经标记蛋白质的结合的抑制：-

对照材料为混合的健康捐血者血清、个体的健康捐血者血清或在各个实验结果中指示的其他材料。

对5C9 IgG与TSHR结合的Scatchard分析

在室温下，将溶于50μL测定缓冲液(50mmol/L NaCl，10mmol/L Tris(pH7.8)和1％Triton X-100)中未标记的5C9 IgG和50μL的¹²⁵I-标记的5C9IgG(溶于测定缓冲液中30,000cpm)在经TSHR涂覆的管中振荡孵育2小时(在这些条件下出现最大结合)、吸出、以1mL测定缓冲液洗涤两次并在γ计数器中计数。对结合的IgG的浓度与结合的/游离的IgG的浓度进行作图(Scatchard G 1949 The attraction of proteins for small molecules andions.Annals of the New York Academy of Sciences 51：660-672)，以推导缔合常数。

对环AMP产生的刺激的分析

如WO2004/050708A2中所述，测验了5C9 IgG和其他制品在以人TSHR转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中刺激环AMP产生的能力。将每个细胞表达大约5×10⁴个或大约5×10⁵个TSHR的CHO细胞以每个孔3×10⁴个细胞接种于96-孔板中，在无胎牛血清的DMEM(Invitrogen Ltd，Paisley，UK)中进行适应，然后添加试验样品(TSH、IgG或患者血清)(100μL稀释于环AMP测定缓冲液，即无NaCl的Hank’s缓冲盐溶液，包含1g/L葡萄糖、20mmol/L HEPES、222mmol/L蔗糖、15g/L牛血清白蛋白和0.5mmol/L的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(pH 7.4))，并在37℃下孵育1小时。在除去试验溶液后，将细胞裂解并通过以下两方法的一种测定所述裂解产物中的环AMP浓度：1)使用来自GE Healthcare，Chalfont St Giles，UK的Biotrak酶免疫测定系统；和2)使用来自Assay Designs；Cambridge Bioscience，UK的Direct Cyclic AMP Correlate EIA试剂盒。结果表示为细胞裂解产物(200μL)中pmol/mL的环AMP，或者表示为fmol/细胞孔。

对拮抗剂(阻断)活性的测量

评估了5C9 IgG和其他制品抑制猪(p)TSH、天然人(h)TSH和重组体人(rh)TSH、MAbM22和患者血清TRAb在表达TSHR的CHO细胞中的刺激活性的能力。这一点的实现是通过在存在及不存在5C9 IgG(或其他试验制品)的情况下，比较TSH、M22或TRAb的刺激效应。按上文所述进行该测定，除了将50μL稀释于环AMP测定缓冲液中的5C9(或其他试验制品)添加至所述细胞孔，然后添加50μL的TSH、M22或患者血清(在环AMP测定缓冲液中适当稀释)，并如上文所述刺激测定进行孵育和试验。

除了5C9之外，在该测定中测验了其他MAb和来自具有阻断类型TRAb的患者的血清。

可变区基因的分析

如WO2004/050708A2中所述，使用从1×10⁷个分泌5C9 IgG的异源杂交瘤细胞制备的总RNA以产生用于RT-PCR(逆转录PCR)反应的mRNA，确定了5C9重链和轻链的可变区基因。使用Medical Research Council的V-base(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)设计特异性IgG1 HC和κLC正义和反义链寡核苷酸引物，并由Invitrogen(Paisley，PA4 9RF，UK)合成这些引物。在以下条件下进行RT反应：50℃下15分钟；然后进行40个PCR循环，每个循环为：94℃下15秒、50℃下30秒及72℃下30秒。将DNA产物克隆至pUC18中，并用Sanger-Coulson法进行测序(Sanger F，Nicklen S，Coulson AR 1977 DNA sequencing with chain terminating inhibitors.Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 74：5463-5467)。使用Ig blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)将V区序列与已有人Ig基因序列比较。

对人TSHR序列中的氨基酸突变对5C9活性的效应的分析

用于将具体突变引入TSHR序列的方法已经被记载于专利申请WO2006/016121A中。而且，使用Flp-In系统将突变的TSHR构建体转染至CHO细胞中也被记载于WO2006/016121A中。

将表达野生型或突变TSHR的Flp-In-CHO细胞接种于96孔板中，并如上文所述用于测验5C9制品阻断TSH、M22或患者血清TRAb的刺激活性的能力。

对于TSHR抗体、TSH和相关分子的基于5C9的测定

将2.55mg/mL的5C9 IgG透析至100mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 8.5)中，并与EZ-Link NHS-LC-Biotin(Perbio)进行反应，IgG与生物素的摩尔比为1/10。在室温下，将试验血清样品(75μL)在经TSHR-涂覆的ELISA板孔(RSRLtd)中振荡(每分钟振荡500次)孵育2小时。在除去所述试验样品并洗涤后，添加生物素标记的5C9 IgG(100μL中2ng)，并在室温下不振荡继续孵育25分钟。将孔清空、洗涤并添加100μL链亲合素-过氧化物酶(100μL中10ng；RSR Ltd)，并在室温下不振荡继续孵育20分钟。然后，将孔洗涤3次，添加过氧化物酶的底物四甲基联苯胺(tetramethyl benzidine)(TMB；100μL；RSR Ltd)，并在避光且不振荡的条件下，在室温下孵育30分钟。然后，添加50μL的0.5mol/L H₂SO₄以终止该反应，使用ELISA板读数仪在450nm下读取每个板孔的吸光度。按照下式计算对5C9 IgG-生物素结合的抑制：-

结果

5C9分泌细胞系的分离及克隆化

将从20mL患者血液中获得的淋巴细胞(27×10⁶)以EBV感染，并在48孔板中以每孔1×10⁶个细胞铺展于小鼠巨噬细胞饲养层之上。在EBV感染后第13天，在板孔上清液中监测对¹²⁵I-TSH结合的抑制。将来自阳性孔的细胞扩大，与K6H6/B5杂交瘤细胞系融合，并在96孔板中铺展。获得了一个稳定产生具有¹²⁵I-TSH结合抑制活性的抗体的克隆，并进行4次再克隆。从异源杂交瘤培养物上清液中纯化的被命名为5C9的单克隆抗体是具有κ轻链的亚类IgG1。

5C9 IgG的TSHR结合活性和阻断活性

表1中显示了，不同浓度的5C9 IgG抑制标记的TSH、标记的M22或标记的5C9自身与TSHR结合的能力。如表1中所示，在使用少至0.005μg/mL的5C9 IgG的情况下，¹²⁵I-TSH的结合出现了12％的抑制，并且该抑制以剂量依赖的方式增大，在100μg/mL的5C9时抑制最高升至84％。这可与捐献者的血清IgG对¹²⁵I-TSH结合的抑制相似；在0.05mg/mL时抑制13％，并且在1mg/mL时以剂量依赖的方式增大至抑制94％。在捐献者的血浆的情形下，在以1∶160稀释健康捐血者的混合血清时，¹²⁵I-TSH结合出现了16％的抑制，在以1∶10稀释时抑制为95％。

5C9 IgG还对¹²⁵I-M22IgG与涂覆在管上的TSHR的结合有效应(表1)。在0.01μg/mL的5C9 IgG时，¹²⁵I-M22 IgG的结合出现了9％的抑制，并且在增加浓度时引起该抑制以剂量依赖的方式增大，在100μg/mL时最高达85％。捐献者血清IgG在0.01mg/mL下是有效的，引起9％的抑制，并且在1mg/mL时以剂量依赖的方式增大至89％的抑制。在以1∶320稀释时，捐献者的血清血浆显示出对¹²⁵I-M22 IgG结合的13％的抑制，在以1∶10稀释时抑制91％。

未标记的5C9 IgG能够以剂量依赖的方式抑制¹²⁵I-5C9与经TSHR涂覆的管的结合(在0.005μg/mL时抑制11％，在100μg/mL时最多升至抑制88％)(表1)。¹²⁵I-5C9的结合还被捐献者的血清IgG抑制(在0.05μg/mL时抑制15％，在1mg/mL时抑制91％)，以及被捐献者血浆的稀释物抑制(在1∶320的稀释度时抑制10％，在1∶10的稀释度时92％)。

表2a-c中显示了，5C9 IgG在表达TSHR的CHO细胞中阻断TSH和M22-介导的对环AMP的刺激的能力。猪TSH(3ng/mL)强烈地刺激环AMP的产生(19,020±2154fmol/细胞孔；平均值±SD；n＝3)(表2a)。在存在0.1μg/mL的5C9 IgG的情况下，猪TSH的刺激活性降低至11874±4214fmol/细胞孔(平均值±SD；n＝3)，并且该抑制效应依赖于5C9浓度，在存在1μg/mL的5C9时仅产生2，208±329fmol/细胞孔的环AMP(表2a)。淋巴细胞捐献者的血清还在CHO-TSHR细胞中对TSH介导的环AMP刺激有强效应。如表2a中所示，在存在1∶10稀释度的捐献者血清的情况下(该稀释度下的总血清IgG浓度为1.43mg/mL)，对环AMP产生的抑制将其降低至大约6000fmol/细胞孔，这类似于不存在血清下的19000fmol/细胞孔。该效应对应于大约0.37μg/mL的纯化5C9 IgG的效应(利用表2a中所示不同浓度5C9IgG的效应的稀释度曲线计算而得)。这表明，在阻断TSH刺激环AMP产生的能力这方面，纯化5C9 IgG的活性比捐献者血清IgG高出大约3900倍。

5C9的片段，例如5C9 F(ab′)₂和5C9 Fab也是有效的TSH刺激的抑制物。具体而言，5C9 IgG、5C9 F(ab′)₂和5C9 Fab在100μg/mL时的TSH刺激抑制活性是相同的(表2b)。在10μg/mL时，所有三种制品：5C9 IgG、5C9 F(ab′)₂和5C9 Fab也是TSH刺激活性的强效抑制剂，然而，5C9 IgG似乎比5C9 F(ab′)₂或5C9 Fab更有效(表2b)。

M22 Fab(3ng/mL)是一种环AMP的强效刺激物(9,432±822fmol/细胞孔)(表2c)，并且在存在5C9的情况下，M22 Fab的刺激效应被以剂量依赖的方式抑制，环AMP的水平在存在0.1μg/mL的5C9 IgG的情况下降低至1,298±134fmol/细胞孔。M22刺激的完全抑制出现于100μg/mL的5C9时(表2c)。

Scatchard分析表明了，¹²⁵I-标记的5C9以4×10¹⁰L/mol的缔合常数结合于TSHR。

血清TRAb对¹²⁵I-5C9 IgG与TSHR结合的抑制

表3和图1中显示了，血清TRAb抑制¹²⁵I-5C9 IgG与经TSHR涂覆的管结合的能力。还为了比较之目的示出了相同血清TRAb对¹²⁵I-TSH结合及¹²⁵I-M22 IgG结合的效应。

¹²⁵I-5C9 IgG与TSHR的结合没有被来自10个不同健康捐血者的血清(N1-N10，表3)明显抑制(抑制范围3.4-18.9％)。在¹²⁵I-TSH和¹²⁵I-M22抑制测定中(表3)，来自40名均为TSHR自身抗体阳性的格雷夫斯病患者的血清(G1-G40，表3)对¹²⁵I-5C9与经TSHR涂覆的管结合(抑制范围22.0-85.2％)的抑制，达到了比来自健康捐血者的血清更大的程度(表3)。患者血清TRAb抑制¹²⁵I-5C9 IgG、¹²⁵I-TSH或¹²⁵I-M22 IgG与TSHR结合的能力是相当的，Pearson相关系数r＝0.95(¹²⁵I-5C9 IgG与¹²⁵I-TSH；图1a)和r＝0.95(¹²⁵I-5C9IgG与¹²⁵I-M22 IgG；图1b)。图1c显示相同血清对¹²⁵I-TSH和¹²⁵I-M22 IgG抑制的比较(Pearson系数r＝0.99)。

这些实验表明，5C9 IgG与TSHR的结合可被血清TRAb有效地抑制，并且血清TRAb对5C9 IgG结合的抑制效应类似于它们对TSH或M22结合的抑制效应。

表4显示了不同稀释度的具有TSH阻断活性的患者血清TRAb(B1-B5)及具有强甲状腺刺激活性的患者血清TRAb(S1、S2和S4)对¹²⁵I-5C9 IgG结合的抑制。¹²⁵I-5C9 IgG的结合被血清B1-B5，以及血清S1、S2和S4以剂量依赖的方式抑制。同样这些阻断和刺激血清还以剂量依赖的方式抑制¹²⁵I-TSH和¹²⁵I-M22 IgG结合，而且在同样的血清稀释度下所有三种经标记配体的抑制百分数是相当的(表4a&b)。

这些结果表明，具有刺激活性和阻断活性的TSHR自身抗体可抑制5C9与TSHR的结合。

具有TSH结合抑制活性的小鼠MAb对¹²⁵I-5C9 IgG与TSHR结合的抑制

测验具有¹²⁵I-TSH结合抑制活性的不同小鼠TSHR Mab抑制¹²⁵I-5C9与TSHR结合的能力，并与对¹²⁵I-M22 IgG结合的效应进行比较(表5)。如表5中所示，具有抑制¹²⁵I-TSH结合和¹²⁵I-M22 IgG结合的能力的所有Mab还抑制了¹²⁵I-5C9结合，但在某些Mab的情况下对¹²⁵I-5C9结合和¹²⁵I-M22结合的抑制效应弱于对¹²⁵I-TSH结合的效应。

这些实验表明，5C9在TSHR上的结合位点和小鼠TSHR MAb在TSHR上的结合位点之间有大量的重叠，所述小鼠TSHR MAb具有抑制TSH结合的能力。

5C9 IgG在表达TSHR的CHO细胞中对患者血清对环AMP产生的刺激的效应

如表2中所示，5C9 IgG能够在表达TSHR的CHO细胞中阻断TSH或M22对环AMP水平的刺激。在不同系列的实验中，测验了5C9 IgG对患者血清TRAb的刺激活性的效应，结果显示于表6a中。血清T1-T9和T11-T18在CHO-TSHR细胞中刺激了环AMP的产生，并且与对照MAb IgG(对人甲状腺过氧化物酶特异性的2G4)的孵育对它们的刺激活性没有效应。然而，在存在5C9 IgG(50μL的200μg/mL)的情况下，所有测验血清的刺激活性都显著降低(表6a)。

6种不同血清(T1、T6、T3、T19、T20和T21)的剂量响应效应显示于表6b-g中。在这些实验中，浓度范围0.1μg/mL-100μg/mL的5C9 IgG导致了血清刺激活性的剂量依赖的降低，并且在除血清T3之外的所有测验血清中，5C9 IgG的效应都与9D33的效应相当，后者是具有阻断活性的抗TSHR的小鼠单克隆抗体(记载于WO2004/050708A2中)。对于T3血清的情况(表6a&6d)，在存在100μg/mL的5C9 IgG的情况下观察到对环AMP产生的约50％的抑制，而100μg/mL的9D33 IgG导致了几乎完全抑制。这表明，在5C9和9D33所识别的表位之间可能有一些微小差异。

5C9 IgG在表达TSHR的CHO细胞中对基础(即未受激的)环AMP产生的效应

除了抑制TSH和TSHR抗体的刺激活性之外，5C9在不存在这些甲状腺刺激物的情况下抑制了环AMP的产生量。具体地，表6b显示了，在存在100μg/mL对照单克隆的IgG(2G4)的情况下所产生的1207±123fmol/细胞孔的环AMP，在存在100μg/mL的5C9 IgG的情况下降低至301±38fmol/细胞孔。9D33 IgG的效应较小，存在100μg/mL 9D33 IgG的情况下产生721±183fmol/细胞孔。在显示于表6d、6e、6f和6g的独立实验中得到了类似的结果。这表明，5C9 IgG对TSHR的基础活性或组成型活性具有显著的效应。

5C9 IgG在表达包含氨基酸突变的TSHR的CHO细胞中对环AMP产生的刺激的效应

图7中显示了，在CHO-TSHR细胞中，TSHR的单氨基酸突变对5C9阻断猪TSH的环AMP刺激活性的能力的效应。具体而言，在这样的CHO细胞中研究了5C9对环AMP产生的刺激的效应，即这种CHO细胞表达以下残基突变成丙氨酸的TSHR：Lys 58、Ile 60、Arg 80、Tyr 82、Thr 104、Arg 109、Lys129、Phe 134、Asp 151、Lys 183、Gln 235、Arg 255、Trp 258和Ser 281。另外，在以下TSHR残基的情况下研究了对荷电突变进行改变的效应：Arg80Asp、Asp151Arg、Lys183Asp和Arg255Asp，其中依照常规的表示法，被替换的氨基酸残基及其在原始序列的多肽中的位置被标明于替换氨基酸残基之前。以前的研究已表明，对TSHR Asp160Lys的荷电突变进行改变导致TSHR失去了对TSH的响应性，而对M22的响应未受影响(专利申请WO2006/016121A)。因此，使用M22作为环AMP的刺激物，在CHO-TSHR细胞中研究了TSHR Asp160Lys突变对5C9生物活性的效应(表71)。

在所研究的所有TSHR突变中，仅发现3个突变对5C9作为拮抗剂的能力有影响。Lys129突变成Ala(表7h)导致5C9 IgG完全丧失了阻断TSH对环AMP产生的刺激的能力。

而且，TSHR突变Lys183Ala引起了5C9 IgG阻断活性的部分降低；在用TSHR Lys183Ala突变进行测验时，1μg/mL时观察到对TSH刺激的28％抑制，不同于使用野生型TSHR时的84％抑制(表7m)。甚至在100μg/mL的5C9IgG时，在用TSHR Lys183Ala突变的实验中仅检测对TSH刺激的部分抑制(43％)，而在该浓度时，在用野生型受体的实验中观察到对TSH刺激活性的完全阻断(93％)(表7m)。如果正电荷的Lys183突变成负电荷的天冬氨酸，那么对5C9生物活性的效应类似于使用Lys183Ala突变时观察到的效应(表7m)。这说明了，Lys183对5C9的生物活性是重要的。在Asp151Ala的情形下，观察到5C9 IgG阻断活性出现了轻微的降低：在1μg/mL时49％抑制，不同于野生型的88％的抑制(表7j)。然而，在存在100μg/mL的5C9 IgG的情况下，该活性与野生型TSHR相同。当负电荷的Asp151突变成正电荷的精氨酸时，不会观察到5C9 IgG阻断活性的显著降低(表7k)。

可以将TSHR突变对5C9活性的效应与TSHR突变对9D33活性的效应相比较。如专利申请WO2006/016121A中所述，TSHR突变Lys 58、Arg 80、Tyr 82、Arg 109、Lys 129和Phe 134均对9D33活性有效应。然而，除了Lys 129之外，这些突变中没有一种还对5C9活性有效应。再者，如专利申请WO2006/016121A中所述，在影响M22活性的突变(Arg 80、Tyr 82、Glu 107、Arg 109、Lys 129、Phe 130、Lys 183、Tyr 185、Arg 255和Trp 258)中，除Lys 129之外没有一种影响了5C9活性。另外，Lys 183突变对5C9活性和M22活性有部分的效应，但对9D33活性无效应。

这些结果表明以下的TSHR残基中存在不同，所述残基即对于与甲状腺刺激性人抗体M22、与小鼠阻断抗体9D33及与人阻断抗体5C9相互作用来说重要的TSHR残基。因此，5C9与其他具有拮抗剂活性的TSHR抗体(如9D33)的结合可能是一种特别有效的方式，用于抑制患者血清TRAb的刺激活性、其他刺激物和/或TSHR的组成型活性。

5C9的可变区序列

对编码5C9的基因的序列分析表明，HC V区基因来自VH3-53家族，D基因来自D2-2家族，并且J基因来自JH4家族。在LC的情形下，V区基因来自O12家族且J区基因来自JK2种系。HC的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图2a和2b中，并且LC的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图3a和3b中。

与种系序列相比，HC基因序列中有体细胞突变；具体是FWR1中1个沉默突变、CDR2中2个替换突变、CDR3中1个沉默突变和1个替换突变以及FWR4中1个沉默突变。然而，HC V区序列的特征在于两个插入片段；一个在V基因和D基因之间长6个碱基对，另一个在D基因和J基因之间长15个碱基对。因此，HC CDR1长5个氨基酸、CDR2长16个氨基酸且CDR3长18个氨基酸(图2b)。

在LC序列中有：FWR1中1个沉默突变、CDR1中1个替换突变、CDR3中1个替换突变及在V基因和J基因之间6个碱基对长的插入片段。LC CDR1由11个氨基酸组成、CDR2由7个氨基酸组成且CDR3由10个氨基酸组成(图3b)。

用于检测TSH或TRAb的基于5C9的测定

表8中显示了用于检测TSHR自身抗体的ELISA实例，该ELISA基于5C9IgG-生物素与经TSHR涂覆的板孔的结合。在该测定中，对于TSH-生物素结合的抑制呈阳性的所有样品均也对5C9 IgG-生物素结合呈阳性。再者，TSH-生物素测定和5C9-生物素测定中的吸光度信号、抑制百分数和派生的单位/L值是相当的(表8)。

5C9 IgG在表达TSHR的CHO细胞中对小鼠甲状腺刺激性单克隆抗体(小鼠TSHR MAb；TSMAb)的刺激活性的效应

如表9中所示，5C9 IgG能够阻断所有5种测验TSMAb(1、2、4、5和7)对环AMP产生的刺激。例如，TSMAb1(表9)刺激环AMP水平至18.94±7.4pmol/mL，而在存在100μg/mL的5C9 IgG情况下仅产生1.24±0.07pmol/mL的环AMP。这可以与在存在100μg/mL的对照MAb 2G4的情况下16.5±1.1pmol/mL的环AMP水平相比较(表9)。

表9中以及下文表10-15中显示的环AMP水平以pmol/mL表示，即每个细胞孔的环AMP水平为：pmol/mL÷5(代表200μL的来自每个测定孔的样品)。

5C9 IgG在表达TSHR的CHO细胞中对天然人TSH和重组人TSH的刺激活性的效应

表2和表10中显示了5C9 IgG阻断猪TSH对环AMP刺激的能力。另外，5C9 IgG显示了抑制天然人TSH(来自National Institute for BiologicalStandards and Control，South Mimms，Potters Bar EN6 3QG UK的NIBSC参照制品81/565)和重组TSH(NIBSC参照制品94/674)两者对环AMP刺激的能力(表10)。具体而言，100ng/mL的重组或天然人TSH对环AMP产生的刺激需要0.1-1.0μg/mL的5C9 IgG，以获得对环AMP产生的完全抑制。在采集用于分离5C9的血液时，捐献者血清中的循环系统TSH的水平为160mU/L(大约32ng/mL)，所得的结果(表2a和表10)表明，在血清中存在32-320ng/mL的5C9 IgG的情况下将完全阻断该水平的循环系统TSH。使用对¹²⁵I-M22与TSHR结合的抑制，评估了所述捐献者血清中TSHR自身抗体的水平(如Nakatake N，Sanders J，Richards T，Burne P，Barrett C，Dal PraC，Presotto F，Betterle C，Furmaniak J，Rees Smith B 2006 Estimationof serum TSH receptor autoantibody concentration and affinity.Thyroid 16：1077-1084中所述)，为1700ng/mL(120ng/mg)，即比用于阻断TSH的甲状腺刺激所需的5C9浓度高出数倍。

5C9 IgG在表达具有活化突变S281I、I568T和A623I的TSHR的CHO细胞中对基础(即未受激的)环AMP活性的效应

在不存在甲状腺刺激物(即TSH或TSHR抗体)时，5C9 IgG在表达具有活化突变的TSHR的CHO细胞中能够降低环AMP的产生量。如表11a中所示，在不存在5C9的情况下，基础环AMP在表达具有活化突变S281I的TSHR的CHO细胞中的浓度为9.90±1.51pmol/mL，并且在存在0.01μg/mL的5C9IgG的情况下它降低至4.17±0.60pmol/mL，且在存在1μg/mL的5C9 IgG的情况下降低至3.44±0.63pmol/mL。阻断性小鼠TSHR MAb 9D33和对照MAb 2G4都几乎没有效果(表11a)。

使用TSHR活化突变I568T获得了类似的结果(表11b)，该结果显示了21.39±5.31pmol/mL的基础环AMP浓度。在添加1μg/mL的5C9 IgG时它降低至5.29±0.75pmol/mL，不同于添加2G4IgG和5C9 IgG的情形下分别至20.52±0.95pmol/mL和21.65±1.99pmol/mL。在基础环AMP浓度为36.89pmol/mL的第三种TSHR活化突变研究(即A623I)的情形下，添加1μg/mL的5C9 IgG将环AMP水平降低至16.43±1.27pmol/mL，这不同于基本无效应的1μg/ml的对照IgG 2G4(28.96±2.29pmol/mL)或1μg/mL的9D33 IgG(40.09±7.73pmol/mL)(表11c)。

这些结果表明，与小鼠阻断性MAb 9D33不同，5C9对与TSHR活化突变相关的环AMP产生具有显著的效应，即便是当所述突变在TSHR的不同部分时(即细胞外结构域中的S281I、跨膜结构域的第二细胞外环中的I568T及跨膜结构域的第三细胞内环中的A623I)。

在表达野生型TSHR的CHO细胞中对以下效应的比较：5C9、小鼠TSHR阻断性单克隆抗体9D33及这两种抗体的混合物对于由TSH介导的对环AMP产生的刺激的效应

如前文的实验中和表12中所示，低至1μg/mL的浓度的人TSHR阻断性MAb 5C9和小鼠TSHR阻断性MAb 9D33在CHO-TSHR细胞中具有阻断TSH的TSHR环AMP刺激活性的能力。如表12的实验1-5中所示，9D33 IgG和5C9 IgG对于由TSH介导的对环AMP的刺激的效应是可相加的。当两个不同浓度的TSH(3ng/mL和0.3ng/mL)用于刺激时(分别在表12的实验1-3及实验4和5中)，出现了同样的相加效应。

在表达野生型TSHR的CHO细胞中对以下效应的比较：5C9、小鼠TSHR阻断性单克隆抗体9D33及这两种抗体的混合物对于由M22介导的对环AMP产生的刺激的效应

如前文所示，5C9和9D33还能在CHO-TSHR细胞中抑制由M22 Fab介导的对环AMP的刺激。9D33 IgG和5C9 IgG对于由M22介导的对环AMP的刺激的效应是可相加的(表13，实验1-4)。当两个不同浓度的M22 Fab(3ng/mL和0.3ng/mL)用于刺激时(分别在表13的实验1和2及实验3和4中)，出现了同样的相加效应。

5C9 IgG和9D33 IgG对于由TSH和M22两者介导的对环AMP产生的刺激的相加效应都是类似的(表12和13)。

在每个细胞均表达大量野生型TSHR的CHO细胞中，5C9对基础(即未受激的)环AMP活性的效应

每个细胞均表达大约5×10⁵个受体的CHO细胞系与前文实验中(例如表9-13)使用的标准CHO细胞系(每个细胞表达大约5×10⁴个TSHR)相比，显示了较高水平的基础(即未受激的)环AMP，即分别是47.1±11.7pmol/mL和大约1.0pmol/mL。使用每个细胞均表达大量受体的细胞系评估了5C9 IgG和9D33 IgG对野生型TSHR基础活性的效应。与9D33 IgG和抗GAD(5B3)的阴性对照抗体的孵育导致了对基础环AMP活性的0-5.3％抑制(表14；实验1)，表明该阻断性小鼠MAb 9D33或对照MAb在表达野生型TSHR的CHO细胞中对基础环AMP产生没有效应。然而，在5C9 IgG的情形下观察到对基础环AMP活性的明显抑制(表14；实验2)，0.1μg/mL和10μg/mL分别导致45.7％和74.6％的抑制。另外，在每个细胞均表达大量野生型TSHR的CHO细胞中，5C9 Fab和5C9F(ab′)也是基础环AMP活性的有效抑制剂(表14实验3)。例如，1μg/mL和100μg/mL的5C9 Fab分别显示了对基础环AMP产生的39％和61％的抑制，均不同于100μg/mL的5C9F(ab′)的48％的抑制(表14实验3)。

具有拮抗剂(即阻断)活性的患者血清TSHR自身抗体在表达具有活化突变I568T的TSHR的CHO细胞中对基础(即未受激的)环AMP活性的效应

在存在20.5±8.7pmol/mL的环AMP测定缓冲液的情况下，TSHR I568T细胞的基础环AMP产生基本上不会受到添加来自健康捐血者的正常混合血清(NPS)或3种不同个体的健康捐血者血清(N1-N3)的影响，所述血清是以1/10和1/50的稀释度测验的。与在存在环AMP测定缓冲液的情况下的基础环AMP产生相比，在存在NPS和N1-N3血清的情况下的基础环AMP产生显示了0-14％的抑制(表15)。然而，在存在具有高水平阻断型TRAb的4种不同血清(B2-B5)的情况下则观察到对基础环AMP产生的23-89％的抑制(表15)。在存在5C9IgG(1μg/mL)的情况下，观察到对TSHR I568T基础环AMP活性的83％的抑制。表15中还显示了，2种阻断性血清(B3和B4)在表达具有I 568T突变的TSHR的CHO细胞中对基础环AMP产生的剂量响应效应。

这些结果表明，5C9具有患者阻断性TSHR自身抗体的TSHR阻断活性特征，具体地有关TSHR活化突变体I568T中对基础环AMP产生的抑制。

具有拮抗剂活性的患者血清TSHR自身抗体在表达具有活化突变S281I的TSHR的CHO细胞中对基础(即未受激的)环AMP活性的效应

在存在环AMP测定缓冲液的情况下，TSHR S281I细胞的基础环AMP产生为11.2±2.0pmol/mL，并且与健康捐血者混合血清或个体的健康捐血者血清(1/10或1/50稀释)的孵育没有效应(表16)。相反，在存在具有高水平阻断类型TRAb的4种不同血清(B2-B5)的情况下，观察到对基础环AMP产生的31-56％的抑制(表16)。在使用TSHR S281I的实验中，1μg/mL的5C9 IgG引起了对基础环AMP活性的71％的抑制。

具有拮抗剂活性的患者血清TSHR自身抗体在表达具有活化突变A623I的TSHR的CHO细胞中对基础(即未受激的)环AMP活性的效应

在存在环AMP测定缓冲液的情况下，TSHR A623I细胞的基础环AMP产生为43.5±11.2pmol/mL，并且基本不受与健康捐血者混合血清或个体的血清的孵育的影响(表17)。在这些实验中，与具有高水平阻断型TRAb的4种不同血清(B2-B5)进行孵育引起了对环AMP的-1％-56％的抑制(表17)。这可以与在相同实验中由1μG/mL的5C9 IgG引起的49％的抑制相比较。

在每个细胞均表达5×10⁵个野生型TSHR的CHO细胞中，具有拮抗剂活性的患者血清TSHR自身抗体对基础(即未受激的)环AMP活性的效应

在该系列实验中，在每个细胞均表达较高数目野生型TSHR的CHO细胞中的基础环AMP产生为28.1±0.7pmol/mL。当所述细胞与1/10稀释度的健康捐血者混合血清或个体血清(N1-N3)进行孵育时，基础环AMP水平的范围是在存在环AMP测定缓冲液的情况下的环AMP水平的99％-146％，而该范围在1/50的稀释度时为93％-137％。在具有阻断型TSHR自身抗体的4种测验血清中，一种血清(B2)对基础环AMP产生无效应(表18)。在两种血清(B3和B5)的情形下，环AMP的水平高于在存在环AMP测定缓冲液的情况下观察到的水平(表18)。有充分理由的是，血清B3和B5包含一种具有刺激活性和阻断活性的TSHR自身抗体的混合物。相反，以1/10和1/50稀释度的血清B4对基础环AMP产生有明显的抑制效应，即相与在存在环AMP测定缓冲液的情况下的水平相比分别为基础环AMP水平的31％和61％(表18)。与在存在环AMP测定缓冲液的情况下的水平相比，这可以与在存在1μg/mL的5C9 IgG的情况下33％的水平相比较(表18)。

总5C9 IgG在以野生型TSHR或以具有活化突变的TSHR转染的CHO细胞中对基础环AMP产生的效应，与使用来自对阻断型TSHR自身抗体阳性的患者的血清时观察到的效应类似。然而，在不同突变的情形下个体患者血清的效应是不同的(表19)。在野生型TSHR的情形下，一些血清显示了刺激效应，所述刺激效应被推测是由TSHR刺激性抗体以及阻断性抗体的存在引起(表19)。

5C9在表达包含氨基酸突变的TSHR的CHO细胞中对环AMP产生的刺激的效应

在表达具有氨基酸突变的TSHR的CHO细胞中，将5C9对环AMP产生的刺激的效应扩展至包括以下至丙氨酸的突变：Asp43、Glu61、His105、Glu107、Phe130、Glu178、Tyr185、Asp203、Tyr206、Lys209、Asp232、Lys250、Glu251、Thr257、Arg274和Asp276(表20a-p并总结于表21中)。

将TSHR的氨基酸Asp43、Glu61、His105、Glu107、Tyr185、Asp232和Thr275突变成丙氨酸，对5C9IgG抑制TSH刺激环AMP产生的能力没有效应。通过将TSHR Phe130、Glu178、Asp203、Tyr206、Lys250、Glu251和Asp276突变成丙氨酸，降低了5C9抑制TSH刺激环AMP产生的能力。在Lys209Ala和Asp274Ala这两个突变的情形下，5C9 IgG抑制TSH刺激环AMP产生的能力升高。

总之(表7、20和21)，与野生型TSHR比较，10个TSHR残基Lys129、Phe130、Asp151、Glu178、Lys183、Asp203、Tyr206、Lys250、Glu251和Asp276都降低了5C9抑制TSH的环AMP刺激的能力。TSHR的Lys129和Asp203突变显示了最大的效应并引起对5C9活性的完全抑制。

在表达野生型TSHR的CHO细胞中与在表达突变的TSHR Asp203Ala的CHO细胞中比较阻断性血清B2-B5对于由TSH介导的对环AMP产生的刺激的效应

1μg/mL的5C9对野生型TSHR的阻断效应(对TSH诱导的环AMP刺激的92％的抑制)在TSHR Asp203Ala突变的情形下降低至4％(表22)。

阻断性血清B4活性不受TSHR Asp203Ala突变的影响，而与野生型TSHR相比，在TSHR Asp203Ala的情形下，使用阻断性血清B2和B3时观察到对TSH诱导的环AMP刺激的抑制百分数稍低。

在一种血清B5的情形下，观察到对TSH诱导的环AMP刺激的抑制百分数出现了显著降低；即在野生型和突变的TSHR中不同，分别抑制69％和30％。

TSHR Asp203 Ala突变对5C9活性的效应大于对阻断性血清活性的效应，然而3/4的测验血清的阻断活性被影响至不同的程度。这可能表明了，用于阻断TSHR自身抗体的结合位点和5C9有重叠，但是与不同血清接触的实际TSHR氨基酸中存在一些差异。

总结和结论

上文描述的实验提供了这样的证据，即根据本发明的抗体(例如5C9)能阻断不同甲状腺刺激物的刺激活性，所述甲状腺刺激物包括人和小鼠TSHR刺激性抗体、天然的人和动物TSH以及重组人TSH。再者，提供了这样的证据，即两种不同的阻断类型的抗体——人MAb 5C9和小鼠MAb 9D33，在被单独测验时在表达TSHR的CHO细胞中具有阻断由TSH或M22介导的对环AMP的刺激的能力，并且在被混合在一块时显示出对TSH或M22刺激的可相加阻断效应。

根据本发明的抗体(例如5C9)对TSHR基础(即未受激的)环AMP活性的新效应。已通过使用具有更高基础环AMP水平的TSHR转染CHO细胞的实验研究了这些效应，即已确证了根据本发明的抗体(例如5C9)对基础环AMP活性的阻断效应。再者，已表明，一些含有具有阻断(拮抗剂)活性的TSHR自身抗体的血清在这些TSHR转染的细胞中具有阻断基础环AMP活性的能力。这些实验还提供了这样的证据，即根据本发明的抗体(例如5C9和血清TSHR阻断性抗体)对与活化TSHR突变相关的基础环AMP活性有阻断效应。

这些结果强调，5C9是一种显示阻断类型的TSHR自身抗体的特征的人Mab，即它是与自身免疫甲状腺疾病相关的患者血清TSHR自身抗体的代表。

所述的实验还使得可鉴定这样的一些TSHR氨基酸，即这些TSHR氨基酸对于根据本发明的抗体的阻断活性是重要的。

总的来说，这些结果表明，根据本发明的抗体(例如5C9)与在来自患自身免疫甲状腺疾病患者的不同血清中出现的TSHR阻断性抗体相比，显示出类似的TSHR结合活性及类似的对TSHR功能的生物效应。因此，由于具有血清阻断性TSHR自身抗体的特征和生物活性，根据本发明的抗体(例如5C9)可在多种临床病症中用于将TSHR失活。这些病症包括TSH介导的TSHR活化、由甲状腺刺激性TSHR自身抗体介导的TSHR活化、基础(即未受激的、组成型)TSHR活性以及与活化性TSHR突变相关的TSHR活化。因此，根据本发明的抗体(例如5C9)可应用于对与上文提及的TSHR活化相关的病症进行治疗和控制；例如格雷夫斯病、格雷夫斯眼病、由TSHR活化突变引起的甲状腺功能亢进症、由TSH水平异常(病理学的或药理学的)引起的甲状腺功能亢进症、甲状腺癌和甲状腺癌转移。

表1

5C9 IgG、捐淋巴细胞者IgG、捐淋巴细胞者血浆对于¹²⁵I-TSH、¹²⁵I-M22 IgG或¹²⁵I-5C9 IgG与经TSHR涂覆的管结合的抑制

  样品  ¹²⁵I-TSH  (抑制％)  ¹²⁵I-M22 IgG  (抑制％)  ¹²⁵I-5C9  (抑制％)  捐献者血浆(稀释于HBD混合物中)  1/5  97  92  93  1/10  95  91  92  1/20  82  85  82  1/40  57  75  56  1/80  30  53  29  1/160  16  29  13  1/320  8  13  10  捐献者IgG(稀释于1mg/mL HBD混合  IgG中)  1mg/mL  94  89  91  0.5mg/mL  90  86  89  0.25mg/mL  63  79  64  0.1mg/L  29  51  26  0.05mg/mL  13  29  15  0.025mg/mL  2  17  5  0.01mg/mL  5  9  1

  5C9 IgG(稀释于100μg/mL 2G4中)  100μg/mL  84  85  88  50μg/mL  76  81  80  25μg/mL  67  69  71  10μg/mL  54  60  59  5μg/mL  47  53  54  2.5μg/mL  42  43  49  1μg/mL  37  31  42  0.5μg/mL  33  32  41  0.1μg/mL  29  22  34  0.05μg/mL  25  19  30  0.01μg/mL  13  9  15  0.005μg/mL  12  5  11  0.001μg/mL  3  2  3

标记的示踪物与经TSHR涂覆的管的平均结合％为：

在用¹²⁵I-TSH的实验中14％；

在用¹²⁵I-M22 IgG的实验中21％；

并且在用¹²⁵I-5C9的实验中20％；

HBD混合物＝健康捐血者血清的混合物；

2G4＝对照IgG(抗甲状腺过氧化物酶的人MAb)。

表2a

5C9 IgG或捐淋巴细胞者血清IgG在表达人TSHR的CHO细胞中对于环AMP产生的TSH刺激的效应

  样品  IgG浓度  环AMP(fmol/细胞孔；  平均值±SD，n＝3)  仅pTSH(3ng/mL)  19020±2154  仅5C9 IgG  1μg/mL  141±5  5C9 IgG+pTSH(3ng/mL)  1μg/mL  2208±329  5C9 IgG+pTSH(3ng/mL)  0.5μg/mL  4754±876  5C9 IgG+pTSH(3ng/mL)  0.1μg/mL  11874±4214  5C9 IgG+pTSH(3ng/mL)  0.08μg/mL  14525±3690  5C9 IgG+pTSH(3ng/mL)  0.06μg/mL  13290¹  5C9 IgG+pTSH(3ng/mL)  0.04μg/mL  13928±1572  5C9 IgG+pTSH(3ng/mL)  0.02μg/mL  16432±9286  5C9 IgG+pTSH(3ng/mL)  0.01μg/mL  18969±5308  仅环AMP测定缓冲液  207±51  捐献者血清^a1/10  1.43mg/mL^b  1102±46  捐献者血清1/10+pTSH(3ng/mL)  1.43mg/mL  5931±350  捐献者血清1/20+pTSH(3ng/mL)  0.715mg/mL  16886±728  捐献者血清1/30+pTSH(3ng/mL)  0.477mg/mL  16453±3455  捐献者血清1/40+pTSH(3ng/mL)  0.358mg/mL  17716±1753  捐献者血清1/50+pTSH(3ng/mL)  0.286mg/mL  17928±4772

  捐献者血清1/100+pTSH(3ng/mL)  0.143mg/mL  18226±2268

¹单次测定

^a按所示将捐献者血清稀释于环AMP测定缓冲液

^b通过浊度法测定的未稀释血清IgG浓度为14.3mg/mL

5C9 IgG和TSH稀释于环AMP测定缓冲液中。

表2b

5C9 IgG、F(ab′)₂和Fab片段在表达人TSHR的CHO细胞中对TSH诱导的环AMP产生的抑制

实施例1

  样品  环AMP(fmol/细胞孔；平均值±SD，n＝3)  仅环AMP测定缓冲液  586±148  仅TSH 3ng/mL  18557±363  仅5C9 Fab 100μg/mL  235±35  5C9 Fab 100μg/mL+TSH  938±93  5C9 Fab 10μg/mL+TSH  1283±239  仅5C9 F(ab′)₂100μg/mL  204±12  5C9 F(ab′)₂100μg/mL+TSH  877±195  5C9 F(ab′)₂10μg/mL+TSH  916±188  仅5C9 IgG 100μg/mL  237±54  5C9 IgG 100μg/mL+TSH  754±177  5C9 IgG 10μg/mL+TSH  247±115  2G4 IgG 100μg/mL+TSH  6082¹

实施例2

 样品  环AMP(fmol/细胞孔；平均值±SD，n＝3) 仅环AMP测定缓冲液  584±111 仅TSH 3ng/mL  19363±5198 仅2G4 IgG 100μg/mL  608±169

  2G4 IgG 100μg/mL+TSH  18147±972  2G4 IgG 10μg/mL+TSH  18114±6544  仅5C9 F(ab′)₂100μg/mL  414±22  5C9 F(ab′)₂100μg/mL+TSH  1058±223  5C9 F(ab′)₂10μg/mL+TSH  1333±443  仅5C9 IgG 100μg/mL  338±108  5C9 IgG 100μg/mL+TSH  1109±375  5C9 IgG 10μg/mL+TSH  723±71  5C9 Fab 100μg/mLonly  212±37  5C9 Fab 100μg/mL+TSH  867±127  5C9 Fab 10μg/mL+TSH  4131±776

¹双份样品的平均值

2G4＝对照IgG(抗甲状腺过氧化物酶的人MAb)。

抗体和TSH制品稀释于环AMP测定缓冲液中。

表2c

5C9 IgG和9D33 IgG在表达人TSHR的CHO细胞中对于由TSH或M22Fab对环AMP产生的刺激的效应

  测验样品  环AMP产生  (fmol/细胞孔；平均值±SD n＝3)  仅环AMP测定缓冲液  473±21  仅pTSH 3ng/mL  12,270±980  仅5C9 IgG 100μg/mL  426±27  仅5C9 IgG 10μg/mL  360±53  仅5C9 IgG 1μg/mL  376±18  仅5C9 IgG 0.1μ/mL  404±42  仅5C9 IgG 0.01μg/mL  578±65  仅5C9 IgG 0.001μg/mL  554±47  5C9IgG 100μg/mL+pTSH 3ng/mL  1094±70  5C9 IgG 10μg/mL+pTSH 3ng/mL  1028±47  5C9 IgG 1μg/mL+pTSH 3ng/mL  1872±168  5C9 IgG 0.1μg/mL+pTSH 3ng/mL  3920±464  5C9 IgG 0.01μg/mL+pTSH 3ng/mL  15,050±386  5C9 IgG 0.001μg/mL+pTSH 3ng/mL  14,147±1,310  仅9D33 IgG 100μg/mL  626±127  9D33 IgG 100μg/mL+pTSH 3ng/mL  2,218±5  仅M22 Fab 3ng/mL  9,432±822  5C9 IgG 100μg/mL+M22Fab 3ng/mL  354±56

  5C9 IgG 10μg/mL+M22Fab 3ng/mL  638¹±190  5C9 IgG 1μg/mL+M22Fab 3ng/mL  956±169  5C9 IgG 0.1μg/mL+M22Fab 3ng/mL  1,298±134  5C9 IgG 0.01μg/mL+M22Fab 3ng/mL  9,978±919  5C9 IgG 0.001μg/mL+M22Fab 3ng/mL  11,614±393  9D33 IgG 100μg/mL+M22Fab 3ng/mL  1,048±10

¹双份样品的平均值

9D33是一种可在表达TSHR的CHO细胞中阻断由TSH和TRAb介导的对环AMP产生的刺激的小鼠抗体。

抗体和TSH制品稀释于环AMP测定缓冲液中。

表3

¹²⁵I-5C9 IgG、¹²⁵I-TSH和¹²⁵I-M22 IgG与经TSHR涂覆的管的结合及患者血清样品对其的抑制

  血清样品  ¹²⁵I-5C9  结合抑制(％)  ¹²⁵I-TSH  结合抑制(％)  ¹²⁵I-M22  结合抑制(％)  N1  15.7  0  9.3  N2  3.3  1.2  7.2  N3  15.3  1.9  0.7  N4  4.0  4.2  0  N5  18.9  6.3  11.4  N6  5.9  2.9  1.4  N7  17.1  7.2  9.4  N8  5.5  0  0  N9  11.2  4.2  2.9  N10  10.5  6.5  5.8  G1  79.6  83.6  80.5  G2  75.8  77.5  73.5  G3  82.2  77.5  78.1  G4  77.7  74.9  74.8  G5  77.0  73.6  71.5  G6  64.7  71.6  69.1  G7  75.6  74.3  66.0  G8  73.7  74.7  77

  G9  76.1  78.5  79.2  G10  75.9  75.8  69.9  G11  81.6  82.5  79.7  G12  71.6  76.6  73.9  G13  72.3  71.1  70.2  G14  81.9  85.8  80.9  G15  84.9  85.3  84.4  G16  80.5  84.9  81.7  G17  85.0  86.9  85.3  G18  84.9  85  84.2  G19  85.1  87.3  85.4  G20  84.4  89.3  87.7  G21  77.6  84.9  77.0  G22  67.1  59.7  61.5  G23  57.5  62.2  59.5  G24  65.7  67.1  64.4  G25  59.3  56.3  62.3  G26  38.4  67.7  69.4  G27  22.0  59.1  58.9  G28  68.3  69.7  72.8  G29  40.9  54.2  50.4  G30  71.2  69.1  72  G31  62.2  59.2  62.0

  G32  46.0  40.6  49.2  G33  44.0  25.9  37.2  G34  52.0  48  55.0  G35  60.1  54.4  60.7  G36  29.3  31.4  43.2  G37  49.0  44.1  45.5  G38  40.1  26.7  29.8  G39  66.4  54.7  58.9  G40  48.8  48.5  48.5

N1-10＝来自健康捐血者的血清

G1-G40＝来自有格雷夫斯病史的患者的血清

结果为十分一致的两次测定的平均值

其中A＝存在测验血清的情况下的结合；B＝存在健康捐血者血清混合物(HBD混合物)的情况下的结合。

¹²⁵I-5C9在存在HBD混合物的情况下显示20％的结合、¹²⁵I-TSH在存在HBD混合物的情况下显示12％的结合并且¹²⁵I-M22在存在HBD混合物的情况下显示17％的结合。

表4a

比较具有阻断或刺激活性的患者血清对于¹²⁵I-5C9IgG、¹²⁵I-TSH和¹²⁵I-M22 IgG与经TSHR涂覆的管的结合的抑制

  测定样品  ¹²⁵I-5C9  结合抑制(％)  ¹²⁵I-TSH  结合抑制(％)  ¹²⁵I-M22  结合抑制(％)  测定校验物  40U/L  87  90  84.4  8U/L  62  67  63.0  2U/L  15  27  25.6  1U/L  4.3  15  14.8  阳性对照血清  34  35  38.7  阻断性血清  B1  1/5  93  95  91.7  1/10  92  94  89.2  1/20  91  91  85.9  1/40  85  80  78.8  1/80  67  55  67.4  1/160  33  33  45.9  1/320  20  17  26.4

  B2  1/5  92  91  86.6  1/10  85  85  79.5  1/20  NT  73  66.2  1/40  68  51  50.0  1/80  42  34  29.7  1/160  19  22  20.3  1/320  NT  13  7.8  B3  1/5  89  93  85.5  1/10  82  84  76.3  1/20  62  64  61.7  1/40  37  44  42.5  1/80  14  26  26.2  1/160  NT  12  16.6  1/320  NT  7  8.9  B4  1/5  93  94  90.3  1/10  93  95  88.5  1/20  92  93  85.1  1/40  89  89  81.1

  1/80  78  76  72.1  1/160  56  54  56.9  1/320  34  37  39.9  B5  1/5  94  93  90.3  1/10  91  92  87.0  1/20  87  87  82.2  1/40  74  72  71.7  1/80  56  47  54.6  1/160  31  29  36.4  1/320  19  17  21.4  刺激性血清  S1  1/5  89  91  84.9  1/10  80  84  75.4  1/20  63  67  62.9  1/40  42  50  46.2  1/80  26  34  31.9  1/160  9  21  16.3  1/320  16  4  10.6

表4b

  测验样品  ¹²⁵I-5C9  结合抑制(％)  ¹²⁵I-TSH  结合抑制(％)  ¹²⁵I-M22  结合抑制(％)  测定校验物  40U/L  87.2  90.4  82.2  8U/L  62.0  67.2  63.3  2U/L  2113  22.0  27.9  1U/L  15.0  13.0  21.8  阳性对照血清  34.2  31.4  38.6  HBD混合物  6.2  -0.6  12.5  S2  纯品  91.8  95.1  88.6  1/5  76.7  84.5  72.7  1/10  62.3  71.4  66.4  1/20  48.2  57.0  51.9  1/40  31.8  39.3  41.4  1/80  21.3  19.4  32.9  1/160  16.8  9.7  25.1  S4

  纯品  91.0  92.9  86.2  1/5  71.0  72.4  68.7  1/10  55.5  55.6  57.4  1/20  39.9  34.0  46.3  1/40  27.3  16.4  35.4  1/80  17.0  8.6  25.4  1/160  16.1  2.1  19.5

B1-B5为含有高水平的具有拮抗剂(阻断)活性的TRAb的患者血清。

B3是来自捐淋巴细胞者的5C9血清

S1、S2和S4为含有高水平的具有激动剂(刺激)活性的TRAb的患者血清。

测定校验物40U/L、8U/L、2U/L和1U/L为M22 IgG在健康捐血者血清混合物(HBD混合物)中的稀释物，以U/L的NIBSC 90/672表示的活性是通过对经标记的TSH与经TSHR涂覆的管的结合的抑制来进行评估。

其中A＝试验样品；B＝HBD混合物

NT＝未试验

1/5、1/10等表示试验血清在HBD混合物中的稀释因子，纯品＝未稀释的血清

在存在HBD混合物的情况下，大约20％、17％和12％的经¹²⁵I-标记的M22IgG、5C9 IgG和TSH分别结合于经TSHR涂覆的管。

表5

不同浓度的抗TSHR的小鼠MAb对于经¹²⁵I-标记的TSH、¹²⁵I-M22 IgG和¹²⁵I-5C9 IgG与经TSHR涂覆的管的结合的抑制

  2G2 IgG⁷   100μg/mL  2G2 IgG    10μg/mL  2G2 IgG    1μg/mL  2G2 IgG    0.1μg/mL  2G2 IgG    0.01μg/mL  0.1  3  6  2  2  0  0.6  1.5  0.2  1.4  11  10  12  9  11

抗体稀释于健康捐血者血清混合物(HBD混合物)中。

其中A＝存在测验样品的情况下的结合％；B＝存在HBD混合物的情况下的结合％。

¹具有甲状腺刺激活性的小鼠TSHR MAb

²可阻断由TSH和TRAb介导的对环AMP产生的刺激的小鼠TSHR MAb(见表2)

³抗甲状腺过氧化物酶MAb的人MAb(阴性对照)

⁴具有TSH阻断活性的小鼠TSHR MAb(可识别由TSHR氨基酸381-385形成的表位)

⁵具有TSH阻断活性的小鼠TSHR MAb(可识别由TSHR氨基酸36-42形成的表位)

⁶具有TSH阻断活性的小鼠TSHR MAb(可识别由TSHR氨基酸246-260形成的表位)

³小鼠Tg MAb(阴性对照)

在存在HBD混合物的情况下，大约13％、24％和15％的经¹²⁵I-标记的5C9IgG、M22IgG和TSH分别结合于经TSHR涂覆的管。

表6a

5C9 IgG在表达人TSHR的CHO细胞中对于由患者血清中TRAb对环AMP产生的刺激的效应

实验1a

  试验样品  环AMP(fmol/细胞孔平均值±SD；n＝3)  仅环AMP测定缓冲液  378±21  仅HBD混合物  352±38  HBD混合物+2G4 IgG  316±54  HBD混合物+5C9 IgG  136±46  仅T1  13734±580  T1+2G4 IgG  10928±740  T1+5C9 IgG  142±4  仅T2  1716±185  T2+2G4 IgG  1362±190  T2+5C9 IgG  146±4  仅T3  11722±1280  T3+2G4 IgG  11948±3200  T3+5C9 IgG  5660±790  仅T4  6388±820  T4+2G4 IgG  6022±710  T4+5C9 IgG  188±65

  仅T5  3084±990  T5+2G4 IgG  2152±240  T5+5C9 IgG  152±15  仅T6  14802±1475  T6+2G4 IgG  10878±675  T6+5C9 IgG  232±25

实验1b

  试验样品  环AMP(fmol/细胞孔平均值±SD；n＝3)  仅环AMP测定缓冲液  434±52  仅HBD混合物  518±216  HBD混合物+2G4 IgG  378±34  HBD混合物+5C9 IgG  178±47  仅T7  7388±1250  T7+2G4 IgG  5696±715  T7+5C9 IgG  ud  仅T8  1736¹  T8+2G4 IgG  1392¹  T8+5C9 IgG  ud  仅T9  5052¹  T9+2G4 IgG  5000¹

  T9+5C9 IgG  ud

实验1c

  样品  环AMP(fmol/细胞孔平均值±SD；n＝3)  仅环AMP测定缓冲液  366±316  仅HBD混合物  646±62  HBD混合物+2G4 IgG  496±42  HBD混合物+5C9 IgG  294±92  仅T13  4030±1146  T13+2G4 IgG  3330±63  T13+5C9 IgG  540±36  仅T14  5490±197  T14+2G4 IgG  4470±1867  T14+5C9 IgG  510±146  仅T15  2130±387  T15+2G4 IgG  2380±320  T15+5C9 IgG  ud  仅T16  4990±155  T16+2G4 IgG  5270±941  T16+5C9 IgG  ud  仅T17  4410±470  T17+2G4 IgG  4460±288

  T17+5C9 IgG  ud  仅T18  910±126  T18+2G4 IgG  830±21  T18+5C9 IgG  ud

实验1d

  样品  环AMP(fmol/细胞孔平均值±SD；n＝3)  仅环AMP测定缓冲液  487±75  仅HBD混合物  285±71  HBD混合物+2G4 IgG  311±68  HBD混合物+5C9 IgG  108±33  仅T11  4052±233  T11+2G4 IgG  4659±1260  T11+5C9 IgG  154±33  仅T12  4058±721  T12+2G4 IgG  5556±593  T12+5C9 IgG  145±24

ud＝未检测

¹＝两次测定

HBD混合物为健康捐血者血清的混合物；这些实验中所用的是在环AMP测定缓冲液中以1∶10的稀释度稀释。

T1-T9和T11-T18为在表达TSHR的CHO细胞中刺激环AMP产生的血清。T1-T9和T11-T18以1∶10稀释于环AMP测定缓冲液中进行试验。

2G4是一种抗甲状腺过氧化物酶的人单克隆抗体(阴性对照)。

2G4 IgG和5C9 IgG在100μg/mL下进行试验。

表6b

5C9 IgG和9D33 IgG在表达人TSHR的CHO细胞中对于由患者血清中TRAb对环AMP产生的刺激的剂量响应效应

实验2

  试验样品  环AMP(fmol/细胞孔平均值±SD；n＝3)  仅环AMP测定缓冲液  707±147  仅HBD混合物  503±80  仅T1  20336±1539  仅100μg/mL2G4I gG  (阴性对照IgG)  1207±123  T1+100μg/mL 2G4 IgG  22078±2546  T1+10μg/mL 2G4 IgG  18868±1806  T1+1μg/mL 2G4 IgG  19025±1450  T1+0.1μg/mL 2G4 IgG  16659±1031  T1+0.01μg/mL 2G4 IgG  20876±1887  T1+0.001μg/mL 2G4g IgG  18134±2126  仅100μg/mL 9D33g IgG  721±183  T1+100μg/mL 9D33 IgG  1061±104  T1+10μg/mL 9D33 IgG  1464±191  T1+1μg/mL 9D33 IgG  4990±1670

  T1+0.1μg/mL 9D33 IgG  17867±2220  T1+0.01μg/mL 9D33 IgG  19943±1834  T1+0.001μg/mL 9D33 IgG  21648±502  仅100μg/mL 5C9 IgG  301±38  T1+100μg/mL 5C9 IgG  724±28  T1+10μg/mL 5C9 IgG  1119±348  T1+1μ.g/mL 5C9 IgG  2428±594  T1+0.1μg/mL 5C9 IgG  16152±3577  T1+0.01μg/mL 5C9 IgG  20314±279  T1+0.001μg/mL 5C9 IgG  16868±912

T1为在表达TSHR的CHO细胞中刺激环AMP产生的患者血清样品；以1∶10稀释于环AMP测定缓冲液中进行试验。

2G4是一种抗甲状腺过氧化物酶的人单克隆抗体(阴性对照)。

9D33为一种抗阻断由TSH和TRAb刺激的环AMP产生的TSHR的小鼠单克隆抗体(见表2)

表6c

5C9 IgG在表达人TSHR的CHO细胞中对于由患者血清TRAb对环AMP产生的刺激的剂量响应效应

实验3

  试验样品  环AMP(fmol/细胞孔平均值±SD；n＝3)  仅环AMP测定缓冲液  757±138  仅HBD混合物  512±76  仅T6  14216±3985  仅100μg/mL9D33 IgG  729±31  T6+100μg/mL 9D33 IgG  1052±702  T6+10μg/mL 9D33 IgG  2256±1088  T6+1μg/mL 9D33 IgG  5447±313  T6+0.1μg/mL 9D33 IgG  8700±665  T6+0.01μg/mL 9D33 IgG  10290±495  T6+0.001μg/mL 9D33 IgG  10296¹  仅100μg/mL 5C9 IgG  360±38  T6+100μg/mL 5C9 IgG  295±30  T6+10μg/mL 5C9 IgG  1027±368  T6+1μg/mL 5C9 IgG  2368±528  T6+0.1μg/mL 5C9 IgG  9533±1679

  T6+0.01μg/mL 5C9 IgG  13883±1718  T6+0.001μg/mL 5C9 IgG  11843±1241

¹单次测定

见表6a和6b的说明性脚注。

表6d

5C9 IgG在表达人TSHR的CHO细胞中对于由患者血清中TRAb对环AMP产生的刺激的剂量响应效应

  样品  环AMP(fmol/细胞孔平均值±SD；n＝3)  仅环AMP测定缓冲液  622±79  仅HBD混合物  479±53  仅T3  14023±2487  仅100μg/mL 2G4 IgG  745±136  T3+100μg/mL 2G4 IgG  12086±2613  T3+10μg/mL 2G4 IgG  12862±250  T3+1μg/mL 2G4 IgG  12931±891  T3+0.1μg/mL 2G4 IgG  13853±1589  T3+0.01μg/mL 2G4 IgG  11939±131  T3+0.001μg/mL 2G4 IgG  13650±1679  仅100μg/mL 9D33 IgG  616±111  T3+100μg/mL 9D33 IgG  1597±323  T3+10μg/mL 9D33 IgG  4262±367  T3+1μg/mL 9D33 IgG  7385±554  T3+0.1μg/mL 9D33 IgG  11960±1390  T3+0.01μg/mL 9D33 IgG  12178±1676

  T3+0.001μg/mL 9D33 IgG  12159±2970  仅100μg/mL 5C9 IgG  212±40  T3+100μg/mL 5C9 IgG  6136±558  T3+10μg/mL 5C9 IgG  7806±793  T3+1μg/mL 5C9 IgG  8075±610  T3+0.1μg/mL 5C9 IgG  10414±1094  T3+0.01μg/mL 5C9 IgG  13743±1687  T3+0.001μg/mL 5C9 IgG  11641±2168

参见表6a和6b的说明性脚注。

表6e

5C9 IgG在表达人TSHR的CHO细胞中对于由TRAb患者血清对环AMP产生的刺激的剂量响应效应

  样品  环AMP(fmol/细胞孔平均值±SD；n＝3)  仅环AMP测定缓冲液  616±161  仅HBD混合物  312±56  仅T19  6014±280  仅100μg/mL 2G4 IgG  1058±75  T19+100μg/mL 2G4 IgG  7142±215  T19+10μg/mL 2G4 IgG  6182±46  T19+1μg/mL 2G4 IgG  7280±1052  T19+0.1μg/mL 2G4 IgG  7275±145  T19+0.01μg/mL 2G4 IgG  6820±729  T19+0.001μg/mL 2G4 IgG  7620±870  仅100μg/mL 9D33 IgG  592±168  T19+100μg/mL 9D33 IgG  550±65  T19+10μg/mL 9D33 IgG  448±76  T19+1μg/mL 9D33 IgG  404±36  T19+0.1μg/mL 9D33 IgG  2394¹  T19+0.01μg/mL 9D33 IgG  5765¹

  T19+0.001μg/mL 9D33 IgG  7088±668  仅100μg/mL 5C9 IgG  186²  T19+100μg/mL 5C9 IgG  220±90  T19+10μg/mL 5C9 IgG  275±150  T19+1μg/mL 5C9 IgG  187±34  T19+0.1μg/mL 5C9 IgG  375±129  T19+0.01μg/mL 5C9 IgG  5747±411  T19+0.001μg/mL 5C9 IgG  6467¹

¹双份样品的平均值

²单次测定

参见表6a和6b的说明性脚注。

表6f

5C9 IgG在表达人TSHR的CHO细胞中对于由患者血清中TRAb对环AMP产生的刺激的剂量响应效应

  样品  环AMP(fmol/细胞孔平均值±SD；n＝3)  仅环AMP测定缓冲液  255±40  仅HBD混合物  200±82  仅T21  4764±732  仅100μg/mL 2G4 IgG  835±94  T20+100μg/mL 2G4 IgG  6684±931  T20+10μg/mL 2G4 IgG  4571±776  T20+1μg/mL 2G4 IgG  5744±727  T20+0.1μg/mL 2G4 IgG  4323±849  T20+0.01μg/mL 2G4 IgG  6396±1314  T20+0.001μg/mL 2G4 IgG  6789±893  仅100μg/mL 9D33 IgG  382±142  T20+100μg/mL 9D33 IgG  287±164  T20+10μg/mL 9D33 IgG  204±49  T20+1μg/mL 9D33 IgG  980¹  T20+0.1μg/mL 9D33 IgG  5362±574  T20+0.01μg/mL 9D33 IgG  5389±1139

  T20+0.001μg/mL 9D33 IgG  7514±785  仅100μg/mL 5C9 IgG  224±109  T20+100μg/mL 5C9 IgG  NT  T20+10μg/mL 5C9 IgG  NT  T20+1μg/mL 5C9 IgG  181¹  T20+0.1μg/mL 5C9 IgG  2184±1078  T20+0.01μg/mL 5C9 IgG  6486±436  T20+0.001μg/mL 5C9 IgG  4856¹

¹双份样品的平均值

NT＝未试验

参见表6a和6b的说明性脚注。

表6g

5C9 IgG在表达人TSHR的CHO细胞中对于由患者血清中TRAb对环AMP产生的刺激的剂量响应效应

  样品  环AMP(fmol/细胞孔平均值±SD；n＝3)  仅环AMP测定缓冲液  466±65  仅HBD混合物  390±118  仅T21  9781±1672  仅100μg/mL 2G4 IgG  999±55  T21+100μg/mL 2G4 IgG  10848±373  T21+10μg/mL 2G4 IgG  10355±469  T21+1μg/mL 2G4 IgG  10831±140  T21+0.1μg/mL 2G4 IgG  12215±793  T21+0.01μg/mL 2G4 IgG  13014±855  T21+0.001μg/mL 2G4 IgG  10500±162  仅100μg/mL9D33 IgG  534±89  T21+100μg/mL 9D33 IgG  442±32  T21+10μg/mL 9D33 IgG  605±254  T21+1μg/mL 9D33 IgG  1383±66  T21+0.1μg/mL 9D33 IgG  8719±389  T21+0.01μg/mL 9D33 IgG  10772±799

  T21+0.001μg/mL 9D33 IgG  10229±714  仅100μg/mL 5C9 IgG  253±25  T21+100μg/mL 5C9 IgG  210±60  T21+10μg/mL 5C9 IgG  303±107  T21+1μg/mL 5C9 IgG  418±65  T21+0.1μg/mL 5C9 IgG  7483±415  T21+0.01μg/mL 5C9 IgG  10441±122  T21+0.001μg/mL 5C9 IgG  11281±911

参见表6a和6b的说明性脚注。

表71

在表达野生型TSHR和Lys58突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中TSH诱导的环AMP产生。不同稀释度的5C9 IgG的效应。

¹双份样品的平均值

pTSH浓度＝3ng/mL

所有稀释都于环AMP测定缓冲液中

2G4是一种抗甲状腺过氧化物酶的人单克隆抗体(5C9的阴性对照)。

表7b

在表达野生型TSHR和Ile60突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中TSH诱导的环AMP产生。不同稀释度的5C9 IgG的效应。

参见表7a的说明性脚注。

表7c

在表达野生型TSHR和Arg80突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中TSH诱导的环AMP产生。不同稀释度的5C9 IgG的效应。

参见表7a的说明性脚注。

表7d

在表达野生型TSHR和Arg80突变成天冬氨酸的TSHR的CHO细胞中TSH诱导的环AMP产生。不同稀释度的5C9 IgG的效应。

参见表7a的说明性脚注。

表7e

在表达野生型TSHR和Tyr82突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中TSH诱导的环AMP产生。不同稀释度的5C9 IgG的效应。

参见表7a的说明性脚注。

表7f

在表达野生型TSHR和Thr104突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中TSH诱导的环AMP产生。不同稀释度的5C9 IgG的效应。

参见表7a的说明性脚注。

表7g

在表达野生型TSHR和Arg109突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中TSH诱导的环AMP产生。不同稀释度的5C9 IgG的效应。

参见表7a的说明性脚注。

表7h

在表达野生型TSHR和Lys 129突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中TSH诱导的环AMP产生。不同稀释度的5C9 IgG的效应。

参见表7a的说明性脚注。

表7i

在表达野生型TSHR和Phe134突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中TSH诱导的环AMP产生。不同稀释度的5C9 IgG的效应。

参见表7a的说明性脚注。

表7j

在表达野生型TSHR和Asp151突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中TSH诱导的环AMP产生。不同稀释度的5C9 IgG的效应。

参见表7a的说明性脚注。

表7k

在表达野生型TSHR和Asp151突变成精氨酸的TSHR的CHO细胞中TSH诱导的环AMP产生。不同稀释度的5C9 IgG的效应。

参见表7a的说明性脚注。

表7l

在表达野生型TSHR和Asp160突变成赖氨酸的TSHR的CHO细胞中TSH诱导的环AMP产生。不同稀释度的5C9 IgG的效应。

M22浓度＝3mg/mL

参见表7a的其他说明性脚注。

表7m

在表达野生型TSHR和Lys183突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中TSH诱导的环AMP产生。不同稀释度的5C9 IgG的效应。

参见表7a的说明性脚注。

表7n

在表达野生型TSHR和Lys183突变成天冬氨酸的TSHR的CHO细胞中TSH诱导的环AMP产生。不同稀释度的5C9 IgG的效应。

参见表7a的说明性脚注。

表7o

在表达野生型TSHR和Gln235突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中TSH诱导的环AMP产生。不同稀释度的5C9 IgG的效应。

参见表7a的说明性脚注。

表7p

在表达野生型TSHR和Arg255突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中TSH诱导的环AMP产生。不同稀释度的5C9 IgG的效应。

参见表7a的说明性脚注。

表7q

在表达野生型TSHR和Arg255突变成天冬氨酸的TSHR的CHO细胞中TSH诱导的环AMP产生。不同稀释度的5C9 IgG的效应。

参见表7a的说明性脚注。

表7r

在表达野生型TSHR和Trp258突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中TSH诱导的环AMP产生。不同稀释度的5C9 IgG的效应。

参见表7a的说明性脚注。

表7s

在表达野生型TSHR和Ser281突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中TSH诱导的环AMP产生。不同稀释度的5C9 IgG的效应。

参见表7a的说明性脚注。

表8

比较使用基于对TSH-生物素结合或5C9 IgG-生物素结合的抑制的ELISA获得的血清TRAb测定结果

  D  2.069  3  0.24  2.27  6  0.31  E  1.789  16  1.12  2.189  10  0.49  F  1.454  32  2.43  1.791  26  1.85  G  1.053  51  4.41  1.123  54  4.12  H  1.242  42  3.37  1.309  46  3.4  I  0.208  90  28.01  0.174  93  18.32  健康捐血者  血清  4276  2.182  -2  0  2.451  -1  0  4280  2.292  -7  0  2.621  -8  0  4281  2.138  0  0  2.529  -4  0  4282  2.204  -3  0  2.6  -7  0  4284  2.306  -8  0  2.613  -8  0  4285  2.328  -9  0  2.756  -14  0  4286  2.34  -9  0  2.691  -11  0  4289  2.381  -11  0  2.628  -9  0

测定校验物40U/L、8U/L、2U/L和1U/L为M22 IgG在健康捐血者血清混合物(HBD混合物)中的稀释物，以U/L的NIBSC 90/672表示的活性是通过对经标记的TSH与经TSHR涂覆的管的结合的抑制来进行评估。测定阴性对照为HBD混合物。

表9

5C9 IgG对于甲状腺刺激性小鼠MAb(mTSMAb)的TSHR刺激的效应

  仅缓冲液  3.39±1.35  1.56±1.84  4.32±0.95

^a稀释于环AMP测定缓冲液中

^b2G4是一种对照的抗甲状腺过氧化物酶的人单克隆抗体。

表10

5C9 IgG对于不同TSH制品的TSHR刺激的效应

实验1

 稀释于环AMP测定缓冲液中的试验样品  表达野生型TSHR的CHO细胞中的  环AMP浓度(pmol/mL平均值±SD；n＝3) 仅缓冲液  0.37±0.15 仅天然的人TSH 100ng/mL  36.14±1.83 天然的人TSH 100ng/mL和 0.001μg/mL 5C9 IgG.  36.0±6.1 天然的人TSH 100ng/mL和 0.01μg/mL 5C9 IgG  18.0±5.4 天然的人TSH 100ng/mL和 0.1μg/mL 5C9 IgG  0.20±0.06 天然的人TSH 100ng/mL和 1.0μg/mL 5C9 IgG  0.14±0.02 天然的人TSH 100ng/mL和 10μg/mL 5C9 IgG  0.11±0.04 天然的人TSH 100ng/mL和  0.16±0.03

  100μg/mL 5C9 IgG  仅重组体人TSH 100ng/mL  12.73±4.0  重组体人TSH 100ng/mL和  0.001μg/mL 5C9 IgG.  13.63±1.7  重组体人TSH 100ng/mL和  0.01μg/mL 5C9 IgG  8.13±2.13  重组体人TSH 100ng/mL和  0.1μg/mL 5C9 IgG  0.12±0.06  重组体人TSH 100ng/mL和  1.0μg/mL 5C9 IgG  0.10±0.03  重组体人TSH 100ng/mL和  10μg/mL 5C9 IgG  0.12±0.05  重组体人TSH 100ng/mL和  100μg/mL 5C9 IgG  0.19±0.08

实验2

 稀释于环AMP测定缓冲液中的试验样品  表达野生型TSHR的CHO细胞中的  环AMP浓度(pmol/mL平均值±SD；n＝3)

  仅缓冲液  0.18±0.08  仅天然的人TSH 100ng/L  40.8±6.92  天然的人TSH 100ng/mL和  0.001μg/mL 5C9 IgG.  37.6±6.35  天然的人TSH 100ng/mL和  0.01μg/mL 5C9 IgG  34.4±2.28  天然的人TSH 100ng/mL和  0.1μg/mL 5C9 IgG  15.8±1.39  天然的人TSH 100ng/mL和  1.0μg/mL 5C9 IgG  0.13±0.03  天然的人TSH 100ng/mL和  10μg/mL 5C9 IgG  0.18±0.05  天然的人TSH 100ng/mL和  100μg/mL 5C9 IgG  0.21±0.10  仅重组体人TSH 100ng/mL  16.72±2.90  重组体人TSH 100ng/mL和  0.001μg/mL 5C9 IgG.  20.0±1.73  重组体人TSH 100ng/mL和  0.01μg/mL 5C9 IgG  20.6±1.57

  重组体人TSH 100ng/mL和  0.1μg/mL 5C9 IgG  7.39±1.74  重组体人TSH 100ng/mL和  1.0μg/mL 5C9 IgG  0.07±0.01  重组体人TSH 100ng/mL和  10μg/mL 5C9 IgG  0.07±0.01  重组体人TSH 100ng/mL和  100μg/mL 5C9 IgG  0.11±0.03  仅天然的猪TSH 0.3ng/mL  40.2±4.0  天然的猪TSH 0.3ng/mL和  0.001μg/mL 5C9 IgG.  32.7±4.0  天然的猪TSH 0.3ng/mL和  0.01μg/mL 5C9 IgG  28.2±2.04  天然的猪TSH 0.3ng/mL和  0.1μg/mL 5C9 IgG  18.0±1.36  天然的猪TSH 0.3ng/mL和  1.0μg/mL 5C9 IgG  2.14±0.85  天然的猪TSH 0.3ng/mL和  10μg/mL 5C9 IgG  0.20±0.14  天然的猪TSH 0.3ng/mL和  0.18±0.13

  100μg/mL 5C9 IgG

实验3

 稀释于环AMP测定缓冲液中的试验样品  表达野生型TSHR的CHO细胞中的  环AMP浓度(pmol/mL平均值±SD；n＝3) 仅缓冲液  2.0±0.8 仅天然的人TSH 100ng/mL  31.1±2.55 天然的人TSH 100ng/mL和 0.001μg/mL 5C9 IgG.  36.0±3.27 天然的人TSH 100ng/mL和 0.01μg/mL 5C9 IgG  28.4±3.55 天然的人TSH 100ng/mL和 0.1μg/mL 5C9 IgG  7.22±3.20 天然的人TSH 100ng/mL和 1.0μg/mL 5C9 IgG  0.67±0.46 天然的人TSH 100ng/mL和 10μg/mL 5C9 IgG  0.8±0.45 天然的人TSH 100ng/mL和 100μg/mL 5C9 IgG  1.35±1.0

  仅重组体人TSH 100ng/mL  26.4±3.53  重组体人TSH 100ng/mL和  0.001μg/mL 5C9 IgG.  25.6±2.45  重组体人TSH 100ng/mL和  0.01μg/mL 5C9 IgG  22.9±7.4  重组体人TSH 100ng/mL和  0.1μg/mL 5C9 IgG  1.18±0.49  重组体人TSH 100ng/mL和  1.0μg/mL 5C9 IgG  0.81±0.05  重组体人TSH 100ng/mL和  10μg/mL 5C9 IgG  0.74±0.42  重组体人TSH 100ng/mL和  100μg/mL 5C9 IgG  0.88±0.55  仅天然的猪TSH 0.3ng/mL  35.7±4.82  天然的猪TSH 0.3ng/L和  0.001μg/mL 5C9 IgG.  38.2±2.54  天然的猪TSH 0.3ng/mL和  0.01μg/mL 5C9 IgG  26.6±3.22  天然的猪TSH 0.3ng/mL和  10.1±1.79

  0.1μg/mL 5C9 IgG  天然的猪TSH 0.3ng/mL和  1.0μg/mL 5C9 IgG  2.28±0.71  天然的猪TSH 0.3ng/mL和  10μg/mL 5C9 IgG  0.68±0.21  天然的猪TSH 0.3ng/mL和  100μg/mL 5C9 IgG  1.03±0.63

表11a

5C9 IgG和9D33 IgG对具有活化突变S281I的TSHR的组成型活性的效应

  稀释于环AMP测定缓冲液中的试验样品  表达TSHR S281I的CHO细胞中的  环AMP浓度(pmol/mL平均值±SD；n＝3)  仅缓冲液  9.90±1.51  0.001μg/mL 2G4 IgG^a  6.83±0.37  0.01μg/mL 2G4 IgG  7.74±0.78  0.1μg/mL 2G4 IgG  8.58±1.12  1μg/mL 2G4 IgG  8.37±1.10  0.001μg/mL 5C9 IgG  4.31±0.16  0.01μg/mL 5C9 IgG  4.17±0.60  0.1μg/mL 5C9 IgG  3.20±0.63  1μg/mL 5C9 IgG  3.44±0.63  0.001μg/mL 9D33 IgG  5.97±0.94  0.01μg/mL 9D33 IgG  9.27±1.4

  0.1μg/mL 9D33 IgG  8.13±0.72  1μg/mL 9D33 IgG  7.33±1.17

^a2G4是一种对照的抗甲状腺过氧化物酶的人单克隆抗体。

表11b

5C9 IgG和9D33IgG对具有活化突变I568T的TSHR的组成型活性的效应

 稀释于环AMP测定缓冲液中的试验样品  表达TSHR I586T的CHO细胞中的  环AMP浓度(pmol/mL平均值±SD；n＝3) 仅缓冲液  21.39±5.31 0.001μg/mL 2G4 IgG  19.13±2.77 0.01μg/mL 2G4 IgG  16.67±1.87 0.1μg/mL 2G4 IgG  19.92±0.91 1μg/mL 2G4 IgG  20.52±0.95 0.001μg/mL 5C9 IgG  18.81±1.39 0.01μg/mL 5C9 IgG  9.24±0.83 0.1μg/mL 5C9 IgG  6.02±1.93 1μg/mL 5C9 IgG  5.29±0.75 0.001μg/mL 9D33 IgG  16.58±0.00 0.01μg/mL RSR-B2 IgG  17.03±2.36

  0.1μg/mL RSR-B2 IgG  19.96±1.66  1μg/mL RSR-B2 IgG  21.65±1.99

表11c

5C9 IgG和9D33 IgG对具有活化突变A623I的TSHR的组成型活性的效应

  稀释于环AMP测定缓冲液中的试验样品  表达TSHR A621I的CHO细胞中的  环AMP浓度(pmol/mL平均值±SD；n＝3)  仅缓冲液  36.89^a  0.001μg/mL 2G4 IgG  28.46±2.31  0.01μg/mL 2G4 IgG  33.44±1.12  0.1μg/mL 2G4 IgG  30.40±7.93  1μg/mL 2G4 IgG  28.96±2.29  0.001μg/mL 5C9 IgG  26.52±1.33  0.01μg/mL 5C9 IgG  27.03±2.13  0.1μg/mL 5C9 IgG  19.79±0.48  1μg/mL 5C9 IgG  16.43±1.27  0.001μg/mL 9D33 IgG  29.55±3.15  0.01μg/mL 9D33 IgG  27.64±3.49  0.1μg/mL 9D33 IgG  31.78±9.18  1μg/mL 9D33 IgG  40.09±7.73

^a两次测定

表12

5C9加9D33在表达野生型TSHR的CHO细胞中对于阻断环AMP产生的pTSH刺激的效应

实验1

  环AMP测定缓冲液中的试验样品环AMP浓度(pmol/mL平均值±SD；n＝3)  仅缓冲液1.9±1.0  TSH 3ng/mL48.5±14  10μg/mL 9D332.9±1.0  10μg/mL 5C90.45±0.31  10μg/mL 9D33+10μg/mL 5C91.12±0.4  10μg/mL 9D33+TSH23.8±8.7  10μg/mL 5C9+TSH3.7±2.7  10μg/mL 9D33+10μg/mL 5C9+TSH4.9(n＝2)  1μg/mL 9D33+TSH28.7±1.8  1μg/mL 5C9+TSH13.9±3.1  1μg/mL 9D33+1μg/mL 5C9+TSH12.6±2.5

实验2

  环AMP测定缓冲液中的试验样品环AMP浓度(pmol/mL平均值±SD；n＝3)  仅缓冲液0.72±0.63  TSH 3ng/mL34.3±3.1

  10μg/mL 9D33  1.6±1.3  10μg/mL 5C9  0.4±0.4  10μg/mL 9D33+10μg/mL 5C9  0.03(n＝1)  10μg/mL 9D33+TSH  9.5±1.7  10μg/mL 5C9+TSH  3.1±1.0  10μg/mL 9D33+10μg/mL 5C9+TSH  3.3±2.0  1μg/mL 9D33+TSH  19.0±3.2  1μg/mL 5C9+TSH  6.1±0.6  1μg/mL 9D33+1μg/mL 5C9+TSH  5.9±0.6

实验3

  环AMP测定缓冲液中的试验样品环AMP浓度(pmol/mL均值±SD；n＝3)  仅缓冲液0.99±0.03  TSH 3ng/mL51.3±5.0  100μg/mL 9D331.14±0.13  100μg/mL 5C90.50±0.04  100μg/mL 9D33+100μg/mL 5C90.66±0.9  100μg/mL 9D33+TSH10.53±0.84  100μg/mL 5C9+TSH1.4±0.18  100μg/L 9D33+100μg/mL 5C9+TSH1.3±0.36  10μg/L 9D33+TSH13.5±2.9  10μg/mL 5C9+TSH1.9±1.1

  10μg/mL 9D33+10μg/mL 5C9+TSH  1.2±0.1  1μg/mL 9D33+TSH  27.8±2.2  1μg/mL 5C9+TSH  5.4±1.8  1μg/mL 9D33+1μg/mL 5C9+TSH  5.2±0.3  0.1μg/mL 9D33+TSH  35.1±2.3  0.1μg/mL 5C9+TSH  18.7±3.4  0.1μg/mL 9D33+0.1μg/mL 5C9+TSH  14.4±1.0  0.01μg/mL 9D33+TSH  47.1±1.9  0.01μg/mL 5C9+TSH  33.9±7.8  0.01μg/mL 9D33+0.01μg/mL 5C9+TSH  27.8±1.3

实验4

  环AMP测定缓冲液中的试验样品  环AMP浓度  (pmol/mL均值±SD；n＝3)  仅缓冲液  1.4±0.5  TSH 0.3ng/mL  46.6±12.9  100μg/mL 9D33  0.99±0.62  100μg/mL 5C9  0.15±0.12  100μg/mL 9D33+100μg/mL 5C9  0.41±0.40  100μg/mL 9D33+TSH  3.53±1.1  100μg/mL 5C9+TSH  0.29±0.15  100μg/mL 9D33+100μg/mL 5C9+TSH  0.63±0.38

  10μg/mL 9D33+TSH  4.23±0.81  10μg/mL 5C9+TSH  0.23±0.08  10μg/mL 9D33+10μg/mL 5C9+TSH  0.52±0.15  1μg/mL 9D33+TSH  9.01±0.67  1μg/mL 5C9+TSH  1.65±0.47  1μg/mL 9D33+1μg/mL 5C9+TSH  1.21±0.67  0.1μg/mL 9D33+TSH  20.2±2.2  0.1μg/mL 5C9+TSH  6.2±1.8  0.1μg/mL 9D33+0.1μg/mL 5C9+TSH  7.6±1.3

实验5

  环AMP测定缓冲液中的试验样品 环AMP浓度 (pmol/mL平均值±SD；n＝3)  仅缓冲液 1.83±0.64  TSH 0.3ng/mL 17.26±1.5  10μg/mL 9D33 2.07±0.52  10μg/mL 5C9 0.38±0.2  10μg/mL 9D33+10μg/mL 5C9 0.96±0.14  10μg/mL9D33+TSH 3.57±0.58  10μg/mL 5C9+TSH 1.17±0.00  10μg/mL 9D33+10μg/mL 5C9+TSH 1.58±0.20  5μg/mL 9D33+TSH 3.71±0.10

  5μg/mL 5C9+TSH  1.21±0.36  1μg/mL 9D33+TSH  6.38±1.35  1μg/mL 5C9+TSH  2.57±0.65  1μg/mL 9D33+1μg/mL 5C9+TSH  1.46±0.59  0.1μg/mL 9D33+TSH  14.67±4.69  0.1μg/mL 5C9+TSH  12.43±1.59  0.1μg/mL 9D33+0.1μg/mL 5C9+TSH  9.99±3.78

表13

5C9加9D33在表达野生型TSHR的CHO细胞中对于阻断由M22 Fab介导的对基础环AMP产生的刺激的效应

实验1

  环AMP测定缓冲液中的试验样品  环AMP浓度(pmol/mL  平均值±SD；n＝3)  仅缓冲液  1.45±0.46  M22 3ng/mL  49.1±9.8  100μg/L 9D33  1.51±0.22  100μg/mL 5C9  0.35±0.30  100μg/mL 9D33+100μg/mL 5C9  1.57±0.13  100μg/mL 9D33+M22  2.13±0.74  100μg/mL 5C9+M22  0.35±0.08  100μg/mL 9D33+100μg/mL 5C9+  M22  0.70±0.40  10μg/mL 9D33+M22  2.5±0.8  10μg/mL 5C9+M22  0.36±0.25  10μg/mL 9D33+10μg/mL 5C9+M22  0.52±0.12  1μg/mL 9D33+M22  5.25±0.55  1μg/mL 5C9+M22  0.93±0.07  1μg/mL 9D33+1μg/mL 5C9+M22  0.69±0.13

  0.1μg/mL 9D33+M22  27.6±2.5  0.1μg/mL 5C9+M22  6.0±2.6  0.1μg/mL 9D33+0.1μg/mL 5C9+  M22  13.7±7.5  0.01μg/mL 9D33+M22  47.5±4.5  0.01μg/mL 5C9+M22  48.1±5.4  0.01μg/mL 9D33+0.01μg/mL 5C9+  M22  47.5±4.5

实验2

  环AMP测定缓冲液中的试验样品  环AMP浓度(pmol/mL  平均值±SD；n＝3)  仅缓冲液  1.69±0.47  M22 3ng/mL  68.3±6.3  100μg/mL 9D33  1.76±0.43  100μg/mL 5C9  0.69±0.18  100μg/mL 9D33+100μg/mL 5C9  1.16±0.35  100μg/mL 9D33+M22  1.42±1.20  100μg/mL 5C9+M22  不可测  100μg/mL 9D33+100μg/mL 5C9+  M22  0.14(n＝2)  10μg/mL 9D33+M22  0.67(n＝2)  10μg/mL 5C9+M22  0.14(n＝1)  10μg/mL 9D33+10μg/mL 5C9+M22  2.41(n＝1)  1μg/mL 9D33+M22  6.03±1.15  1μg/mL 5C9+M22  2.54(n＝1)  1μg/mL 9D33+1μg/mL 5C9+M22  1.51(n＝1)  0.1μg/mL 9D33+M22  38.7±8.1  0.1μg/mL 5C9+M22  4.17±1.7  0.1μg/mL 9D33+0.1μg/mL 5C9+  M22  5.17±2.85

  0.01μg/mL 9D33+M22  60.2±8.0  0.01μg/mL 5C9+M22  57.3±13.7  0.01μg/mL 9D33+0.01μg/mL 5C9±  M22  40.4±5.3  0.001μg/mL 9D33+M22  79.1±26.3  0.001μg/mL 5C9+M22  63.3±19.0  0.001μg/mL 9D33+0.001μg/mL 5C9+  M22  40.2±8.7

实验3

  环AMP测定缓冲液中的试验样品  环AMP浓度(pmol/mL  平均值±SD；n＝3)  仅缓冲液  0.86±0.12  M22 0.3ng/mL  21.8±3.23  100μg/mL 9D33  0.88±0.30  100μg/mL 5C9  0.58±0.28  100μg/mL 9D33+100μg/mL 5C9  0.81±0.36  100μg/mL 9D33+M22  1.03±0.32  100μg/mL 5C9+M22  0.05(n＝2)  100μg/mL 9D33±100μg/mL 5C9+  M22  0.06(n＝2)  10μg/mL 9D33+M22  0.97±0.48  10μg/mL 5C9+M22  0.20(n＝2)  10μg/mL 9D33+10μg/mL 5C9+M22  0.14±0.08  1μg/mL 9D33+M22  0.83±0.21  1μg/mL 5C9+M22  0.02(n＝2)  1μg/mL 9D33+1μg/mL 5C9+M22  0.13±0.13  0.1μg/mL 9D33+M22  5.38±1.71  0.1μg/mL 5C9+M22  1.43±1.09  0.1μg/mL 9D33+0.1μg/mL 5C9+  M22  2.39±1.0

  0.01μg/mL 9D33+M22  15.2±1.42  0.01μg/mL 5C9+M22  13.1±1.34  0.01μg/mL 9D33+0.01μg/mL 5C9+  M22  12.7±3.4  0.001μg/mL 9D33+M22  12.8±1.60  0.001μg/mL 5C9+M22  13.3±0.89  0.001μg/mL 9D33+0.001μg/mL 5C9+  M22  15.8±2.15

实验4

  环AMP测定缓冲液中的试验样品  环AMP浓度(pmol/mL  平均值±SD；n＝3)  仅缓冲液  1.29±0.68  M22 0.3ng/mL  31.1±9.4  100μg/mL 9D33  2.38±1.11  100μg/mL 5C9  0.12±0.09  100μg/mL 9D33+100μg/mL 5C9  0.81±0.15  100μg/mL 9D33+M22  2.00±0.87  100μg/mL 5C9+M22  0.22±0.11  100μg/mL 9D33+100μg/mL 5C9+  M22  0.40±0.18  10μg/mL 9D33+M22  1.25±0.09  10μg/mL 5C9+M22  0.40±0.17  10μg/mL 9D33+10μg/mL 5C9+M22  0.45±0.31  1μg/mL 9D33+M22  2.66±0.64  1μg/mL 5C9+M22  0.21±0.18  1μg/mL 9D33+1μg/mL 5C9+M22  0.14±0.07  0.1μg/mL 9D33+M22  27.6±2.5  0.1μg/mL 5C9+M22  6.0±2.6  0.1μg/mL 9D33+0.1μg/mL 5C9+M22  7.2±3.9  0.01μg/mL 9D33+M22  38.9±6.4  0.01μg/mL 5C9+M22  31.5±4.0

  0.01μg/mL 9D33+0.01μg/mL 5C9+  M22  20.6±5.3  0.001μg/mL 9D33+M22  43.2±7.9  0.001μg/mL 5C9+M22  33.1±4.0  0.001μg/mL 9D33+0.001μg/mL 5C9+  M22  25.3±6.0

表14

5C9和9D33 IgG在表达野生型TSHR的CHO细胞(每个细胞大约5×10⁵个受体)中对基础环AMP产生的效应

实验1

  试验样品环AMP浓度Pmol/mL(平均值±SD；n＝3) 基础环AMP产生量的抑制％  仅环AMP测定缓冲液47.1±11.7 0  3ng/mL TSH152.0±28.2 -ve  5B3^a IgG 100μg/mL44.5±5.2 5.3  5B3^a IgG 10μg/mL45.4±6.3 3.4  5B3^a IgG 1μg/mL52.0±12.1 -ve  9D33 IgG 100μg/mL74.2±7.2 -ve  9D33 IgG 10μg/mL56.5±4.0 -ve

  9D33 IgG 1μg/mL  65.8±9.8  -ve  9D33 IgG 0.1μg/mL  61.7±13.3  -ve  9D33 IgG 0.01μg/mL  52.0±5.1  -ve  9D33 IgG 0.001μg/mL  61.6±3.8  -ve

在不表达TSHR的对照CHO细胞中，在存在环AMP测定缓冲液的情况下基础环AMP产生量为1.02±0.06pmol/mL(平均值±SD；n＝3)，且在存在3ng/mL的TSH的情况下为0.74±0.32pmol/mL(平均值±SD；n＝3)。

-ve＝阴性，即不抑制环AMP产生。

^a5B3是一种抗谷氨酸脱羧酶(GAD)的人单克隆抗体(5C9的阴性对照)。

实验2

  试验样品  环AMP浓度pmol/mL  (平均值±SD；n＝3) 基础环AMP产生量的抑制％  仅环AMP测定缓冲液  58.0±15.2 0  3ng/mL TSH  156.5±22.2 -ve  5B3^a IgG 100μg/mL  52.7±7.8 9.1  5B3^a IgG 10μg/mL  43.7±10.4 24.7  5B3^a IgG 1μg/mL  55.9±12.2 3.7  5C9 IgG 100μg/mL  26.2±2.7 54.9  5C9 IgG 10μg/mL  14.7±1.7 74.6  5C9 IgG 1μg/mL  16.8±4.2 71.0  5C9 IgG 0.1μg/mL  31.5±8.8 45.7  5C9 IgG 0.01μg/mL  36.4±4.5 37.2

  5C9 IgG 0.001μg/mL  51.7±9.8  10.8

在不表达TSHR的对照CHO细胞中，在存在环AMP测定缓冲液的情况下基础环AMP产生量为0.03pmol/mL(n＝2)，且在存在3ng/mL的TSH的情况下为0.40±0.09pmol/mL(平均值±SD；n＝3)。

-ve＝阴性，即不抑制环AMP产生。

^a5B3是一种抗谷氨酸脱羧酶(GAD)的人单克隆抗体(5C9的阴性对照)。

实验3

5C9 Fab和F(ab′)在表达野生型TSHR的CHO细胞中对基础环AMP产生的效应

  环AMP测定缓冲液中的  试验样品  环AMP浓度pmol/mL  (平均值±SD；n＝3) 基础环AMP产生量的抑制％  仅环AMP测定缓冲液  59.4±8.6 0  9D33 IgG 100μg/mL  67.8±1.0 -ve  9D33 IgG 10μg/mL  79.4±9.8 -ve  9D33 IgG 1μg/mL  71.5±8.8 -ve  9D33 IgG 0.1μg/mL  75.6±8.9 -ve  9D33 IgG 0.01μg/mL  60.5±7.5 -ve  9D33 IgG 0.001μg/mL  52.3±6.3 12  5C9 IgG 100μg/mL  26.2±1.8 56  5C9 IgG 10μg/mL  24.5±5.8 59

  5C9 IgG 1μg/mL  22.9±2.1  61  5C9 IgG 0.1μg/mL  59.1±2.6  1  5C9 IgG 0.01μg/mL  64.3±8.4  -ve  5C9 IgG 0.001μg/mL  67.3±9.8  -ve  5C9 Fab 100μg/mL  23.3±2.3  61  5C9 Fab 10μg/mL  32.1±4.8  46  5C9 Fab 1μg/mL  36.4±1.5  39  5C9 Fab 0.1μg/mL  52.8±1.9  11  5C9 Fab 0.01μg/mL  61.1±2.4  -ve  5C9 Fab 0.001μg/mL  62.5±7.3  -ve  5C9 F(ab′)100μg/mL  30.9±2.6  48  5C9 F(ab′)10μg/mL  36.5±3.4  39  5C9 F(ab′)1μg/mL  45.9±4.5  23

  5C9 F(ab′)0.1μg/mL  48.2±3.1  19  5C9 F(ab′)0.01μg/mL  62.3±5.7  -ve  5C9 F(ab′)0.001μg/mL  57.9±9.1  3

在不表达TSHR的对照CHO细胞中，在存在环AMP测定缓冲液的情况下基础环AMP产生量为0.03pmol/mL(n＝2)，且在存在3ng/mL的TSH的情况下为0.40±0.09pmol/mL(平均值±SD；n＝3)。

-ve＝阴性，即不抑制环AMP产生。

F(ab′)是通过还原F(ab′)₂进行制备的；详见正文。

表15

具有拮抗剂活性的患者血清TSHR自身抗体(B2-B5)在表达TSHR I568T活性突变的CHO细胞中对基础环AMP水平的效应

实验1

  试验样品和血清稀释度  环AMP浓度pmol/mL  (平均值±SD；n＝3) 基础环AMP产生量的抑制％  仅环AMP测定缓冲液  20.5±8.7 0  HBD混合物/10  19.5±3.4 5  HBD混合物/50  25.7±2.8 -ve  N1/10  20.7±5.5 -ve  N1/50  18.5±1.5 10  N2/10  23.3±1.7 -ve  N2/50  17.6±1.8 14  N3/10  20.3±2.4 1  N3/50  23.6±5.9 -ve  B2/10  5.3±1.3 74

  B2/50  9.6±2.8  53  B3/10  8.3±3.1  60  B3/50  10.5±2.5  49  B4/10  2.2±0.5  89  B4/50  3.0±0.3  86  B5/10  15.9±3.3  23  B5/50  14.5±1.3  29

实验2

  试验样品和血清稀释度  环AMP浓度pmol/mL  (平均值±SD；n＝3) 基础环AMP产生量的抑制％  仅环AMP测定缓冲液  19.7±3.7 0  HBD混合物/10  28.0±1.6 -ve  HBD混合物/50  18.1±3.9 8  HBD混合物/100  18.0±1.6 9  HBD混合物/500  17.8±1.3 10  HBD混合物/1000  20.7±2.9 -ve  HBD混合物/5000  15.6±2.1 20  B3/10  14.7±2.2 25  B3/50  13.7±1.3 31  B3/100  12.6±0.6 36  B3/500  19.0±0.8 4  B3/1000  18.4±4.6 7

  B3/5000  17.6±0.9  11  B4/10  4.0±0.5  80  B4/50  3.6±0.8  81  B4/100  3.8±1.1  81  B4/500  7.2±2.6  64  B4/1000  12.0±0.6  39  B4/5000  17.7±2.7  10

-ve＝阴性，即不抑制环AMP产生。

HBD混合物＝健康捐血者血清的混合物

N1-N3＝个体的健康捐血者血清

所有血清都稀释于环AMP测定缓冲液中。

表16

具有拮抗剂活性的患者血清TSHR自身抗体(B2-B5)在表达TSHR S281I活性突变的CHO细胞中对基础环AMP水平的效应

  试验样品和血清稀释度  环AMP浓度  pmol/mL(平均值±SD；  n＝3) 基础环AMP产量的抑制％  仅环AMP测定缓冲液  11.2±2.0 0  HBD/10  12.1±0.6 -8  HBD/50  10.0±2.0 11  N1/10  8.0±1.6 28  N1/50  10.8±3.3 4  N2/10  8.8±1.4 21  N2/50  8.8±2.3 22  N3/10  10.0±0.8 17  N3/50  9.3±1.7 17  B2/10  7.7±039 31

  B2/50  5.7±1.3  49  B3/10  5.4±0.5  52  B3/50  6.6±1.1  41  B4/10  5.4±1.1  52  B4/50  4.9±0.7  56  B5/10  9.1±2.5  18  B5/50  7.6±0.8  32

参见表15的说明性脚注。

在用TSHR S281I的实验中，1μg/mL的5C9IgG引起对基础环AMP活性的71％抑制。

表17

具有拮抗剂活性的患者血清TSHR自身抗体(B2-B5)在表达TSHR A623I活性突变的CHO细胞中对基础环AMP水平的效应

  试验样品和血清稀释度环AMP浓度pmol/mL(平均值±SD；n＝3) 基础环AMP产生量的抑制％  仅环AMP测定缓冲液43.5±11.2 0  HBD混合物/1034.7±4.5 20  HBD混合物/5049.9±5.7 -15  N1/1032.1±2.5 26  N1/5043.9±12.0 -1  N2/1051.1±8.4 -17  N2/5032.6±2.1 26  N3/1047.2±7.1 -10  N3/5057.3±16.5 -32  B2/1028.8±1.1 34

  B2/50  43.9±2.7  -1  B3/10  33.5±3.5  23  B3/50  44.2±12.7  -1  B4/10  27.2±6.6  37  B4/50  23.9±1.0  45  B5/10  19.2±6.3  56  B5/50  40.6±10.9  7

参见表15的说明性脚注。

在用TSHR A623I的实验中，1μg/mL的5C9IgG引起对基础环AMP活性的49％抑制。

表18

具有拮抗剂活性的患者血清TSHR自身抗体(B2-B5)在表达野生型TSHR的CHO细胞(每个细胞大约5×10⁵个受体)中对基础环AMP水平的效应

  试验样品和血清稀释度  环AMP浓度  pmol/mL(平均值±SD；  n＝3) 基础环AMP产生量的变化 (％)  仅环AMP测定缓冲液  28.1±0.7 100  HBD/10  37.5±6.9 133  HBD/50  37.2±2.4 132  N1/10  27.7±5.7 99  N1/50  26.0±4.8 93  N2/10  41.0±2.7 146  N2/50  27.0±1.2 96  N3/10  34.3±2.7 122  N3/50  38.5±7.8 137  B2/10  39.7±1.7 141  B2/50  41.4±3.8 147

  B3/10  74.0±11.2  263  B3/50  46.5±8.7  165  B4/10  8.7±0.3  31  B4/50  17.2±1.9  61  B5/10  54.2±6.0  193  B5/50  48.0±10.5  171

在存在1μg/mL的5C9 IgG的情况下，基础环AMP水平降低至在存在环AMP测定缓冲液的情况下的水平的33％。

表20a

5C9 IgG在表达野生型TSHR和Asp43突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中对pTSH刺激的环AMP产生的效应

¹两次测定的平均值

²单次测定

pTSH浓度＝3ng/mL

所有稀释都是在环AMP测定缓冲液中

^a5B3是一种抗谷氨酸脱羧酶(GAD)的人单克隆抗体(5C9的阴性对照)。

表20b

5C9IgG在表达野生型TSHR和Glu61突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中对pTSH刺激的环AMP产生的效应

参见表20a的说明性脚注。

表20c

5C9 IgG在表达野生型TSHR和His105突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中对pTSH刺激的环AMP产生的效应

参见表20a的说明性脚注。

表20d

5C9 IgG在表达野生型TSHR和Glu107突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中对pTSH刺激的环AMP产生的效应

实验1

参见表20a的说明性脚注。

实验2

参见表20a的说明性脚注。

表20e

5C9 IgG在表达野生型TSHR和Phe130突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中对pTSH刺激的环AMP产生的效应

参见表20a的说明性脚注。

表20f

5C9 IgG在表达野生型TSHR和Glu178突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中对pTSH刺激的环AMP产生的效应

参见表20a的说明性脚注。

表20g

5C9 IgG在表达野生型TSHR和Tyr185突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中对pTSH刺激的环AMP产生的效应

UD＝低于测定检测的限值。

参见表20a的说明性脚注。

表20h

5C9 IgG在表达野生型TSHR和Asp203突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中对pTSH刺激的环AMP产生的效应

参见表20a的说明性脚注。

表20i

5C9 IgG在表达野生型TSHR和Tyr206突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中对pTSH刺激的环AMP产生的效应

参见表20a的说明性脚注。

表20j

5C9 IgG在表达野生型TSHR和Lys209突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中对pTSH刺激的环AMP产生的效应

参见表20a的说明性脚注。

表20k

5C9 IgG在表达野生型TSHR和Asp232突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中对pTSH刺激的环AMP产生的效应

参见表20a的说明性脚注。

表20l

5C9 IgG在表达野生型TSHR和Lys250突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中对pTSH刺激的环AMP产生的效应

参见表20a的说明性脚注。

表20m

5C9 IgG在表达野生型TSHR和Glu251突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中对pTSH刺激的环AMP产生的效应

参见表20a的说明性脚注。

表20n

5C9 IgG在表达野生型TSHR和Thr257突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中对pTSH刺激的环AMP产生的效应

参见表20a的说明性脚注。

表20o

5C9 IgG在表达野生型TSHR和Arg274突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中对pTSH刺激的环AMP产生的效应

参见表20a的说明性脚注。

表20p

5C9 IgG在表达野生型TSHR和Asp276突变成丙氨酸的TSHR的CHO细胞中对pTSH刺激的环AMP产生的效应

实验1

参见表20a的说明性脚注。

实验2

参见表20a的说明性脚注。

表22

TSHR突变(相对于野生型)在TSHR转染的CHO细胞中对以下方面的效应的总结：5C9 IgG和9D33 IgG阻断TSH对环AMP产生的刺激的能力

  TSHR突变 pTSH对环AMP 产生的刺激( 相对于野生型) 5c9 IgG对于TSH对 环AMP产生的刺激的 阻断(相对于 野生型) 9D33 IgG对于TSH对 环AMP产生的刺激的 阻断(相对于 野生型)  野生型 +++++ +++++ +++++  Asp 43 Ala +++ +++++ +++++  Lys 58 Ala +++++ +++++ 0  Ile 60 Ala +++++ +++++ +++++  Glu 61 Ala ++++ +++++ +++++  Arg 80 Ala +++++ +++++ 0  Tyr 82 Ala +++++ +++++ 0  Thr 104 Ala +++++ +++++ NT  His 105 Ala +++++ +++++ NT  Glu 107 Ala +++ +++++ +++++  Arg 109 Ala +++++ +++++ 0  Lys 129 Ala +++++ 0 0  Phe 130 Ala +++++ +++ +++++  Phe 134 Ala +++++ +++++ ++  Asp 151 Ala +++++ ++++ NT  Glu 178 Ala ++++ +++ ++++  Lys 183 Ala +++++ + +++++  Tyr 185 Ala ++++ +++++ +++++  Asp 203 Ala ++++ 0 +++++  Tyr 206 Ala ++++ +++ +++++  Lys 209 Ala ++++ +++++++ +++++  Asp 232 Ala +++ +++++ +++++  Gln 235 Ala +++++ +++++ +++++

  Lys 250 Ala  +++++  ++++  ++++  Glu 251 Ala  +++++  +++  +++++  Arg 255 Ala  +++++  +++++  +++++  Thr 257 Ala  +++++  +++++  +++++  Trp 258 Ala  +++++  +++++  +++++  Arg 274 Ala  +++++  +++++++  +++++++  Asp 276 Ala  +++++  ++++  +++++  Ser 281 Ala  ++++  +++++  ++++  Arg 80 Asp  ++++  +++++  0  Asp 151 Arg  +++++  +++++  NT  Lys 183 Asp  +++  +  +++++  Arg 255 Asp  +++++  +++++  +++++++  Asp 160 Lys  0  +++++^a  NT

所使用的pTSH浓度＝3ng/mL。

TSHR突变的相对效应表示为使用野生型所观察到的百分数，如下：-+++++＝100％的野生型活性；++++＝＜100-80％的野生型活性；+++＝＜80-60％的野生型活性；++＝＜60-40％的野生型活性；+＝＜40-20％的野生型活性；0＝＜20％的野生型活性，以及相对于野生型的升高活性：＞100％＝+++++++。NT＝未试验。

^a由于对TSH无应答，使用M22测验该实验中对环AMP的刺激(详见正文)。

表22

TSHR Asp203Ala突变对以下方面的效应：具有拮抗剂活性的患者血清TSHR自身抗体(B2-B5)阻断由TSH对环AMP产生的刺激的能力

  试验样品和  血清稀释度^a野生型TSHR环AMP浓度fmol/细胞孔。平均值±SD；n＝3  野生型TSHR  对TSH刺激的  环AMP水平的  抑制％^b  TSHR Asp203Ala  环AMP浓度  fmol/细胞孔。  平均值±SD；n＝3  TSHR Asp203Ala  对TSH刺激的  环AMP水平的  抑制％^b  环AMP测定缓冲液242±130  292±89  TSH^c9357±1155  7591±832  TSH^c+1μg/mL  5C91110±811  92  9400¹  4  HBD混合物/10183±67  496±76  TSH^c+HBD  pool/1013303±1819  0  9756¹  0  B2/10110±36  270±72  TSH^c+B2/10454±381  97  1963±357  80  B3/10329¹  582±74  TSH^c+B3/103407±1341  74  4027±278  59  B4/1059±22  161±36  TSH^c+B4/10278±73  98  150±41  98  B5/10647±170  1064±228  TSH^c+B5/104173±515  69  6871±618  30

^a稀释于环AMP测定缓冲液中。

^b对TSH诱导的环AMP刺激的抑制％

¹双份样品的平均值

^cpTSH以3ng/mL的终浓度使用。

HBD混合物＝健康捐血者血清的混合物。

序列表

<110>RSR有限公司

<120>用作拮抗剂的抗促甲状腺激素受体的人单克隆抗体

<130>P108503PCT

<150>GB 0702990.3

<151>2007-02-15

<150>GB 0714036.1

<151>2007-07-18

<160>11

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>5

<212>PRT

<213>人

<400>1

Ser Asn Tyr Met Ser

1               5

<210>2

<211>16

<212>PRT

<213>人

<400>2

Val Thr Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

1               5                   10                  15

<210>3

<211>18

<212>PRT

<213>人

<400>3

Gly Gly Arg Tyr Cys Ser Ser Ile Ser Cys Tyr Ala Arg Ser Gly Cys

1               5                   10                  15

Asp Tyr

<210>4

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>4

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr Leu Asn

1               5                   10

<210>5

<211>7

<212>PRT

<213>人

<400>5

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1               5

<210>6

<211>10

<212>PRT

<213>人

<400>6

Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Ser Thr Thr

1               5                   10

<210>7

<211>699

<212>DNA

<213>人

<400>7

gaagtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ctgatccagc ctggggggtc cctgagactc     60

tcctgtgcag cctctgggtt caccgtcagt agcaactaca tgagctgggt ccgccaggct    120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt acttatagcg gtggtagcac atcctacgca    180

gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctt    240

caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag aggggggcga    300

tattgtagta gtataagctg ctacgcgagg agcgggtgtg actactgggg ccagggaacc    360

ctggtcaccg tctcctcagc ctccaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc    420

tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc    480

gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg    540

gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc    600

agcttgggca cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg    660

gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac aaaactagt                           699

<210>8

<211>617

<212>DNA

<213>人

<400>8

gccatccaga tgacccagtc tccttcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc     60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc aactatttaa attggtatca gcagaaacca    120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca    180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct    240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagtt ccccctccac cacttttggc    300

caggggacca agctggagat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg    360

ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc    420

tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc    480

caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg    540

acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag    600

ggcctgagct cgcccgt                                                   617

<210>9

<211>233

<212>PRT

<213>人

<400>9

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn

            20                  25                  30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ser Val Thr Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

    50                  55                  60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65                  70                  75                  80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

                85                  90                  95

Arg Gly Gly Arg Tyr Cys Ser Ser Ile Ser Cys Tyr Ala Arg Ser Gly

            100                 105                 110

Cys Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

        115                 120                 125

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

    130                 135                 140

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

145                 150                 155                 160

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

                165                 170                 175

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

            180                 185                 190

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

        195                 200                 205

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val

    210                 215                 220

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Ser

225                 230

<210>10

<211>205

<212>PRT

<213>人

<400>10

Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr

            20                  25                  30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Ser

                85                  90                  95

Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

            100                 105                 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

        115                 120                 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

    130                 135                 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145                 150                 155                 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

                165                 170                 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

            180                 185                 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

        195                 200                 205

<210>11

<211>764

<212>PRT

<213>人

<400>11

Met Arg Pro Ala Asp Leu Leu Gln Leu Val Leu Leu Leu Asp Leu Pro

1               5                   10                  15

Arg Asp Leu Gly Gly Met Gly Cys Ser Ser Pro Pro Cys Glu Cys His

            20                  25                  30

Gln Glu Glu Asp Phe Arg Val Thr Cys Lys Asp Ile Gln Arg Ile Pro

        35                  40                  45

Ser Leu Pro Pro Ser Thr Gln Thr Leu Lys Leu Ile Glu Thr His Leu

    50                  55                  60

Arg Thr Ile Pro Ser His Ala Phe Ser Asn Leu Pro Asn Ile Ser Arg

65                  70                  75                  80

Ile Tyr Val Ser Ile Asp Val Thr Leu Gln Gln Leu Glu Ser His Ser

                85                  90                  95

Phe Tyr Asn Leu Ser Lys Val Thr His Ile Glu Ile Arg Asn Thr Arg

            100                 105                 110

Asn Leu Thr Tyr Ile Asp Pro Asp Ala Leu Lys Glu Leu Pro Leu Leu

        115                 120                 125

Lys Phe Leu Gly Ile Phe Asn Thr Gly Leu Lys Met Phe Pro Asp Leu

    130                 135                 140

Thr Lys Val Tyr Ser Thr Asp Ile Phe Phe Ile Leu Glu Ile Thr Asp

145                 150                 155                 160

Asn Pro Tyr Met Thr Ser Ile Pro Val Asn Ala Phe Gln Gly Leu Cys

                165                 170                 175

Asn Glu Thr Leu Thr Leu Lys Leu Tyr Asn Asn Gly Phe Thr Ser Val

            180                 185                 190

Gln Gly Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Lys Leu Asp Ala Val Tyr Leu Asn

        195                 200                 205

Lys Asn Lys Tyr Leu Thr Val Ile Asp Lys Asp Ala Phe Gly Gly Val

    210                 215                 220

Tyr Ser Gly Pro Ser Leu Leu Asp Val Ser Gln Thr Ser Val Thr Ala

225                 230                 235                 240

Leu Pro Ser Lys Gly Leu Glu His Leu Lys Glu Leu Ile Ala Arg Asn

                245                 250                 255

Thr Trp Thr Leu Lys Lys Leu Pro Leu Ser Leu Ser Phe Leu His Leu

            260                 265                 270

Thr Arg Ala Asp Leu Ser Tyr Pro Ser His Cys Cys Ala Phe Lys Asn

        275                 280                 285

Gln Lys Lys Ile Arg Gly Ile Leu Glu Ser Leu Met Cys Asn Glu Ser

    290                 295                 300

Ser Met Gln Ser Leu Arg Gln Arg Lys Ser Val Asn Ala Leu Asn Ser

305                 310                 315                 320

Pro Leu His Gln Glu Tyr Glu Glu Asn Leu Gly Asp Ser Ile Val Gly

                325                 330                 335

Tyr Lys Glu Lys Ser Lys Phe Gln Asp Thr His Asn Asn Ala His Tyr

            340                 345                 350

Tyr Val Phe Phe Glu Glu Gln Glu Asp Glu Ile Ile Gly Phe Gly Gln

        355                 360                 365

Glu Leu Lys Asn Pro Gln Glu Glu Thr Leu Gln Ala Phe Asp Ser His

    370                 375                 380

Tyr Asp Tyr Thr Ile Cys Gly Asp Ser Glu Asp Met Val Cys Thr Pro

385                 390                 395                 400

Lys Ser Asp Glu Phe Asn Pro Cys Glu Asp Ile Met Gly Tyr Lys Phe

                405                 410                 415

Leu Arg Ile Val Val Trp Phe Val Ser Leu Leu Ala Leu Leu Gly Asn

            420                 425                 430

Val Phe Val Leu Leu Ile Leu Leu Thr Ser His Tyr Lys Leu Asn Val

        435                 440                 445

Pro Arg Phe Leu Met Cys Asn Leu Ala Phe Ala Asp Phe Cys Met Gly

    450                 455                 460

Met Tyr Leu Leu Leu Ile Ala Ser Val Asp Leu Tyr Thr His Ser Glu

465                 470                 475                 480

Tyr Tyr Asn His Ala Ile Asp Trp Gln Thr Gly Pro Gly Cys Asn Thr

                485                 490                 495

Ala Gly Phe Phe Thr Val Phe Ala Ser Glu Leu Ser Val Tyr Thr Leu

            500                 505                 510

Thr Val Ile Thr Leu Glu Arg Trp Tyr Ala Ile Thr Phe Ala Met Arg

        515                 520                 525

Leu Asp Arg Lys Ile Arg Leu Arg His Ala Cys Ala Ile Met Val Gly

    530                 535                 540 

Gly Trp Val Cys Cys Phe Leu Leu Ala Leu Leu Pro Leu Val Gly Ile

545                 550                 555                 560

Ser Ser Tyr Ala Lys Val Ser Ile Cys Leu Pro Met Asp Thr Glu Thr

                565                 570                 575

Pro Leu Ala Leu Ala Tyr Ile Val Phe Val Leu Thr Leu Asn Ile Val

            580                 585                 590

Ala Phe Val Ile Val Cys Cys Cys Tyr Val Lys Ile Tyr Ile Thr Val

        595                 600                 605

Arg Asn Pro Gln Tyr Asn Pro Gly Asp Lys Asp Thr Lys Ile Ala Lys

    610                 615                 620

Arg Met Ala Val Leu Ile Phe Thr Asp Phe Ile Cys Met Ala Pro Ile

625                 630                 635                 640

Ser Phe Tyr Ala Leu Ser Ala Ile Leu Asn Lys Pro Leu Ile Thr Val

                645                 650                 655

Ser Asn Ser Lys Ile Leu Leu Val Leu Phe Tyr Pro Leu Asn Ser Cys

            660                 665                 670

Ala Asn Pro Phe Leu Tyr Ala Ile Phe Thr Lys Ala Phe Gln Arg Asp

        675                 680                 685

Val Phe Ile Leu Leu Ser Lys Phe Gly Ile Cys Lys Arg Gln Ala Gln

    690                 695                 700

Ala Tyr Arg Gly Gln Arg Val Pro Pro Lys Asn Ser Thr Asp Ile Gln

705                 710                 715                 720

Val Gln Lys Val Thr His Asp Met Arg Gln Gly Leu His Asn Met Glu

                725                 730                 735

Asp Val Tyr Glu Leu Ile Glu Asn Ser His Leu Thr Pro Lys Lys Gln

            740                 745                 750

Gly Gln Ile Ser Glu Glu Tyr Met Gln Thr Val Leu

        755                 760